CC BY
26
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018
Лебедева Е.С.1, Джаруллаева А.Ш.2, Багаев А.В.1, Ерохова А.С.2, Чулкина М.М.1, Тухватулин А.И.2, Пичугин А.В1, Логунов Д.Ю.2, Атауллаханов Р.И.1
СОЧЕТАННАЯ СТИМУЛЯЦИЯ РЕЦЕПТОРОВ TLR4, TLR9 И NOD2 СИНЕРГИЧЕСКИ ПОВЫШАЕТ ЗАЩИТУ ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ В МОДЕЛИ ЛЕТАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ SALMONELLA ENTERICA
1 Государственный научный центр «Институт иммунологии» ФМБА, 115478, Москва, Россия;
2 ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России, 123098, Москва, Россия
Сочетанное действие двух или нескольких PRR-агонистов способно вызвать активацию защитных иммунных реакций, значительно более интенсивную, чем ответ на воздействие одиночными агонистами. Синергическая реакция клеток на сочетание агонистов различных PRR открывает новые перспективы в иммунотерапии инфекционных и опухолевых заболеваний.
В данной работе мы исследовали эффективность тройного сочетания агонистов рецепторов TLR4, TLR9 и NOD2 для стимуляции иммунитета и повышения иммунной защиты мышей BALB/c в модели острой бактериальной инфекции Salmonella enterica, serovar typhimurium. Заражению животных летальной дозой бактерий предшествовала стимуляция иммунитета индивидуальными агонистами TLR9, TLR4, NOD2, их парными TLR9+TLR4, TLR9+NOD2, TLR4+NOD2 и тройным TLR9+TLR4+NOD2 сочетаниями. Стимуляцию иммунитета оценивали по продукции про-воспалительных цитокинов: IL-1a, IL-12, MCP-1.
Максимальная защита от летальной бактериальной инфекции обнаружена при использовании сочетаний агонистов TLR9+TLR4+NOD2, TLR9+TLR4 и TLR4+NOD2. Инъекция сочетаний агонистов TLR9+TLR4+NOD2 обеспечила выживаемость 70% (р < 0,01), TLR9+TLR4 - 80 % (р < 0,01), а TLR4+NOD2 - 50 % (р < 0,05), в то время как в контроле заражения выжило только 10 % животных. Инъекция одиночных агонистов не приводила к статистически значимому повышению процента выживших животных.
Эффективная противоинфекционная активность сочетаний агонистов ODN2395+LPS, ODN2395+LPS+L18-MDP, сопровождалась возрастанием продукции IL12 в организме мышей и в культуре мышиных макрофагов in vitro.
Ключевые слова: Toll-подобные рецепторы; NOD- подобные рецепторы; агонисты; синергизм; защита от инфекции; Salmonella enterica.
Для цитирования: Лебедева Е.С., Джаруллаева А.Ш., Багаев А.В., Ерохова А.С., Чулкина М.М., Тухватулин А.И., Пичугин А.В., Логунов Д.Ю., Атауллаханов Р.И. Сочетанная стимуляция рецепторов TLR4, TLR9 и NOD2 синергиче-ски повышает защиту лабораторных мышей в модели летальной инфекции Salmonella enterica. Иммунология. 2018; 39(5-6): 252-257. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-5-6-252-257
LebedevaE.S.1, DzharullaevaA.Sh.2, BagaevA.V.1, ErokhovaA.S.2, ChulkinaM.M.1, TukhvatulinA.I.2, PichuginA.V.1, Logunov D.Yu.2, Ataullakhanov R.I.1
COMBINED STIMULATION OF RECEPTORS OF TLR4, TLR9 AND NOD2 SYNERGISTICALLY INCREASES PROTECTION OF LABORATORY MICE IN LETHAL SALMONELLA ENTERICA INFECTION MODEL
1 National Research Center - Institute of Immunology, Federal Medical-Biological Agency of Russia, 115478, Moscow, Russia;
2 N.F. Gamaleya National Research Center of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health of the Russian Federation; 123098, Moscow, Russia
Combinations of two or more PRR-agonists can trigger much more intensive immune response than single agonists alone. Synergistic effect of combinations of different PRR-agonists opens new perspectives for immunotherapy of infectious and neoplastic diseases.
