CC BY
100
8. Han H.J., Choi S.B., Kim W.B., Choi S.Y. Single-incision multiport laparoscopic cholecystectomy: things to overcome // Arch. Surg. - 2011. - Vol. 146, Issue 1. - P. 68-73.
9. Kaushik R. Bleeding complications in laparoscopic cholecystectomy: Incidence, mechanisms, prevention and management // J. Minim. Access. Surg. - 2010. - Vol. 6, Issue 3. - P. 59-65.
УДК 616.33-002.44+615.33
АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ H. PYLORI: РЕЗУЛЬТАТЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО РЕГИОНАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
Н. Н. Дехнич1, Е. А. Костякова1, А. А. Пунин1, А. В. Алимов2, Н. В. Иванчик3, Р. С. Козлов3
1ГОУ ВПО СГМА Росздрава, кафедра факультетской терапии 2МЛПУ клиническая больница № 1 г. Смоленска 3ГОУ ВПО СГМА Росздрава, НИИ антимикробной химиотерапии
Резюме
В исследование было включено 210 взрослых пациентов с H. pylori-ассоциированными заболеваниями с положительным быстрым уреазным тестом в 2009-2010 гг в г Смоленске. Н. pylori был выделен у 64% (n=135) пациентов. Предшествующий прием антибактериальных лекарственных средств снижал частоту выделения Н. pylori. Определялась чувствительность H. pylori к амоксициллину, эритромицину, левофлоксацину, ципрофлоксацину, тетрациклину и метронидазолу методом разведения в агаре. Из 133 штаммов H. pylori к одному антимикробному препарату были резистентны 24 изолята (18%), к двум и более препаратам - 4 штамма (3%). Частота резистентности Н. pylori к макролидам составила 7,6% (n=10), к метронидазолу -3,8% (n=5). Не выявлено резистентных штаммов Н. pylori к амоксициллину и тетрациклину. Уровень резистентности Н. pylori к ципрофлоксацину составил 12,8% (n=17), к левофлоксацину - 8,3% (n=11).
Ключевые слова: Helicobacter pylori, антибиотикорезистентность, макролиды, метронидазол, амоксициллин.
H. PYLORI ANTIBIOTIC RESISTANCE: RESULTS OF MICROBIOLOGICAL LOCAL STUDY
N. N. Dekhnich, T. A. Kostyakova, A. A. Punin, A. V. Alimov, N. V. Ivanchik, R. S. Kozlov
Summary
210 adult patients with H. pylori-associated diseases with quick positive urease test were investigated. Н. pylori was secured in 64% patients. Н. pylori sensitivity to different antibiotics by the dilution in agar was determined. It was found resistance of 24 Н. pylori isolates to one antibiotic, 4 strains - to two and more drugs. Resistance rate to macrolids was 7,6%, to metronidazol - 3,8%. The resistant strains to amoxycilline and tetracycline were not revealed. Resistance rate to ciprofloxacin was 12,8%, to levofloxacin - 8,3%.
Keywords: Helicobacter pylori, antibiotics resistance, macrolides, metronidazol, amoxycilline.
Знаете ли вы уровень антибиотикорезистентности H. pylori в своем регионе? Скорее нет, так как микробиологическое выделение H. pylori с определением чувствительности к антимикробным препаратам на сегодняшний день является малодоступным методом диагностики в широкой клинической практике, что связано с особенностями возбудителя. Встречаемость устойчивости H. pylori к антибактериальным лекарственным средствам, используемым в лечении H. pylori-ассоциированных заболеваний, имеет решающее значение в выборе терапии. Необходимость коррекции лечения на основе локальной картины антибиотикорезистентности подчеркивается в Маастрихтском консенсусе III, который является основополагающим международным руководством по диагностике и лечению H. pylori-инфекции. Рекомендуется терапия первой линии - ИПП + кларитромицин + амоксициллин или метро-нидазол, если первичная резистентность к кларитромицину в регионе менее 15-20%, к метронидазолу менее 40% [7].
