CC BY
43
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018 УДК 612.112.95.014.467:612.017.1.083
Пичугин А.В., Багаев А.В, Лебедева Е.С, Чулкина М.М, Атауллаханов Р.И.
КОМБИНИРОВАННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ТРЁХ АГОНИСТОВ РЕЦЕПТОРОВ TLR4, TLR9 И NOD2 СИНЕРГИЧЕСКИ УВЕЛИЧИВАЕТ ВЫРАБОТКУ БЕЛКОВ-ЦИТОКИНОВ МАКРОФАГАМИ МЫШИ
ФГБУ ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, 115478, Москва, Россия
Изучена возможность усиления выработки цитокинов макрофагами, дифференцированными с помощью GM-CSF из костного мозга мышей Balb/c, при воздействиях одиночных, парных и тройных сочетаний агонистов рецепторов врожденного иммунитета: TLR4, TLR9 и NOD2. Были использованы следующие агонисты: для TLR4 - LPS из E. coli серо-тип 055:B5 в концентрациях 0, 20 и 100 нг/мл, для TLR9 - ODN CpG1826, для NOD2 - L18-MDP, оба в концентрациях 0, 0,2 и 1 мкг/мл. Эффект синергизма выработки IL-12p40, IL-10 и RANTES проявляется при всех парных и при тройном сочетании агонистов TLR4, TLR9 и NOD2. Выработку IL-12p40 парные сочетания агонистов TLR4+TLR9, TLR4+NOD2 и TLR9+NOD2 усиливали соответственно в 2,4; 4 и 7,3 раза, IL-10 -в 2; 2,7 и 2 раза, RANTES - в 1,7; 2,6 и 1,9 раза. Тройное воздействие на TLR4, TLR9 и NOD2 по сравнению с соответствующим парным через TLR4+TLR9 плюс NOD2 усиливало выработку в IL-12p40 в 2,3, IL-10 2.2 раза, RANTES - 2,1 раза.
Для выработки IL-1 a, MIP-1a и MCP-1 эффект синергизма не наблюдался ни при парных ни при тройном воздействии на TLR4, TLR9 и NOD2. Максимальная выработка IL-1a наблюдалась при воздействии только на TLR4 (125±22 пг/ мл при LPS 20 нг/мл), максимальная выработка MIP-1a наблюдалась при воздействии только на TLR9 (378±66 пг/ мл при ODN CpG1826 1 мкг/мл) и максимальная выработка MCP-1 наблюдалась при воздействии только на TLR4 (8436±309 пг/мл при LPS 20 нг/мл).
Ключевые слова: макрофаги; синергизм; TLR4; TLR9; NOD2; IL-12p40; IL-10; MIP-1a.
Для цитирования: Пичугин А.В., Багаев А.В, Лебедева Е.С, Чулкина М.М, Атауллаханов Р.И. Комбинированное применение трёх агонистов рецепторов TLR4, TLR9 и NOD2 синергически увеличивает выработку белков-цитокинов макрофагами мыши. Иммунология. 2018; 39(4): 172-177. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-4-172-177
Pichugin A.V., Bagaev A.V., Lebedeva E.S., Chulkina M.M., Ataullakhanov R.I.
COMBINED ACTIVATION WITH AGONISTS OF TLR4, TLR9 AND NOD2 RECEPTORS SYNERGISTICALLY INCREASES PRODUCTION OF CYTOKINE-PROTEINS IN MOUSE MACROPHAGES
"Institute of immunology" FMBA of Russia, 115478, Moscow, Russia
The possibility of enhancing the production of cytokines by macrophages differentiated by GM-CSF from the bone marrow of Balb/c mice has been studied under influence of single, paired and triple combinations of agonists of innate immunity receptors: TLR4, TLR9 and NOD2. The following agonists were used: for TLR4 - LPS from E. coli serotype 055: B5 at concentrations of 0, 20 and 100 ng/ml, for TLR9 - ODN CpG1826, for NOD2 - L18-MDP, both in concentrations of 0, 0.2 and 1 |jg/ml. The synergism of IL-12p40, IL-10 and RANTES production is manifested in all paired and triple combinations of the TLR4, TLR9 and NOD2 agonists. Under influence of paired combinations of TLR4+TLR9, TLR4+NOD2 and TLR9+NOD2 agonists the production of IL-12p40 was increased 2.4, 4 and 7.3 times, of IL-10 - 2, 2.7 and 2 times, and of RANTES - 1.7; 2.6 and 1.9 times, respectively. The triple TLR4+TLR9+NOD2 agonistic composition induced 2,3-fold production of IL-12p40, 2.2-fold of IL-10, and 2.1-fold of RANTES as compared to the sum of responses to TLR4+TLR9 pair plus the one to NOD2.