In this study we investigated the effectiveness of triple combination of TLR4, TLR9 and NOD2 agonists in stimulation of immune responses and protection of BALB/c mice against lethal Salmonella enterica serovar Typhimurium infection. Stimulation of immunity with individual TLR4, TLR9, NOD2 agonists, or their paired TLR9+TLR4, TLR9+NOD2, TLR4+NOD2, or triple TLR9+TLR4 + NOD2 combinations was performed before animal challenging with a lethal dose of bacteria. Stimulation of immunity was assessed according to blood immunostimulatory cytokines and chemokines. Combinations of TLR9+TLR4+NOD2, TLR9+TLR4 and TLR4+NOD2 agonists demonstrated maximum protection of animals against a lethal bacterial infection. Injection of TLR9+TLR4+NOD2 agonists provided a survival of 70% (p < 0.01), TLR9+TLR4 - 80% (p < 0.01), and TLR4+NOD2 > 50% (p < 0.05) of animals, while only 10% of animals survived in the challenge control group. No protective activity of single agonists was observed.
The anti-infective activity of combinations of ODN2395+LPS and ODN2395+LPS+L18-MDP agonists was accompanied with enhanced production of IL12 in mice and in in vitro culture of mouse macrophages.
Для корреспонденции: АтауллахановРавшан Иноятович, д-р мед. наук, профессор, руководитель отдела иммунной биотехнологии ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, E-mail: [email protected].
ORIGINAL ARTICLE
Keywords: pattern-recognition receptors; Toll-like receptors; NOD-like receptors; innate immunity; synergism; Salmonella enterica infection.
For citation: LebedevaE.S., DzharullaevaA.Sh., BagaevA.V., ErokhovaA.S., ChulkinaM.M., TukhvatulinA.I., Pichugin A.V., Logunov D.Yu., Ataullakhanov R.I. Combined stimulation of receptors of TLR4, TLR9 and NOD2 synergistically increases protection of laboratory mice in lethal Salmonella enterica infection model. Immunologiya. 2018; 39(5-6): 252-257. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-5-6-252-257
For correspondence: Ravshan I. Ataullakhanov, MD, PhD, Prof., Head, Department of Immune Biotechnology, NRC Institute of Immunology FMBA, Russia, E-mail: [email protected]
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgments. The work was performed with financial support from grant RSF15-15-00102.
Received 03.11.17 Accepted 16.03.18
введение
Клеточные рецепторы, распознающие молекулярные образы патогенов (pattern-recognition receptors, PRR) определяют формирование врожденных и адаптивных иммунных реакций. Клетки макроорганизма с помощью ограниченного набора PRR способны распознавать присутствие чужеродных инфекционных агентов самой различной природы - вирусы, бактерии, грибы, простейшие [1, 2].
Известно несколько семейств PRR: Toll-подобные рецепторы (Toll-like receptors, TLR), RIG-подобные (RIG-like receptors, RLR), NOD-подобные (NOD-like receptors,NLR) и другие [3]. TLR локализуются в составе внешней клеточной мембраны (TLR1, TLR2, TLR4 и TLR5), а также в мембранах внутриклеточных органел, в частности, фагосом (TLR3, TLR7/8 и TLR9), где распознают такие структурные компоненты бактерий как липопротеин, липопептид, пептидогли-кан (TLR1, 2 и 6), липополисахарид (TLR4) и флагеллин (TLR5), а также чужеродные нуклеиновые кислот dsRNA (TLR3), ssRNA (TLR7/8) и ODN2395 CpG олигонуклеоти-ды (TLR9) [4]. NLR находятся в цитозоле клетки и связывают компоненты пептидогликана клеточной стенки (NOD1, NOD2) [5], а RLR - распознают молекулы двухцепочечной вирусной РНК (MDA5, LGP2) [6].
Связывание соответствующих агонистов с PRR приводит к стимуляции в клетках сигнальных путей, активирующих защитные реакции врожденного и адаптивного иммунитета. В частности, клетки способны увеличить продукцию различных противомикробных молекул (активные формы кислорода, активные формы азота, дефенсины, интерфероны и др.), направленных на деструкцию и ограничение распространения источника инфекции, а также секрецию провоспали-тельных цитокинов и хемокинов, которые привлекают в очаг инфекции и активируют эффекторные клетки врожденного и адаптивного иммунитета [2]. Своевременное распознавание патогенов системой PRR обеспечивает надежную защиту макроорганизма от инфекции.
