CC BY
72
УДК 616.13-004.6:616.153.915-039-074-07:577.112.386
СОСТОЯНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ И АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМ У БОЛЬНЫХ С АТЕРОСКЛЕРОЗОМ ПРИ НАЛИЧИИ И ОТСУТСТВИИ ГИПЕРГОМОЦИСТЕИНЕМИИ
В.М. Шмелева, Л.П. Рыбакова
Лаборатория свертывания крови (руков. - проф. Л.П. Папаян), лаборатория биохимии (руков. - проф. М.Н. Блинов) Российского НИИ гематологии и трансфузиологии, г. Санкт-Петербург
Роль активных кислородных радикалов (АКР) в индукции атеросклероза интенсивно изучается. Многие факторы риска атеротромбоза, в том числе гипергомоцистеинемия, реализуют свой атерогенный эффект через развитие окси-дантного стресса [12]. Гомоцистеин (ГЦ) - аминокислота, содержащая свободную тиоловую группу, является промежуточным продуктом обмена метионина и фолатов. Появление гипергомоцистеинемии (ГГЦ) означает, что обмен нарушен, клетки экскретируют избыток ГЦ в кровь, и это ограничивает внутриклеточное токсическое действие, но оставляет сосудистую стенку открытой для повреждающих эффектов ГГЦ. Наиболее значимый патологический результат ГГЦ - дисфункция эндотелия, развивающаяся вследствие ок-сидантного стресса. ГЦ инициирует окси-дантный стресс путем самоокисления ГЦ и образования смешанных дисульфидов. Окисление двух молекул ГЦ приводит к образованию окисленной формы - гомо-цистина, обладающего прямым цитоток-сическим эффектом, двух протонов, двух электронов и инициирующего формирование активных кислородных радикалов [11]. Если акцептором электрона выступает кислород, то образуется супероксид или гидроген пероксид. Супероксид инициирует перекисное окисление липидов (ПОЛ). При взаимодействии супероксида с N0 образуется токсичный пероксинит-рит 00N0". В отсутствии доступного N0 супероксид под воздействием суперок-сиддисмутазы (СОД) быстро переходит в гидроген пероксид, который, в свою очередь, разлагается до воды в реакциях либо с глутатионпероксидазой (ГП), либо
© 19. «Казанский мед. ж.», № 3.
с каталазой. H2O2 может вступать в реакцию с другими радикалами, например с Fe2+ с образованием высокореактивного гидроксил радикала [12]. Формирование смешанных дисульфидов приводит к дополнительному формированию АКР. Среди наиболее восприимчивых к воздействию АКР молекул особого внимания в контексте патологического действия ГГЦ на эндотелий заслуживают полине-насыщенные жирные кислоты. Вступая в реакцию с АКР, они лишаются атома водорода, что инициирует процесс ПОЛ, в ходе которого генерируются новые АКР. Рассмотренные положения сформулированы на основании экспериментов in vitro и ex vivo. Число же клинических исследований, изучающих свободнорадикальные и антиокислительные процессы при ГГЦ, ограничено. Поэтому нам представлялось актуальным оценить состояние окислительной и антиокислительной систем у больных с атеросклерозом при наличии и отсутствии ГГЦ.
Было обследовано 55 больных (45 мужчин и 15 женщин в возрасте от 40 до 60 лет) с хронической артериальной недостаточностью нижних конечностей атеросклеротического происхождения.
Контрольную группу составили 50 практически здоровых лиц.