Neither paired nor triple combinations of TLR4, TLR9 and NOD2 agonists induced synergistic production of IL-1 a, MIP-1a or MCP-1. The maximum production of IL-1a was observed upon exposure to TLR4 alone (125 ± 22 pg/ml at LPS 20 ng/ml), the maximum production of MIP-1a was observed upon exposure to TLR9 alone (378 ± 66 pg ml for ODN CpG1826 1 jg/ml) and the maximum production of MCP-1 was observed upon exposure to TLR4 alone (8436 ± 309 pg/ml at LPS 20 ng/ml).
Keywords: macrophages; synergy; TLR4; TLR9; NOD2; IL-12p40; IL-10; MIP-1a.
For citation: Pichugin A.V., Bagaev A.V., Lebedeva E.S., Chulkina M.M., Ataullakhanov R.I. Combined activation with agonists of TLR4, TLR9 AND NOD2 receptors synergistically increases production of cytokine-proteins in mouse macrophages. Immunologiya. 2018; 39(4): 172-177. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-4-172-177
For correspondence: PichuginAleksey Vasil'evich, Cand. Phys. Math. Sci., leading researcher of the laboratory of immunity activation "Institute of immunology" of the Federal medical and biological Agency of Russia, E-mail: [email protected].
Ataullakhanov Ravshan, http://orcid.org/0000-0002-4767-6409 Aleksey Pichugin, http://orcid.org/ 0000-0001-5356-3331 Alexander Bagaev., http://orcid.org/0000-0002-8680-854X Marina Chulkina, http://orcid.org/ 0000-0003-2840-937X
Для корреспонденции: Пичугин Алексей Васильевич, канд. физ.-мат. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории активации иммунитета ФГБУ ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, E-mail: [email protected].
ORIGINAL ARTICLE
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgments. The work was supported by the grant of RPF 15-15-00102.
Received 17.07.17 Accepted 16.08.17
введение
Клетки иммунной системы способны различать структурные компоненты патогенных микроорганизмов, что обеспечивает мгновенное распознавание внедрения чужеродного объекта и быстрый иммунный ответ. Это осуществляется за счёт специальных рецепторов, распознающих консервативные молекулярные структуры бактерий, вирусов, грибов, так называемых «pattern recognition receptors» (PRR) [1]. В настоящее время выделяют шесть типов рецепторов врождённого иммунитета: Toll-подобные рецепторы (TLRs) - широкий класс мембранных и эндосомных рецепторов, C-type lectin-подобные рецепторы (CLRs) - мембранные лектиновые рецепторы, NOD-подобные рецепторы (NLRs) - цитоплазматические рецепторы, реагирующие на многие микробные и не микробные стимулы, RIG-I-подобные рецепторы (RLRs) - цитоплазматические сенсоры на РНК, А1М2-подобные рецепторы (ALRs) - цитоплазматические сенсоры на ДНК и OAS-подобные рецепторы (OLRs) - цитоплазматические сенсоры на нуклеиновые кислоты [2]. Очевидно, такая многоуровневая детекция должна иметь биологическую целесообразность и в настоящее время наука вплотную приступает к её разгадке. [3]. Для валидации выдвигаемых гипотез необходимы многочисленные экспериментальные данные о реакциях иммунных клеток на комбинированные воздействия через рецепторы врождённого иммунитета. Реакции иммунных клеток на парные воздействия через PR-рецепторы достаточно широко изучены [4]. Статей об эффективности одновременного воздействия через три рецептора крайне мало, но есть данные о том, что одновременное применение TLR4+TLR7+TLR9-агонистов повышает выработку специфических антител [5].
В данной работе мы изучили выработку цитокинов макрофагами мыши при тройном сочетании агонистов TLR4, TLR9 и NOD2. Такой набор агонистов может имитировать реакцию клетки на грамотрицательные бактерии: TLR4, расположенный на внешней мембране, реагирует на LPS бактериальной стенки [6], TLR9, находящийся в эндосоме, детектирует неметилированные участки CG бактериальной ДНК [7, 8], NOD2 осуществляет ответ как на грамнегативные, так и грампозитив-ные бактерии путём распознавания мурамил-дипептида, входящего в состав пептидогликана бактериальной стенки [9]. Выяснение возможности и спектра цитоки-нов, которые синергически вырабатывают макрофаги при воздействии через три рецептора врождённого иммунитета может иметь как фундаментальное значение для выяснения механизмов регуляции, так и прикладное для разработки новых адъювантов.