В настоящее время установлена возможность развития резистентности H. pylori ко всем группам антибактериальных препаратов, что снижает эффективность терапии. Так, при лечении язвенной болезни, вызванной чувствительными к кларитромицину штаммами H. pylori, эрадикацию наблюдали у 80-90% пациентов, а при лечении инфекций, вызванных устойчивыми штаммами, частота эрадикации снижалась до 20-30% [6]. Частота распространения среди населения устойчивых к макролидам штаммов H. pylori варьирует в различных регионах в достаточно широких пределах. Наибольшую частоту наблюдают в развивающихся странах - 20-40%. В странах Европы этот показатель в среднем составлял 9,9% со значительными различиями между Северной Европой
(9,3%) и Южной Европой (18%) [3]. Самый низкий уровень резистентности H. pylori к макролидам отмечен в Великобритании (1,3%), а самый высокий в Италии (27,2%). По данным мониторинга антибиотикорезистентности, в США с 1998 по 2002 г отмечался рост резистентности H. pylori к кларитромицину до 10-14% [10].
К сожалению, данные по антибиотикорезистентности H. pylori к макролидам в России ограничены. Так, по данным Л. В. Кудрявцевой [2], в 1996 г в г Москве резистентных штаммов H. pylori к кларитромицину не было выявлено. В 1999 г. уровень резистентности H. pylori к кларитромицину составил 17,1%, в 2000 г. - 16,6%, в 2001 г. - 13,8%. В Казани в 2007 г. резистентные штаммы H. pylori к кла-ритромицину определялись в 15% случаев [1]. Небольшое количество протестированных штаммов H. pylori и ограниченная география исследования не позволяют сделать однозначные выводы о состоянии резистентности H. pylori к макролидам в России.
Многоцентровые исследования Европейской группы по изучению H. pylori показали, что средний уровень резистентности H. pylori к нитроимидазолам составлял 33,1%, с незначительными колебаниями на Севере и на Юге. Самый низкий уровень резистентности H. pylori к нитроимидазолам был отмечен в Бельгии - 18,9%, а самый высокий в Финляндии - 61,6% [4]. В Италии устойчивых к нитроимидазолам штаммов H. pylori выявлено 14,9%, в то время как в Бразилии - более 70%, а в Японии 9-12% [9]. В США частота встречаемости резистентных штаммов H. pylori к метронидазолу колеблется от 20 до 40% [8]. В Москве на протяжении 1996-2001 гг. отмечалось увеличение уровня резистентности H. pylori к
метронидазолу от 5,9 до 55,5% [2], что значительно снижало эффективность эрадикационных схем. Кроме того, частое потребление метронидазола в популяции повышает риск развития резистентных штаммов H. pylori. При этом уровень вторичной резистентности H. pylori к метронидазолу достигает 75% [5].
В качестве альтернативного препарата, при высоком уровне резистентности H. pylori к макролидам и нитроимидазо-лам, Европейской группой по изучению H. pylori рекомендуется использование схем на основе левофлоксацина. Однако имеются сообщения, указывающие на рост резистентности H. pylori к данному препарату в последние годы за счет большого потребления фторхинолонов. Так, уже в 1999 г. в Португалии зарегистрирован уровень H. pylori к левофлок-сацину - 20%. Уровень вторичной резистентности H. pylori к левофлоксацину в Германии составил 9% [5].
Устойчивость H. pylori к амоксициллину на настоящий момент относительно низкая (<1%). При проведении многоцентрового исследования антибиотикорезистентности H. pylori в Европе штаммы, устойчивые к данному препарату, были зарегистрированы только в Италии, Германии и Великобритании с частотой 8,2%, 4,0% и 1,2% соответственно [4].
Цель исследования: создание рекомендаций по эмпирическому лечению H. pylori-ассоциированных заболеваний на основе локальной картины антибиотикорезистентности.
Материалы и методы
В настоящее проспективное исследование включали амбулаторных и госпитализированных пациентов обоего пола с H. pylori-ассоциированными заболеваниями с положительным быстрым уреазным тестом при проведении эзофагога-стродуоденоскопии.