Уровень ГЦ в плазме определяли методом жидкостной хроматографии под высоким давлением [6] на аналитической колонке Luna 5u C18(2) 100A, 150 x 4,6 mm (Phenomenex) с использованием хроматографа Spectra-Physics 8800, аутосамплера Gilson 231 и спектрофотометра Merck-Hitachi F-1050. Уровень ГЦ в плазме выше 13,5 мкмоль/л
281
(95% процентиль в контрольной группе) расценивали как ГГЦ. По тяжести ГГЦ условно делили на легкую (13,5-25 мкмоль/л), умеренную (25-50 мкмоль/л) и тяжелую (более 50 мкмоль/л). О состоянии окисления липидов в сыворотке больных судили по содержанию продуктов их пероксида-ции. Содержание вторичного продукта ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) определяли колориметрическим методом по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой [1]. О состоянии системы антиоксидант-ной защиты (АОЗ) судили по содержанию или активности ряда компонентов первичной защиты - ферментов СОД, каталазы (КАТ), глутатионпероксидазы (ГП), церулоплазмина (ЦП) и неферментных низкомолекулярных соединений, об активности суммарной СОД (КФ 1.15.1.1) плазмы -по степени торможения реакции окисления кверцетина [4], об активности КАТ (КФ 1.11.1.6) в сыворотке - по способности КАТ разлагать перекись водорода, о чем судили по величине неутилизированной Н202, образующей стойкий окрашенный комплекс с солями молибдата аммония [3]. Активность ГП (КФ 1.11.1.9) измеряли по расщеплению гидроперекиси третбути-ла, используя в качестве субстрата восстановленный глутатион, содержание ЦП -по окислению фенилендиаминдигидро-хлорида в присутствии ЦП [2]. О содержании низкомолекулярных водорастворимых антиоксидантов судили по количеству небелковых тиоловых групп (НТГ) эритроцитов [2]. Определение НТГ основано на способности низкомолекулярных тио-ловых соединений при взаимодействии с дитионитробензойной кислотой образовывать стойкое окрашенное соединение [5]. Статистический анализ материала выполнялся помощью программ для медико-биологических исследований (StatPadPrism и 81а118Иса 6.0).
У всех пациентов отмечалось увеличение продуктов ПОЛ на фоне повышения активности ГП и содержания ЦП, снижения активности СОД и коэффициента СОД/КАТ и содержания восстановленного глутатиона, что свидетель-
282
ствует о напряжении окислительной и антиокислительной систем, т.е. развитии окислительного стресса у больных с атеросклерозом. Исходя из цели работы пациенты были разделены на две группы по признаку наличия или отсутствия ГГЦ. Указанные группы были репрезентативны и сопоставимы по числу больных (27 и 28 человек соответственно). Полученные данные указывали на то, что напряжение окислительных реакций и системы АОЗ присуще обеим группам. В то же время изменения у больных с ГГЦ носили более выраженный характер. Например, уровень МДА возрастал на 85% по сравнению с нормой у больных без ГГЦ и на 99% у больных с ГГЦ. В связи с этим для дальнейшего анализа показатели оксидант-ного стресса и системы антиоксидан-тной защиты больных были оценены в трех подгруппах, выделенных по тяжести ГГЦ (см. табл.). Содержание МДА во всех подгруппах больных было достоверно выше, чем в контроле. Уровень МДА у больных с умеренной и тяжелой ГГЦ был повышен более чем в 2 раза. У пациентов с нормальным уровнем ГЦ активность КАТ превышала нормальные показатели в 1,7 раза, а при уровне ГЦ более 25 мкмоль/л - в 2,5 раза. Средние значения активности СОД были достоверно ниже нормы во всех подгруппах больных, однако между собой значимо не различались. Показатели СОД характеризовались высокой вариабельностью внутри каждой группы. Отмечалось нарушение сопряженного действия ферментов СОД и КАТ, что выражалось снижением коэффициента СОД/КАТ в среднем до 10 у больных без ГГЦ и до 6,7 у больных с выраженной ГГЦ по сравнению с 20,5 у здоровых лиц. При нормальном уровне ГЦ и легкой ГГЦ содержание ЦП у больных более чем в 2 раза превышает среднее значение в контрольной группе. Параллельно с нарастанием уровня ГЦ наблюдалась противоположная тенденция - содержание ЦП снижалось до верхнего предела нормальных колебаний содержания ЦП (0,3-0,6 г/л).