Материал и методы
В работе были использованы следующие агонисты рецепторов врождённого иммунитета: ODN CpG1826 (агонист TLR9-рецептора, Кат.№ tlrl-1826, Invivogene), LPS из E. coli серотип 055:B5 (агонист TLR4, Sigma, L-2880), L18-MDP (агонист NOD2-рецептора Кат.№ tlrl-lmdp, Invivogene). Рекомбинантный гранулоцитар-
ный макрофагальный колониестимулирующий фактор мыши, (GM-CSF) (Кат. № 576306, Biolenend). Концентрацию цитокинов определяли наборами фирмы CBA FLEX BD Biosciences: Mouse IL-12/IL-23p40 Flex Set (Кат. № 560151), Mouse IL-10 Flex Set (Кат. № 558296), Mouse MCP-1 Flex Set (Кат. № 558300), Mouse IL-1a Flex Set (Кат. № 560157), Mouse MIP-1a(CCL3) Flex Set (Кат.№558449), Mouse RANTES Flex Set (Кат. № 558345) на приборе BD FACSAria II с использованием программного обеспечения BD FACS Diva 6 и пакета FCAP Array Software v1.0.1.
Для культивирования клеток использовали полную среду (ПС), составленную из DMEM с 25 мМ HEPES, с добавлением коктейля заменимых аминокислот, 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мM ¿-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ Р-меркаптоэтанола и 10 мкг/мл гентамицина (все реактивы фирмы ПанЭко).
Мышей линии BALB/c в возрасте 8-10 нед, полученных из питомника «Столбовая», содержали на стандартной диете в стандартных условиях вивария Института иммунологии. Макрофаги получали in vitro дифференцировкой клеток костного мозга в присутствии GM-CSF. Костный мозг вымывали из бедренных и больших берцовых костей мыши, эритроциты удаляли осмотическим лизисом, ядросодержащие клетки дважды отмывали PBS, после чего культивировали в полной среде с добавлением 10 нг/мл GM-CSF, на 3-и сутки половину среды удаляли и добавляли новую с 10 нг/ мл GM-CSF. На 7-е сутки удаляли среду с плавающими клетками, слабо адгезионные клетки смывали теплым раствором PBS, содержащего 0,5 % BSA, адгезионные клетки заливали раствором Версена, выдерживали 1 ч при 37 оС и смывали тщательным пипетированием. Фенотип макрофагов определяли по экспрессии поверхностных маркеров CD11b и CD115, содержание которых составляло не менее 95 %. Примесь дендритных клеток CD11c+ составляла менее 5 %.
Макрофаги инкубировали в лунках 96-луночного плейта в количестве 30 000 клеток в 100 мкл в ПС в течение 24 ч при 37 оС в увлажнённой атмосфере с 5 % СО, в присутствии различных сочетанной агонистов. Все образцы были раскапаны в дублях. После окончания инкубации отбирали 50 мкл надосадочной жидкости из каждой лунки и замораживали при -20 оС до момента анализа (не более 2 нед).
Усиление от парного воздействия вычисляли как отношение отклика при одновременном добавлении двух агонистов к сумме откликов от соответствующих концентраций одиночных агонистов. Усиление от тройного воздействия вычисляли как отношение отклика при одновременном добавлении TLR4, TLR9 и NOD2 агони-стов к сумме откликов от соответствуюших концентраций пары TLR4+TLR9 и соответствущей концентрации NOD2 агониста. Статистическую обработку проводили с помощью пакета STATISTICA v.7.0 (StatSoft Inc.), достоверность отличий оценивали по непараметрическому критерию Уилкоксона-Манна-Уитни (Wilcoxon-Mann-Whitney test, WMW).