В ходе исследования каждый пациент осматривался врачом, собирались анамнестические данные, позволяющие определить нозологическую форму, характеристику предшествующей антибиотикотерапии.
Материалом для исследования явились гастробиоптаты пациентов с положительным быстрым уреазным тестом с использованием ХЕЛПИЛ-теста (Ассоциация медицины и аналитики, Санкт-Петербург). В ходе эндоскопического исследования осуществляли забор двух биопсийных образцов из антрального отдела желудка и двух из тела желудка для бактериологического исследования.
Четыре биоптата от каждого пациента немедленно помещались в транспортную среду. В случае если время от взятия материала до доставки в микробиологическую лабораторию не превышало 6 ч, использовался фосфатный буфер (Sigma, США). Если доставка образцов осуществлялась в течение 6-48 ч, в качестве транспортной среды использовался Portagerm pylori (ВюМепеих, Франция).
Перед посевом биопсийный материал гомогенизировался в пробирке Эппендорфа с 0,5 мл стерильного физиологического раствора при помощи стерильной микробиологической петли в течение 1 мин. Затем по две капли гомогенизированного раствора помещали на поверхности чашек с питательными средами: селективную (Pylori agar, ВюМепеих, Франция) и неселективную (кровяной агар: основа агар Мюллера Хинтон, BBL, США + 5% бараньей крови).
Чашки с посевами немедленно помещались в анаэростат-контейнер, где с помощью газогенерирующих пакетов «GENbox microaer», ВюМепеих, Франция создавалась ми-кроаэрофильная атмосфера (О2 11%, СО2 9%, N2 80%). Посевы инкубировались в термостате при температуре +37°С и влажности 95%. Учет результатов посева проводился через 3 суток. В случае отсутствия признаков роста инкубация продлялась до 10 суток. На 3-5-е сутки на кровяном агаре и Pylori агаре Н. pylori формировал мелкие, круглые, гладкие, прозрачные колонии диаметром 1-3 мм.
При получении роста колоний, по морфологии сходных с H. pylori, проводилась их идентификация, которая включала в себя окраску мазка по Граму и биохимические тесты: уреаз-ный, каталазный и оксидазный.
Хранение штаммов осуществляется в пробирках с триптиказо-соевым бульоном (BioMeriеux, Франция) с добавлением 30% стерильного глицерина (Sigma, США) при температуре -70°С.
Определение чувствительности
В соответствии с рекомендациями Института по клиническим и лабораторным стандартам США (CLSI) исследование чувствительности H. pylori с определением минимальной подавляющей концентрации (МПК) проводили методом разведения в катион-сбалансированном агаре Мюллера-Хинтон (BBL, США) с добавлением 5% бараньей крови.
Для приготовления инокулюма использовали двухдневную культуру Н. pylori, разведенную 3-5 мл стерильного физиологического раствора до достижения плотности, эквивалентной стандарту мутности 2 по McFarland (DEN-1 McFarland Densitometr, BIOSAN, Латвия) с непосредственной инокуляцией чашек с последовательными разведениями антимикробных препаратов с помощью Multipoint Inoculator (Mast Diagnostics, Великобритания). Инкубация чашек проводилась 72 часа в микроаэрофильных условиях (GEN box microaer) при температуре +370С. Для чашек с метронидазо-лом проводилась предварительная инкубация в течение 24 ч в анаэробных условиях.
Определялась чувствительность H. pylori к амоксициллину, эритромицину, левофлоксацину, ципрофлокса-цину, тетрациклину и метронидазолу. При тестировании использовали двойные серийные разведения химически чистых субстанций антибиотиков. Для контроля адекватности разведений АМП был использован S. pneumoniae ATCC 49619.
Данные были введены путем двойного ввода в электронную базу данных на основе Microsoft SQL Server 2005 и Microsoft Access 2003. Статистический анализ проводился в системе статистического анализа SAS (программный пакет SAS Institute, США, версия 8.02 для Windows 98).