Показатели оксидантного стресса и системы антиоксидантной защиты у больных облитерирующим атеросклерозом сосудов нижних конечностей в зависимости от тяжести ГГЦ (M±m)
Показатели Обследованные
Здоровые лица (n=50) с нормальным уровнем ГЦ (n=28) с легкой ГГЦ (n=20) с умеренной и тяжелой ГГЦ (n=7)
Активность СОД, усл. ед. акт/мл 39,00±2,00 31,00±2,80* 31,70±2,87* 33,30±6,30*
Активность КАТ, усл.ед. акт. 1,90±0,20 3,19±0,27* 3,29±0,30* 4,90±0,86*, **
Коэффициент СОД/ КАТ 20,5 10,6* 9,6* * ,7 6,
Активность ГП, ммоль/мл 0,70±0,04 0,91±0,03* 0,89±0,05* 0,70±0,08 **
Содержание НТГ, ммоль/л 0,34±0,02 0,15±0,01* 0,17±0,01* 0,20±0,02*
Содержание ЦП, г/л 0,40±0,02 0,85±0,07* 0,83±0,07* 0,64±0,10*
Содержание МДА, мкмоль/л 11,00±0,90 18,90±2,20* 22,80±5,30* 23,90±5,70*
* р<0,001 - достоверное различие с нормой, ** р<0,05 - между данными пациентов с нормальным уровнем ГЦ и с умеренной и тяжелой ГГЦ.
Повышенное содержание МДА (продукта ПОЛ) и ранее отмечалось при атеросклерозе [12, 16]. Тенденция к увеличению содержания МДА при повышении уровня ГЦ, на наш взгляд, свидетельствует об усилении напряжения окислительных реакций при ГГЦ. Анализ изменений показателей АОЗ выявил, что нарастание тяжести ГГЦ сопровождается увеличением активности КАТ, уменьшением содержания НТГ и ЦП. Интерпретировать результаты касающиеся ЦП достаточно сложно. Литературные данные о роли ЦП в модификации оксидантного стресса при ГГЦ практически отсутствуют. В то же время известно, что ЦП ингибирует катализируемый ионами железа процесс ПОЛ, а также нейтрализует супероксид и ряд других АКР [8]. Антиок-сидантная роль ЦП реализуется через его оксидазную активность, направленную на ароматические амины и фенолы, а также посредством ферроксидазной активности [8, 16]. Большинство исследователей считают, что ЦП предотвращает ПОЛ, однако есть отдельные работы, демонстрирующие участие ЦП в окислении липопротеинов низкой плотности [8, 16]. Достоверное повышение содержания ЦП у больных
ОАНК с нормальным уровнем ГЦ, вероятно, является компенсаторной антиокси-дантной реакцией. Отмеченное снижение содержания ЦП при нарастании степени тяжести ГГЦ, на наш взгляд, может быть следствием активного самоокисления ГЦ, которое, как известно, протекает с обязательным участием Си2+, а 95% меди находится в составе ЦП [16]. Содержание НТГ у пациентов было снижено практически в 2 раза. При нарастании ГГЦ прослеживалась тенденция к повышению уровня НТГ, что возможно, связано со снижением активности ГП, субстратом которой является глутатион. Активность СОД у обследованных больных статистически значимо ниже, чем в контроле. Достоверных различий данного показателя в зависимости от тяжести ГГЦ не выявлено. Высокая вариабельность значений активности СОД может быть следствием неспособности поддержания барьерных функций эритроцитарной мембраной и ее повреждения продуктами ПОЛ. Активность КАТ статистически значимо повышалась при нарастании тяжести ГГЦ. Если при легкой ГГЦ отмечалась тенденция к повышению активности КАТ, то при уровне ГЦ более 25 мкмоль/л активность КАТ была
283
достоверно выше, чем при нормальном уровне ГЦ.