Иммунология. 2018; 39(4)
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-4-172-177 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
IL-12р40, pg/m
A
6000 4000 2000 0
LPS, ng/ml
IL-12p40, pg/hnl
B
CpG, ug/m l
6000 4000 2000 0
LPS, ng/m l
I L-12p40, pg/hnl 2Л*
C
6000 4000 2000 0
CpG, ug/m l
LPS, ng/m l
IL-10, pg/ml
D
IL-10, pg/ml
1200
\ 900
600
300
CpG, ug/ml
0
100 LPS, ng/m l
E
IL-10, pg/ml
CpG, ug/m l
1200 900 600 300 0
0
LPS, ng/m l
F
1200 900 600 300 0
CpG, ug/m l
LPS, ng/m l
RANTE.S pg/ml —
G
6000 4000 2000 0
RANTE.S pg/ml -
CpG, ug/m l
LPS, ng/m l
H
CpG, ug/m l
6000 4000 2000
LPS, ng/m l
RANTE.S pg/ml -
,1.6 ^f 6000 0*
4000 2000 0
100
CpG, ug/m l
LPS, ng/m l
L18-MDP 0 мкг/мл L18-MDP 0,2 мкг/мл L18-MDP 1 мкг/мл
Рис. 1. Усиление выработки IL-12p40 (А-C), IL-10 (D-E) и RANTES (G-I) макрофагами мыши костномозгового происхождения при комбинированном воздействии агонистов TLR4, TLR9 и NOD2-рецепторов.
По оси x -концентрация агониста TLR4 (LPS) в культуральной среде, нг/мл, по осиy -концентрация агониста TLR9 (ODN CpG1826) в культуральной среде, мкг/мл; по оси ординат - концентрация цитокина в культуральной среде, пг/мл. Концентрация агониста NOD2 (L18-MDP) равна 0 (A, D, G) или равна 0,2 мкг/мл (B, E, H) или равна 1 мкг/мл (C, F, I).
Здесь и на рис. 2: макрофаги инкубировали в количестве 30 000 на лунку 96-луночного планшета в течение 24 ч в присутствии различных концентраций агонистов TLR4, TLR9 и NOD2-рецепторов и определяли концентрацию цитокинов в культуральной среде.
Коэффициенты отношения двойного воздействия относительно суммы соответствующих парных воздействий приведены курсивом, а отношение тройного воздействия относительно парного через TLR4+TLR9 плюс NOD2 приведены прямым жирным шрифтом. * -p < 0,05.
результаты
Комбинированное воздействие через TLR4, TLR9 и NOD2 усиливает продукцию IL-12p40, IL-10 и RANTES
Спонтанная продукция IL-12p40 макрофагами после инкубации составляла 22 ±15 пг/мл, добавление одиночных агонистов существенно стимулировало продукцию IL-12p40: LPS в максимально использованной концентрации 100 нг/мл увеличивал продукцию в 15 раз до 329 ± 122 пг/мл, ODN CpG в максимально использованной концентации 1 мкг/мл увеличивал продукцию IL-12p40 в 93 раза до 2029 ± 189 пг/мл, а L18-MDP в максимально использованной концентации 1 мкг/мл увеличивал продукцию IL-12p40 в 47 раз до 1035 ± 48 пг/мл. Парное воздействие TLR4 и TLR9 агонистами давало
усиление в 1,5-2,4 раза относительно суммы одиночных воздействий, максимальный коэффициент усиления 2,4 достигался при концентрациях агонистов ODN CpG 0,2 мкг/мл и LPS 20 нг/мл. Парные сочетания TLR4-NOD2 агонистов также давали усиление в 1,3-4 раза, максимальный коэффициент 4 достигался при концентрациях агонистов L18-MDP 0,2 мкг/мл и LPS 20 нг/мл. И, наконец, парные сочетания TLR9+NOD2 агонистов давали усиление в 3-7,3 раза, максимальный коэффициент 7,3 достигался при концентрациях агонистов L18-MDP 0,2 мкг/мл и ODN CpG 0,2 мкг/мл. Возникает вопрос, может ли тройное воздействие еще больше усилить выработку IL-12p40. Оказалось, что тройное воздействие на TLR4, TLR9, NOD2 по сравнению с соответствующим
ORIGINAL ARTICLE
IL-1, pg/ml
A
200 150 100 50 0
CpG, ug/ml
LPS, ng/m l
IL-1, pg/ml
B
200 150 100 50 0
CpG, ug/ml
LPS, ng/m l
IL-1, pg/ml
C
CpG, ug/ml
200 150 00 50 0
0
LPS, ng/m l
MIP-1 a, pg/ml_
D
MIP-1 a, pg^ml
500 400 300 200 100 0
CpG, ug/m l
LPS, ng/ml
E
MIP-1 a, pg^ml
F
CpG, ug/m l
500 400 300 200 100 0
100, LPS, ng/m l
500 400
0.6 0.5* 05*
0-9 0.6
nU. 0.6i 300
200
100 0
CpG, ug/ml
LPS, ng/m l
MCP-1, pg/ml
G
mcp-1 , pg/ml
H
MCP-1, pg/m l
CpG, ug/m l
-ъ-ТГв*- a."""' 12000
-0.6* 0 6 o:6t,.