Результаты
Общие и демографические данные
В исследование было включено 210 пациентов, среди которых 77 мужчин (36,7%) и 133 женщины (63,3%). Средний возраст пациентов составил 49±16,03 лет. Соотношение мужчины/женщины 1:1,7. Средний возраст мужчин 47±16,28 лет. Средний возраст женщин 51±16,20 лет. Доля амбулаторных пациентов составила 63,8% (n=134), стационарных больных 36,2% (n=76).
Характеристика нозологических форм
В исследование были включены пациенты с различными заболеваниями, ассоциированными с H. pylori. Наиболее частой нозологической формой явился хронический поверхностный гастрит - 48,5% (n=102). Диагноз эрозивный гастрит был установлен у 20,9% пациентов (n=44), язвенная болезнь 12-перстной кишки у 15,2% (n=32), атрофический гастрит у 10% (n=21), гиперпластический гастрит у 3,8% (n=8) и язвенная болезнь желудка у 1,4% (n=3) пациентов.
Частота выделения H. pylori
Частота выделения Н. pylori составила 64% (n=135). При этом рост Н. pylori выявлялся у 68,8% (n=22) пациентов с язвенной болезнью 12-перстной кишки, у 66% (n=29) больных с эрозивным гастритом, у 65,6% (n=67) пациентов с хроническим поверхностным гастритом, у 50% (n=4) с гиперпластическим гастритом, у 47,6% (n=10) с атрофическим гастритом. Н. pylori был выделен у всех пациентов с язвенной болезнью желудка (n=3).
Предшествующий прием антибактериальных препаратов
Для анализа предшествующей терапии антибактериальными препаратами, включая антигеликобактерную терапию, пациенты были разделены на 2 группы.
В 1-ю группу были отнесены пациенты, не принимавшие антимикробные лекарственные средства (п=145), что составило 69% от всех исследуемых. Среди больных, не прини-
Рис. 1. Частота выделения Н. pylori в 1-й и 2-й группах
Среди антибактериальных препаратов, включающих ан-тигеликобактерные режимы терапии, пациентами 2-й группы при выделении Н. pylori использовались: ципрофлоксацин в 37% (n=10) случаев, амоксициллин в 26% (n=7), макролиды в 11% (n=3), метронидазол в 7,4% (n=2), гентамицин в 3,7% (n=1), цефазолин в 3,7% (n=1); ИПП + кларитромицин + метронидазол в 3,7% (n=1) случаев, неуточненная эрадика-ция была отмечена в 7,4% (n=2). В случае отсутствия роста Н. pylori у пациентов 2-й группы предшествующая антимикробная терапия была отмечена у 38 пациентов (58,5%). Среди антимикробных лекарственных средств, используемых пациентами 2-й группы при отсутствии роста Н. pylori, указаны: амоксициллин 23,6% (n=9), цефалоспорины 23,6% (n=9), азитромицин 10,6% (n=4), ципрофлоксацин 5,3% (n=2), метронидазол 5,3% (n=2), линкомицин 2,6% (n=1). Среди ан-
Из 133 штаммов H. pylori 24 (18%) были резистентны к одному антимикробному препарату (или одной группе антибиотиков), 4 штамма (3%) - к двум и более препаратам разных групп антимикробных лекарственных средств. Общее число пациентов, имеющих резистентные штаммы хотя бы к одному препарату, составило 28 (21%) от общего числа выделенных штаммов.
Резистентность H. pylori к амоксициллину Не выявлено резистентных штаммов Н. pylori к амоксициллину (табл. 2). МПК50 и МПК90 составили 0,03 мг/мл и 0,125 мг/мл соответственно.
мающих антибиотики, рост ^pylori отмечен в 74,5% (n=108) случаев, что статистически значимо чаще (p<0,0001), чем во 2-й группе.
Во 2-ю группу были включены пациенты, принимавшие антимикробные лекарственные средства (n=65), что составило 31% от всех исследуемых. При этом Н. pylori был выделен во 2-й группе лишь у 41,5% (n=27) больных (рис. 1).
тигеликобактерных схем были отмечены: ИПП + кларитро-мицин + амоксициллин 10,6% (n=4), ИПП + метронидазол + амоксициллин 5,3% (n=2), ИПП + кларитромицин + метронидазол 5,3% (n=2), в 7,8% (n=3) случаях пациенты не могли указать названия всех препаратов эрадикационной схемы.