Конкретные патогены несут в своем составе множество агонистов PRR различной природы - липополисахариды, ли-попротеины, липопептиды, протеогликаны и их структурные фрагменты, одно- и двухцепочечные нуклеиновые кислоты, и другие молекулярные образы, которые распознаются PRR [7]. Поэтому в условиях реальной инфекции происходит одновременная активация нескольких PPR и связанных с ними внутриклеточных сигнальных путей [7, 8]. Кооперация внутриклеточных сигнальных путей от нескольких PRR может приводить к синергическому ответу клетки на инфекцию. Клетки, активированные одновременно несколькими агони-стами PRR, отличаются усиленной продукцией широкого спектра противомикробных субстанций и провоспалитель-ных цитокинов [9-12].
Ранее мы исследовали иммунные реакции, инициируемые добавлением сочетаний агонистов TLR4, NOD2 и TLR9
к культуре макрофагов мыши [12-15]. Мы обнаружили синер-гическое усиление продукции клетками провоспалительных цитокинов, активных форм азота и интерферонов 1-го типа в ответ на добавление парных и тройных сочетаний агонистов TLR4, TLR9 и NOD2 in vitro. Усиленные ответы клеток сопровождались интеграцией сигнальных путей TLR4, NOD2 и TLR9 в активированных клетках [13, 15].
Опираясь на полученные результаты in vitro, в настоящей работе мы исследовали эффективность иммуностимулирующего действия комбинаций агонистов TLR4, NOD2 и TLR9 в организме лабораторных мышей. Мы исследовали влияние трехкомпонентного стимулятора иммунитета на основе агонистов TLR9, TLR4, NOD2 на продукцию цито-кинов и противоинфекционную защиту на модели заражения лабораторных мышей бактериальной инфекцией Salmonella enterica serovar Typhimurium. Действие тройного иммуностимулятора TLR9+TLR4+NOD2 сравнивали с действием одиночных агонистов TLR9, TLR4 или NOD2, или их парных сочетаний. Результаты исследования показали, что тройное и двойное сочетание агонистов TLR9, TLR4 и NOD2 (TLR4 + TLR9) вызывает синергическую продукцию иммуностимулирующих цитокинов и значительно повышает устойчивость мышей к летальному заражению Salmonella enterica.
Материал и методы
реактивы
В работе были использованы следующие агонисты рецепторов врожденного иммунитета: ODN2395 олигонуклеотид ODN 2395 (агонист TLR9-рецептора, кат.№ tlrl-2395), LPS из E. coli 055:B5 (агонист TLR4, кат.№ tlrl-pb5lps), L18-MDP (агонист NOD2-рецептора, кат.№ tlrl-lmdp).
Животные
Самки мышей линии BALB/c весом от 18 до 20 г были приобретены в питомнике «Пущино» (Институт биоорганической химии РАН, Пущино, Россия) для проведения экспериментов по оценке протективного действия агонистов PRR. Животные содержались в клетках вентилируемого изолирующего стеллажа ISOcage (Tecniplast, Италия) со сменным подстилом Rehofix MK 2000 (JRS, ФРГ) по 5 животных со свободным доступом к воде и корму. Животных содержали согласно ГОСТу 33216-14. Манипуляции с животными (отбор образов крови, заражение S. typhi) проводили с разрешения этического комитета на базе ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России с соблюдением правил стерильной работы и работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (СП 1.3.2322-08).
Для получения костно-мозговых макрофагов самки мышей линии BALB/c в возрасте 8-10 нед, приобретённые в питомнике «Столбовая» (ФГБУН НЦБМТ ФМБА России), содержались в виварии ГНЦ Институт иммунологии ФМБА согласно ГОСТ 33216-14 по 5 животных в клетках со свободным доступом к воде и корму.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Костно-мозговые макрофаги
Для культивирования клеток использовали полную среду (ПС), составленную из DMEM с 25 мМ HEPES, с добавлением коктейля заменимых аминокислот, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мM L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ ß-меркаптоэтанола и 10 мкг/мл гентамицина (все реактивы фирмы ПанЭко).