Активность ГП у больных при нормальном уровне ГЦ была повышена в сравнении с контролем, что свидетельствует об адекватном ответе системы АОЗ. При умеренной и тяжелой ГГЦ активность ГП была достоверно ниже, чем при нормальном уровне ГЦ, т.е. не обеспечивала эффективную защиту от нарастающей продукции АКР. Наши данные согласуются с результатами исследований in vitro, в которых показано, что ГЦ ведет к снижению продукции ГП воздействуя на мРНК внутриклеточной изоформы фермента [7, 9]. В эксперименте доказано, что ГЦ снижает транскрипцию, трансляцию и каталитическую активность СОД и ГП, причем ГП в большей степени, чем СОД [13]. В то же время ГЦ снижает сродство СОД к поверхности эндотелиальных клеток путем разрушения эндотелиального протеогликана ге-парансульфата, что ведет, в свою очередь, к потере способности защищать поверхность эндотелиальной клетки от оксидантного стресса [14]. Ингибировать синтез ГП способен только ГЦ, в этом его уникальность по сравнению с другими тиолами, например с цистеином, содержание которого в плазме выше, чем ГЦ, и который также способен к самоокислению с образованием супероксида и цистина. Таким образом, ГЦ является токсичным тиолом в сравнении, например, с цистеином, плазменные концентрации которого многократно превышают концентрации ГЦ. ГП - это антиоксидант, который восстанавливает и перекисные липиды, и перекись водорода до соответствующих спиртов и играет центральную роль в механизме внутриклеточной дезинтоксикации. Каталаза же воздействует исключительно на перекись водорода. Причем, несмотря на достаточно высокую каталитическую эффективность каталазы, в отношении H2O2, ее Km в 2-3 раза ниже, чем у ГП [11]. Кроме того, каталаза, в отличие от ГП, не может восстанавливать пероксиды липидов. Таким образом, отмеченное нами компенсаторное повышение активности каталазы без
284
синергичного изменения ГП не может обеспечить эффективную защиту организма от АКР при ГГЦ. Исследованные анти-оксидантные ферменты образуют единую метаболическую цепь, в которой продукт первой реакции является субстратом последующей. Так, каталаза и ГП способны удалять избыток образующегося при участии СОД H2O2. Работы на культурах эндотелиальных клеток показали, что именно образование перекиси водорода при высоких концентрациях ГЦ ведет к повреждению клетки [7]. Для нормального функционирования системы в целом необходим баланс активности отдельных элементов цепи. О нарушении баланса системы свидетельствует снижение коэффициента СОД/КАТ, также отчетливо коррелирующее с выраженностью ГГЦ.
Полученные нами данные об угнетении активности ГП могут объяснить особенности патогенеза протромботичес-ких и атерогенных изменений в эндотелии при ГГЦ. В норме эндотелий продуцирует эндотелиальный оксид азота (NO) - мощный вазодилататор и антиаг-регант. ГП защищает NO от окисления и, следовательно, снижение активности ГП ведет к снижению функциональной активности NO. ГП восстанавливает H2O2 и перекисные липиды (LOOH) до H2O и LOH. Если активность ГП снижена, эти пероксиды могут вступать во взаимодействие с NO или металлами переменной валентности, что приводит к формированию таких АКР, как HNO2 или LOONO. Избыточное количество ГЦ также блокирует NO путем перевода его в токсичный перок-синитрит [15]. Помимо пероксинитрита при взаимодействии NO с ГЦ и АКР формируются нитротирозин и нитроаргинин. Нитроаргинин, в свою очередь, конкурирует с L-аргинином, субстратом реакции формирования NO по механизму обратной связи, ограничивающим дальнейшее образование NO. Оксидантный стресс вносит лепту в окисление BH4 до BH2 и BH3, что также блокирует синтез NO [9]. Наряду со снижением продукции ГП, ГЦ окисляя глутатион существенно снижает восстано-
вительный потенциал клетки. Развивается относительный дефицит ко-субстрата ГП, что ведет к дальнейшему углублению оксидантного стресса, снижению антиок-сидантной защиты и потенцированию пе-роксид-опосредованной инактивации N0.
Таким образом, повышение уровня МДА и снижение общей антиоксидант-ной активности плазмы при нарастании уровня ГЦ свидетельствуют об углублении оксидантного стресса при наличии ГГЦ. Наши данные, полученные в клиническом исследовании, полностью согласуются с экспериментальными, а именно активность каталазы компенсаторно нарастает, а СОД и, особенно, ГП снижаются, так как ГГЦ избирательно угнетает функционирование этих антиокислительных ферментов. При ГГЦ происходят истощение защитных возможностей системы АОЗ, нарушение баланса между генерацией и элиминацией АКР. В результате прогрессирует продукция АКР, снижается продукция N0, углубляется эндотелиальная дисфункция [10, 11]. АКР усиливают экспрессию тканевого фактора мононук-леарными клетками и ингибитора активатора плазминогена-1 эндотелиальными клетками, что также способствует тромбо-образованию [12]. Нормальное функционирование системы АОЗ крайне важно и для предотвращения активации тромбоцитар-ного звена гемостаза. Отсюда дефицит АОЗ является, по всей видимости, одним из факторов, провоцирующих тяжелое течение и прогрессирование атеросклероза при ГГЦ.