Результаты определения чувствительности Н. pylori к антимикробным препаратам
Общее число тестируемых штаммов Н. pylori для определения чувствительности к антимикробным препаратам составило 133 (2 штамма Н. pylori погибли при хранении).
В качестве критериев оценки чувствительности Н. pylori использовались рекомендации CLSI, 2010 г., Британского общества по антимикробной химиотерапии (BSAC, 2009 г.) и Французского общества микробиологов (SFM, 2007 г.) в зависимости от препарата (табл. 1).
Резистентность H. pylori к метронидазолу Отмечена низкая частота резистентности Н. pylori к метронидазолу 3,8% (n=5), МПК90=0,25 мг/мл. Резистентность H. pylori к тетрациклину Не выявлено резистентных штаммов Н. pylori к тетрациклину. МПК50 и МПК90 составили 0,125 мг/мл и 0,25 мг/мл соответственно.
Таким образом, выявлена высокая активность амоксицил-лина (100%), тетрациклина (100%) и метронидазола (96,2%) в отношении исследованных штаммов Н. pylori.
1 выделен H. pylori I-1 не выделен H. pylori
1 группа
2 группа
i................................::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::
0% 20% 40% 60% 80% 100%
Таблица 1. Критерии оценки чувствительности Н. pylori к антимикробным препаратам
АМП Критерии оценки, мг/л
Ч УР Р
Амоксициллин (BSAC) <1 - >1
Эритромицин (SFM) <1 2 >4
Метронидазол (BSAC) <4 - >4
Тетрациклин (BSAC) <2 - >2
Левофлоксацин (SFM) <1 - >1
Ципрофлоксацин (SFM) <1 - >1
Таблица 2. Чувствительность Н. pylori к антимикробным препаратам
АМП МПК50, мг/л МПК90, мг/л Ч УР Р
n % n % n %
Эритромицин 0,125 0,5 123 92,4% - - 10 7,6%
Метронидазол 0,06 0,25 128 96,2% - - 5 3,8%
Ципрофлоксацин 0,5 4 116 87,2% - - 17 12,8%
Левофлоксацин 0,5 1 122 91,7% - - 11 8,3%
Амоксициллин 0,03 0,125 133 100% - - - -
Тетрациклин 0,125 0,25 133 100% - - - -
Резистентность H. pylori кмакролидам Несмотря на то, что эритромицин не применяется в клинической практике для лечения Н. pylori-инфекции, он может использоваться в качестве маркера устойчивости Н. pylori ко всем макролидам. Согласно полученным данным, частота резистентности Н. pylori к эритромицину составила 7,6% (n=10) (МПК90=0,5 мг/мл), что указывает на относительно низкий уровень устойчивости Н. pylori к макролидам (табл. 2). Резистентность H. pylori к фторхинолонам Зарегистрирован относительно высокий уровень резистентности Н. pylori к ципрофлоксацину - 12,8% (n=17), (МПК90=4 мг/мл). Частота резистентности Н. pylori к левоф-локсацину составила 8,3% (n=11) при МПК90=1 мг/мл.
Относительно высокий уровень резистентности к фторхинолонам, по-видимому, связан с частым использованием данных препаратов в терапии различных инфекций.
Предшествующая антибактериальная терапия у пациентов, от которых были выделены резистентные штаммы H. pylori
Среди 28 пациентов, от которых были выделены резистентные штаммы Н. pylori, предшествующую антибактериальную терапию отметили 28,6% больных (n=8). Среди антимикробных лекарственных средств использовались: ципроф-локсацин 25% (n=2), цефазолин 25% (n=2), амоксициллин 12,5% (n=1), метронидазол 12,5% (n=1), эрадикация Н. pylori проводилась у 2 пациентов (25%). Наиболее часто у этих пациентов отмечалась резистентность Н. pylori к фторхиноло-нам - 62,5% (n=5), реже к макролидам - 25% (n=2), а также к макролидам в сочетании с метронидазолом - 12,5% (n=1). Причем во всех случаях выделения резистентных к макролидам штаммов Н. pylori пациенты отмечали предшествующую неуточненную эрадикационную терапию.