Макрофаги получали in vitro дифференцировкой клеток костного мозга в присутствии GM-CSF. Костный мозг вымывали из бедренных и больших берцовых костей мыши, эритроциты удаляли осмотическим лизисом, ядросодержащие клетки дважды отмывали PBS, после чего культивировали в полной среде с добавлением 10 нг/мл GM-CSF, на третьи сутки половину среды удаляли и добавляли новую с 10 нг/мл GM-CSF. На 7-е сутки удаляли среду с плавающими клетками, слабо адгезионные клетки смывали тёплым раствором PBS, содержащего 0,5 % BSA, адгезионные клетки заливали раствором Версена, выдерживали 1 час при 37 оС и смывали тщательным пипетированием. Фенотип макрофагов определяли по экспрессии поверхностных маркеров CDllb и CD115, содержание которых составляло не менее 95%. Примесь дендритных клеток CD11c+ составляла менее 5%.
Макрофаги инкубировали в лунках 96-луночного планшета в количестве 30000 клеток в 100 мкл в ПС в течение 24 ч при 37 оС в увлажненной атмосфере с 5 % СO2 в присутствии различных сочетаний агонистов. Каждый эксперимент проводился в двух повторах. После окончания инкубации отбирали 50 мкл надосадочной жидкости из каждой лунки и замораживали при -20 оС до момента анализа (не более 2 нед).
Измерение уровня цитокинов в культуре макрофагов
Концентрацию цитокинов определяли наборами фирмы CBA FLEX BD Biosciences: Mouse IL-12/IL-23p40 Flex Set (Кат. № 560151), Mouse MCP-1 Flex Set (Кат. №558300), Mouse IL-la Flex Set (Кат. №560157), на приборе BD FAC-SAria II с использованием программного обеспечения BD FACS Diva 6 и пакета FCAP Array Software vl.0.1.
Измерение уровня цитокинов в крови животных
Лиганды паттерн-распознающих рецепторов врожденного иммунитета и их комбинации были растворены в изотоническом фосфатно-солевом буферном растворе и в количестве 100 мкл вводились животным внутримышечно, в заднюю бедренную поверхность задней лапы. Каждой группе мышей вводили 0,1 мкг LPS, 1 мкг ODN2395, 1мкг L18-MDP, их двойные и тройную комбинации. Контрольной группе мышей вводили 100 мкл фосфатно-солевого буферного раствора.
Через 3 ч после введения лигандов производили отбор крови животных из хвостовой вены (на каждую временную точку приходилось по 3 мыши из каждой группы). В полученной сыворотке крови определяли концентрацию цитоки-нов (IL-la, IL-12, MCP-1). Для этой цели использовали набор фирмы Bio-Rad Bio-Plex Pro™ Mouse Cytokine 23-plex Assay (кат. номер M60009RDPD). Измерение концентрации цитокинов выполняли с использованием прибора MAGPIX согласно методике, предоставленной производителем.
Заражение животных летальной дозой Salmonella enterica
На основании данных, полученных на предварительном этапе, для проведения целевого эксперимента расчётная летальная доза (LD100) Salmonella enterica serovar Typhimurium (штамм IE147) для мышей была определена как 2,7 108 КОЕ/ мышь.
Ампулу, содержащую бактерии, размораживали при комнатной температуре и высевали истощающим штрихом на дифференциально-диагностическую твёрдую среду - Salmonella Shigella (SS) агар (HiMedia, Индия). Через 18 ч культивирования при 37 °C, индивидуальную колонию бактерий переносили микробиологической петлей в жидкую питательную среду Лурия-Бертани (HiMedia, Индия). После 18 ч
культивирования при 37 °C и 300 об/мин бактерии осаждали центрифугированием при 5000 об/мин 10 мин, ресуспенди-ровали в стерильном ФСБ и снова осаждали (5000 об/мин 10 мин). Полученный осадок ресуспендировали в стерильном ФСБ. Согласно полученной ранее калибровочной кривой, учитывающей оптическую плотность бактериальной суспен-дии (0D600 нм), подготовили рабочую суспензию бактерий. Бактериальную суспензию вводили перорально в объеме 0,5 мл, используя иглу для гаважа. Заражение животных проводили в боксе микробиологической безопасности II класса защиты с соблюдением правил стерильной работы и работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (СП 1.3.232208). После заражения ежедневно определяли количество живых животных в группах.
Для определения точной концентрации бактериального препарата, используемого для заражения животных, суспензию бактерий высевали на твердую дифференциально-диагностическую среду (SS агар) с целью подсчета единичных колоний.