ВЫВОДЫ
1. При гипергомоцистеинемии избирательно угнетается продукция глутатион-пероксидазы.
2. Повышение активности каталазы без синергичного действия глутатионпе-роксидазы не обеспечивает эффективную защиту организма от активных радикалов кислорода.
3. Повышение содержания малонового диальдегида и снижение общей ан-тиоксидантной активности плазмы при нарастании уровня гомоцистеина свиде-
тельствуют об углублении оксидантного стресса при наличии гипергомоцистеине-мии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Андреева Л.И., Кожемякин Л.А., Кишкун А.А.. // Лаб. дело.- 1988.- № 11. - С. 41-43.
2. Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н.. Методы оценки свободнорадикального окисления и анти-оксидантной системы организма. - СПб, 2000.
3. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарева В.Е. // Лаб. дело.-1988.- № 1.- С.16-48
4. Костюк В.А., Потапович А.И., Ковалева Ж.В. // Вопр. мед. химии. - 1990. - № 2.- С. 88-91.
5. Медицинские лабораторные технологии. /Справочник под ред. А.И. Карпищенко. - СПб, 1999. -Т. 2. - С. 72-73.
6. Шмелева В.М., Капустин С.И., Блинов М.Н., Папа-ян Л.П. // Мед. акад. журн. - 2003. - Т.3. - С. 28-34.
7. Carmel R., Jacobsen D.Homocysteine in Health and Disease. 2001.
8. Ehrenwald E., Chisolm G., Fox P. // J. Clin. Invest. - 1994. - Vol. 93. - P. 1493-1501.
9. Hayden M, Tyagi S. // Nutrit. J. - 2004. - Vol. 3-4. -P. 1-23.
10. Lentz S.R. //J. thromb. haemost. - 2005. - Vol.3. -P. 1646-1654.
11. Loscalo J. // J.Clin. Invest. - 1996. - Vol. 98. -P. 5-7.
12. Madamanchi N., Hakim Z., Runge S. // J. Thromb. Haemost. - 2005. - Vol.3. - P. 254-267.
13. Outinen P., Sood S., Pfeifer S., Pamidi S. et al. // Blood. - 1999. - Vol. 94. - P.959-967.
14. Sharma P., Senthilkumar RD., Brahmachari V. et al. // Lipids in Health and Disease. - 2006. - Vol. 5. -P. 3-15.
15. Upchurch G.H., Welch G.J., Fabian A.J. et al. // J. Biol. Chem. - 1997. - Vol. 272. - P.17012-17.
16. Verma V., Ramesh V., Tevari S. et al. // Ind. J. Clin. Biochem. - 2005. - Vol. 20 (2). - P. 68-74.
Поступила 25.01.08.
THE CONDITION OF THE OXIDATIVE AND ANTIOXIDATIVE SYSTEMS IN PATIENTS WITH
OBLITERATING ATHEROSCLEROSIS OF THE LOWER EXTREMITIES IN THE PRESENCE AND ABSENCE OF HOMOCYSTEINEMIA
V.M. Shmeleva, L.P. Rybakova
Summary
The state of the oxidant - antioxidant system was studied in 55 patients with atherosclerosis and 50 healthy people. The activities of superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GP), catalase (CAT), the content of malonic dialdehyde, ceruloplasmin and nonprotein thiole groups were detected in patients with and without hyperhomocysteinemia (HHC). Results indicated that the formation of lipid peroxides in HHC patients was more prominent and not balanced by antioxidant system, particularly in severe HHC. GP activity and SOD/CAT coefficient were significantly decreased in HHC patients. The important roles of HHC and “oxidative stress” in pathogenesis of atherothrombotic complications were suggested.