Предшествующая антибактериальная терапия у пациентов, от которых были выделены чувствительные к антибактериальным препаратам штаммы H. pylori
Среди 105 пациентов, имеющих чувствительные штаммы Н. pylori к антибактериальным лекарственным средствам, предшествующую антибактериальную терапию отметили 16% больных (n=17). Среди антимикробных лекарственных средств использовались: ципрофлоксацин 41,1% (n=7), амок-сициллин 29,4% (n=5), азитромицин 11,8% (n=2), метронидазол 5,9% (n=1), гентамицин 5,9% (n=1) и олететрин 5,9% (n=1).
Учитывая небольшие группы сравнения, достоверно сказать, что предшествующий прием антибактериальных препаратов влияет на частоту формирования резистентных штаммов Н. pylori, по результатам данного исследования, не представляется возможным.
Выводы
1. На основе локальных данных антибиотикорезистент-ности Н. pylori обосновано использование эрадикационных схем для лечения Н. pylori- ассоциированных заболеваний:
ИПП + кларитромицин + амоксициллин
ИПП + кларитромицин + метронидазол
ИПП + висмута субсалицилат + тетрациклин +метрони-дазол
ИПП + амоксициллин + метронидазол
ИПП + тетрациклин + метронидазол
2. Целесообразность использования хинолонов в качестве резервной терапии Н. pylori- ассоциированных заболеваний является сомнительной в связи с относительно высоким уровнем резистентности Н. pylori к данной группе антимикробных лекарственных средств.
3. Предшествующий прием антибактериальных лекарственных средств достоверно снижает частоту выделения Н. pylori.
ЛИТЕРАТУРА
1. Консолар М. Новые подходы к диагностике и элиминации Helicobacter pylori при язвенной патологии желудочно-кишечного тракта. Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Казань, 2007.
2. Кудрявцева Л.В. Состояние антибиотикорезистентности H. pylori в России // Экспер. и клин. гастроэнтерол. - 2003. -№ 3. - С. 4-5.
3. Boyanova L., Mentis A., Gubina M. et al. The status of antimicrobial resistance of Helicobacter pylori in Eastern Europe // Clin. Microbiol. Infect. - 2002. - Vol. 8. - P. 388-396.
4. Glupczynsky Y., Megraud F., Lopez Brea M., Andersen L.P. European Multicentre survey of in vitro antimicrobial resistance in Helicobacter pylori // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 2001. - Vol. 20. - P. 820-823.
5. Heep M., Kist M., Strobel S., Beck D., Lehn N. Secondary resistance among 554 isolates of Helicobacter pylori after failure of therapy // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 2000. - Vol. 19. - P. 538-541.
6. MacMahon B.J., Hennessy T.N., Bensler J.M. et al. The Relationship among Previous Antimicrobial Use, Antimicrobial Resistance, and Treatment Outcomes for Helicobacter pylori Infections // Ann. Intern. Med. - 2003. - Vol. 139. - P. 463-469.
7. Malfertheiner P., Megraud F., O'Morain C. Guidelines for management of Helicobacter pylori infection // European gastroenterology review, 2005. - P. 59-62.
8. Osato M.S., Reddy R., Reddy S.G., Penland R.L. et al. Pattern of primary resistance of Helicobacter pylori to metronidazole or claritromycin in the United States // Arch. Int. Med. - 2001. - Vol. 161. - P. 1217-1220.
9. Perez Aldana L., Kato M., Nakagawa S., Kawarasaki M. et al. The relationship between consumption of antimicrobial agents and the prevalence of primary Helicobacter pylori resistance // Helicobacter. - 2002. - Vol. 7. - P. 306-309.
10. William M., Jeremy S., Pruckler J., Sond Q. et al. Antimicrobial resistance incidence and risk factors among Helicobacter pylori -infected persons // United States. Emerg. Infect. Dis. - 2004. - Vol. 10. - P. 1088-1099.