статистическая обработка результатов
Все результаты представлены в виде средних значений и соответствующих величин стандартного отклонения. Статистическую значимость различий определяли с использованием /-критерия Стьюдента. Для сравнения кривых выживаемости отдельных групп мышей применяли логранговый критерий (Logrank test) и критерий Вилкоксона. Значения Р < 0,05 (обозначены *) считали статистически достоверными.
Результаты и обсуждение
сочетанное действие агонистов TLR4, TLR9 и NOD2 усиливает продукцию цитокинов in vitro и in vivo
Оценку иммуностимулирующих свойств различных сочетаний агонистов TLR4, TLR9 и NOD2 проводили по способности их инициировать продукцию цитокинов IL-1a, IL-12, и MCP-1 в экспериментах in vitro с использованием культуры макрофагов мыши (рис. 1, а-в) и in vivo (рис. 1, г-е).
К культуре костно-мозговых макрофагов добавляли 20 нг/ мл LPS, 1 мкг/мл L18-MDP, 1 мкг/мл ODN2395, а также их парные и тройное сочетания. Через 24 ч в культуральной среде детектировали уровень продукции IL-1a, IL-12, и MCP-1. Согласно результатам, представленным на рис. 1, а-в, среди исследуемых PRR- агонистов наиболее выраженное повышение продукции цитокинов наблюдалось после добавления LPS. В ответ на LPS статистически значимо повышалась секреция всех трёх исследованных цитокинов IL-1a (в 30 раз), IL-12 (в 12 раз) и MCP-1 (в 3 раза). L18-MDP активировал секрецию цитокинов значительно слабее: IL-1a - в 2 раза, IL-12 - в 4 раза, и MCP-1 -в 1,5 раза. ODN2395 стимулировал продукцию IL-12 (в 17 раз) и MCP-1 (в 1,8 раза). Двойные и тройное сочетания LPS, L18-MDP и ODN2395 индуцировали более интенсивную продукцию IL-12 по сравнению с ответом на индивидуальные агонисты (см. рис. 1, б). Уровень продукции IL-1a и MCP-1 в ответ на двойное или тройное сочетание агонистов не превышал такового в ответ на добавление индивидуальных агонистов (см. рис. 1, а, в). Применение сочетаний L18-MDP+ODN2395, LPS+L18-MDP или LPS+ODN2395 позволило в 5 - 75 раз усилить продукцию IL-12 макрофагами относительно уровня ответа на одиночные агонисты. В ответ на добавление тройного сочетания LPS+ODN2395+L18-MDP уровень продукции IL-12 был статистически значимо больше по сравнению с двойным сочетанием LPS+L18-MDP. Но не отличался от LPS+ODN2395 и был достоверно ниже по сравнению с комбинацией L18-MDP+ODN2395.
В экспериментах in vivo мышам внутримышечно вводили L18-MDP (1 мкг/мышь), ODN2395 (1 мкг/мышь) или LPS (0,1 мкг/мышь), или их двойные и тройное сочетания. Через 3 часа после инъекции агонистов PRR в крови подопытных животных анализировали уровень целевых цитокинов. На инъекции агонистов PRR животные ответили усиленной продукцией всех трех исследованных цитокинов (см. рис. 1, г-е).
ORIGINAL ARTICLE
Рис. 1. Уровень продукции цитокинов IL-1a , IL12, MCP-1 под действием индивидуальных агонистов TLR4, TLR9 и NOD2, их парных и тройного сочетаний.
a — в - к культуре макрофагов мыши (30 000 клеток на лунку 96-луночного планшета) добавили различные индивидуальные агонисты LPS (20 нг/мл), ОДН2395 (1 мкг/мл) и L18-MDP (1 мкг/мл), а также их двойное и тройное сочетания. В качестве контроля - клетки без активаторов (К). Через 24 ч инкубации определяли концентрацию цитокинов в культуральной среде; г — е - мышам внутримышечно вводили 0,1мкг LPS, 1 мкг ODN2395, 1 мкг L18-MDP, их двойные и тройную комбинации. Контрольной группе мышей вводили фосфатно-солевой буферный раствор (К). Через 3 ч в сыворотке крови животных определяли концентрацию целевых цитокинов. На графиках (а — е) представлены концентрации измеренных цитокинов (пг/мл). Приведены средние значения и стандартные отклонения между тремя измерениями. Достоверное повышение концентрации цитокинов в ответ на добавление сочетаний PRR-агонистов по сравнению с индивидуальными агонистами отмечено * (р < 0,05).
Как in vitro (см. рис. 1, а-в), так и in vivo (см. рис. 1, г-д) LPS оказался наиболее эффективным среди использованных агонистов PRR в отношении индукции продукции цитоки-нов. Через 3 часа после введения LPS увеличивал содержание в крови животных IL-1a (в 7 раз) (см. рис. 1, г) и MCP-1 (в 2,3 раза) (см. рис. 1, е). Продукция IL-12 в ответ на инъекцию LPS не индуцировалась. Под действием L18-MDP в крови животных в 2,3 раза взрастала продукция MCP-1 (см. рис. 1, е). ODN2395 не индуцировал накопления в крови ни одного из исследованных цитокинов.
Как и в экспериментах in vitro (см. рис 1, а-в), в организме мышей наибольший синергетический эффект от введения сочетаний агонистов наблюдался в продукции IL-12. Сочетания агонистов LPS+ODN2395и L18-MDP+ODN2395+LPS индуцировали у мышей в 2,5 раза более интенсивную продукцию IL-12 по сравнению с индивидуальными агонистами LPS, L18-MDP и ODN2395 (см. рис. 1, д). Сочетания трех L18-MDP+ODN2395+LPS и двух LPS+ODN2395 агонистов индуцировали наибольшую по интенсивности продукцию MCP-1
(см. рис. 1, е). Интересно, что уровень MCP-1 в крови мышей после введения L18-MDP+ODN2395 или L18-MDP+LPS не отличался от уровня ответа на LPS.
Исходя результатов по измерению цитокинов in vitro и in vivo следует, что совместное введение мышам агонистов TLR4-, TLR9- и NOD2-рецепторов приводит к синергиче-ской продукции IL-12 - важнейшего иммуностимулирующего цитокина, который обеспечивает эффективную активацию механизмов врожденного и адаптивного иммунитета, в частности, NK-, Th1- и цитотоксических Т клеток [16].
сочетанная стимуляция рецепторов TLR4, TLR9 и NOD2 по сравнению с индивидуальной значительно повышает противоинфекционную защиту мышей на модели летального заражения Salmonella enterica
Усиленная продукция цитокинов в организме мышей после инъекции сочетаний двух или трех агонистов TLR4, TLR9 и NOD2 (см. рис. 1) демонстрирует их эффективное иммуностимулирующее действие. На следующем этапе работы мы определили, способен ли обнаруженный синер-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Рис. 2. Влияние стимуляции рецепторов врожденного иммунитета на выживаемость мышей линии BALB/c на модели инфекции Salmonella enterica serovar Typhimurium (штамм IE147).
Соответствующим группам мышей вводили 0,1 мкг LPS, 1мкг ODN2395, 1 мкг L18-MDP, а также их двойные и тройное сочетания. Каждая группа включала по 10 животных. Через 3 ч мышами перорально вводили Salmonella enterica в количестве 3 -108 КОЕ/мышь. На протяжении 20 дней в каждой ежедневно производился подсчёт жизнеспособных животных. На графике представлены кривые выживаемости мышей для каждой экспериментальной группы. Для определения статистической значимости выживаемости животных отдельных групп применяли логранговый критерий и критерий Вилкоксона. * -p < 0,05; ** -p < 0,01.
гетический эффект, возникающий после одновременной стимуляции нескольких PRR, обеспечивать повышенную противоинфекционную защиту животных от летальных доз бактериальной инфекции.
Оценку противоинфекционной защитной активности агонистов TLR4, TLR9 и NOD2 осуществляли на модели заражения лабораторных мышей Salmonella enterica serovar Typhimurium (высоковирулентный штамм IE147). Данный вид бактерий характеризуется высокой частотой появления антибиотико-резистентных форм, кроме того, при оральном заражении он способен вызвать у мышей летальную инфекцию, близкую по патогенезу к таковой у человека [17].
Мышей линии Balb/C инфицировали перорально бактериями в дозе LD100 (3-108 КОЕ), которая была определена заранее экспериментальным путем. Описанные выше результаты наших экспериментов по продукции цитокинов в организме лабораторных мышей (см. рис. 1) свидетельствовали о значительной активации иммунитета через 3ч после инъекции агонистов. Поэтому в экспериментах по изучению устойчивости мышей к бактериальной инфекции мы вводили агонисты PRR за 3 ч до заражения животных летальной дозой Salmonella enterica. В эксперименте участвовали животные (10 мышей в группе) которым вводили индивидуальные ODN2395, LPS или L18-MDP, их парные ODN2395+LPS, L18-MDP+ODN2395, LPS+L18-MDP, или тройное ODN2395+LPS+L18-MDP сочетания. Контрольным животных проводили инфицирование без предварительного введения агонистов PRR. Ежедневно в течение 20 дней после заражения в каждой группе определяли количество выживших животных.
Результаты выживаемости инфицированных мышей представлены на рис. 2. В контрольной группе животных, инфицированных Salmonella enterica без предварительной стимуляции иммунитета агонистами PRR, на 20-й день эксперимента наблюдалась гибель 90% животных (9 из 10 мышей). Иммунотерапия агонистами PRR способствовала защите мышей от летальной дозы инфекции Salmonella enterica. Статистический анализ (критерии Log-rank тест, критерий Вилкоксона) выявил наибольшую эффективность комбинаций агонистов ODN2395+LPS (р < 0,01) и ODN2395+LPS+L18-MDP (р < 0,01) в защите мышей от сальмонелёза по сравнению с контрольной группой зараженных мышей. В группе мышей, получавших инъекции ODN2395+LPS до заражения, погибло только 20% животных (2 из 10 мышей), а после
трехкомпонентной композиции ODN2395+LPS+L18-MDP погибло 30 % мышей (3 из 10 мышей). Примечательно, что именно эти два сочетания двух и трех агонистов оказались наиболее эффективными индукторами цитокинов в организме мышей (рис. 1). Сочетание L18-MDP+LPS было менее эффективным в защите мышей от сальмонелл, выжило 50% животных (5 из 10 мышей) (р < 0,05). Следует заметить, что противоинфекционная активность тройной композиции ODN2395+LPS+L18-MDP не отличалось от активности ODN2395+LPS, однако превзошла защитное действие агонистов L18-MDP+ODN2395 (р < 0,05). Инъекция индивидуальных агонистов ODN2395, LPS или L18-MDP, а также сочетания L18-MDP+ODN2395 не вызывала статистически достоверной защиты зараженных мышей по сравнению с контролем заражения.
Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод, что сочетанная стимуляция рецепторов врожденного иммунитета (TLR4, TLR9, NOD2), посредством введения комбинаций из соответствующих агонистов LPS, ODN2395, L18-MDP способна обеспечить более эффективную защиту животных от летальной бактериальной инфекции Salmonella enterica serovar Typhimurium, по сравнению с индивидуальными агонистами. Эффективность защиты лабораторных животных агонистами PRR прямо пропорциональна уровням накопления цитокина IL-12 in vitro и in vivo. Группы животных с наибольшей выживаемостью, получившие инъекции ODN2395+LPS и ODN2395+LPS+L18-MDP, отличались наиболее высоким уровнем IL-12 в крови (см. рис. 1).
Заключение
Иммунотерапия PRR-агонистами - перспективный способ стимуляции врожденного и адаптивного иммунитета. В настоящей работе продемонстрирована высокая активность комбинации из двух ODN2395+LPS и из трех ODN2395+LPS+L18-MDP агонистов PRR в защите лабораторных животных от летальной дозы антибиотико-резистентной инфекции Salmonella enterica serovar Typhimurium. Показана усиленная продукция цитокина IL-12 in vivo и in vitro в ответ на действие этими же сочетаниями PRR-агонистов.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ 15-15-00102.
литература (пп. 1-11, 16-127 см. в REFERERNCES)
12. Пичугин А.В., Багаев А.В., Лебедева Е.С., Чулкина М.М, Атауллаханов Р.И. Синергическая продукция цитокинов дендритными клетками в ответ на одновременную активацию парами агонистов разлилчных рецепторов врожденного иммунитета. Иммунология. 2017; 38(1): 83-9.
13. Лебедева Е.С., Багаев А.В., Чулкина М.М., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. NF-kB-, но не MAPK-сигнальный путь определяет синергический ответ макрофагов на одновременную активацию двух типов рецепторов TLR4 + NOD2 или TLR9 + NOD2. Иммунология. 2017; 38(2): 76-82..
14. Лебедева Е.С., Багаев А.В., Чулкина М.М., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. Синергическое усиление транскрипции генов интерферонов 1-го типа и цитокинов при активации макрофагов и дендритных клеток сочетанием двух агонистов PRR. Иммунология. 2017; 38(1): 76-83.
15. Лебедева Е.С., Багаев А.В., Гараева А.Я. , Чулкина М.М., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. Кооперативное взаимодействие сигнальных путей рецепторов TLR4, TLR9 и NOD2 в макрофагах мыши. Иммунология. 2017; 39(1): 4-12.
references
1. Janeway C.A. Approaching the asymptote? Evolution and revolution in immunology. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1989; 54(1): 1-13.
2. Akira S., Uematsu S., Takeuchi O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 2006; 124(4): 783-801.
3. Creagh E.M., O'Neill L.A.J.. TLRs, NLRs and RLRs: a trinity of pathogen sensors that co-operate in innate immunity. Trends Immunol. 2006; 27(8): 352-7.
4. Medzhitov R., Janeway C. The Toll receptor family and microbial recognition. Trends Microbiol. 2000; 8(10): 452-6.
5. Kim Y.K., Shin J.S., Nahm M.H. NOD-like receptors in infection, immunity, and diseases. Yonsei Med. J. 2016; 57(1): 5-14.
6. Loo Y.M., Gale M. Immune Signaling by RIG-I-like Receptors. Immunity. 2011; 34(5): 680-92.
7. Trinchieri G., Sher A. Cooperation of Toll-like receptor signals in in-
ORIGINAL ARTICLE
nate immune defence. Nat. Rev. Immunol. 2007; 7(3): 179-90.
8. Thaiss C.A., Levy M., Itav S., Elinav E. Integration of Innate Immune Signaling. Trends Immunol. 2016; 37(2): 84-101.
9. Ouyang X., Negishi H., Takeda R., Fujita Y., Taniguchi T., Honda K. Cooperation between MyD88 and TRIF pathways in TLR synergy via IRF5 activation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007; 354(4): 1045-51.
10. Krummen M., Balkow S., Shen L., Heinz S., Loquai C., Probst H. C., et al. Release of IL-12 by dendritic cells activated by TLR ligation is dependent on MyD88 signaling, whereas TRIF signaling is indispensable for TLR synergy. J. Leukoc. Biol. 2010; 88(1): 189-99.
11. He H., Genovese K.J., Nisbet D.J., Kogut M.H. Synergy of CpG oli-godeoxynucleotide and double-stranded RNA (poly I:C) on nitric oxide induction in chicken peripheral blood monocytes. Mol. Immunol. 2007; 44(12): 3234-42.
12. Pichugin A.V., Bagaev A.V., Lebedeva E.S., Chulkina M.M., Ataul-lahanov R.I. Synergistic production of cytokines by dendritic cells in response to simultaneous activation by pairs of agonists of different receptors of innate immunity. Immunologiya. 2017; 38(1): 83-9.
13. Lebedeva E.S., Bagaev A.V., Chulkina M.M., Pichugin A.V., Ataul-lahanov R.I. NF-kB-but not MAPK-signal pathway determines the synergistic response of macrophages to simultaneous activation of two types of TLR4 + NOD2 or TLR9 + NOD2 receptors. Immunologiya. 2017; 38(2): 76—82.
14. Lebedeva E.S., Bagaev A.V., Chulkina M.M., Pichugin A.V., Ataul-lahanov R.I. Synergistic enhancement of gene transcription of interferon type 1 and cytokines with activation of macrophages and dendritic cells by combination of two PRR agonists. Immunologiya. 2017; 39(1): 4-12.
15. Lebedeva E.S., Bagaev A.V., Garaeva A.Ja., Chulkina M.M., Pi-chugin A.V., Ataullahanov R.I. Cooperative interaction of TLR4, TLR9 and NOD2 receptor signaling pathways in mouse macrophages. Immunologiya. 2017; 38(2): 76—82.
16. Trinchieri G. Interleukin-12 and the regulation of innate resistance and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol. 2003; 3(2):133-46.
17. DiMarzio M., Shariat N., Kariyawasam S., Barrangou R., Dudley E.G. Antibiotic Resistance in Salmonella enterica Serovar Typhimu-rium Associates with CRISPR Sequence Type. Antimicrob. Agents Chemother. 2013; 57(9): 4282-9.
Поступила 03.11.17 Принята в печать 16.03.18