9000 6000 3000 0
LPS, ng/ml
CpG, ug/m l
no 12000
0 9000
6000 3000 0
LPS, ng/m l
0.7 12000 0-7 0.7
9000 6000 3000 0
CpG, ug/m l
LPS, ng/m l
L18-MDP, 0 мкг/мл
L18-MDP 0,2 мкг/мл
L18-MDP 1 мкг/мл
Рис. 2- Отсутствие усиления выработки IL-1a (А-C), MIP-1a (D-E) и MCP-1 (G-I) макрофагами мыши костномозгового происхождения при комбинированном воздействии агонистов TLR4, TLR9 и NOD2-рецепторов.
По оси x -концентрация агониста TLR4 (LPS) в культуральной среде, нг/мл, по оси y -концентрация агониста TLR9 (ODN CpG1826) в культуральной среде, мкг/мл, ось ординат - концентрация цитокина в культуральной среде, пг/мл. Концентрация агониста NOD2 (L18-MDP) равна 0 (A, D, G) или равна 0,2 мкг/мл (B, E, H) или равна 1 мкг/мл (C, F, I).
парным через TLR4+TLR9 плюс NOD2 давало усиление в 1,4-2,3 раза, максимальный коэффициент 2,3 достигался при концентрациях агонистов LPS 20 нг/мл, ODN CpG 0,2 мкг/мл и L18-MDP 0,2 мкг/мл. Однако следует отметить, что максимальный сигнал, равный 6157 ± 130 пг/мл, что превышает исходный уровень в 281 раз, был получен при концентрациях ODN CpG 1 мкг/мл и L18-MDP 1 мкг/мл и нулевой концентрации LPS.
Спонтанная продукция IL-10 макрофагами не детектировалась, LPS в концентации 100 нг/мл увеличивал продукцию IL-10 до 195 ± 14 пг/мл, ODN CpG в концентации 1 мкг/мл увеличивал продукцию IL-10 до 54 ± 1,0 пг/мл и L18-MDP концентации 1 мкг/мл увеличивал продукцию IL-10 до 136 ± 46 пг/мл. Парные сочетания TLR4+TLR9 агонистов давали усиление продукция IL-10 в 1,4-2,0 раза, максимальный коэффициент
2,0 достигался при концентрациях агонистов ODN CpG 1 мкг/мл и LPS 100 нг/мл. Парные сочетания TLR4-NOD2 агонистов давали усиление продукция IL-10 в 1,7-2,7 раза, максимальный коэффициент 2,7 достигался при концентрациях агонистов L18-MDP 0,2 мкг/ мл и LPS 100 нг/мл. Парные сочетания TLR9+NOD2 агонистов давали усиление в 1,3-2,0 раза, максимальный коэффициент 2,0 при концентрациях агонистов L18-MDP 0,2 мкг/мл и ODN CpG 0,2 мкг/мл. Тройное воздействие по сравнению с парными давало усиление в 1,3-2,2, максимальный коэффициент 2,2 достигался при концентрациях агонистов LPS 20 нг/мл, ODN CpG 0,2 мкг/мл и L18-MDP 0,2 мкг/мл. Максимальный сигнал, равный 912 ± 20 пг/мл, был получен при тройном воздействии максимальных концентраций всех агони-стов.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Спонтанная продукция RANTES макрофагами составляла 24 ± 4 пг/мл. Одиночные агонисты значительно усиливали продукцию RANTES: LPS в концентации 100 нг/мл увеличивал продукцию в 61 раз до 1454 ± 169 пг/мл, ODN CpG в концентации 1 мкг/мл увеличивал продукцию RANTES в 39 раз до 922 ± 35 пг/мл, а L18-MDP в концентации 1 мкг/ мл увеличивал продукцию RANTES в 25 раз до 599 ± 189 пг/мл. Воздействие двух агонистов TLR4 и TLR9 давали усиление в 1,5-1,7 раза относительно суммы одиночных воздействий, максимальный коэффициент усиления 1,7 достигался при концентрациях агонистов ODN CpG 1 мкг/мл и LPS 20 нг/мл. Парные сочетания TLR4+NOD2 агонистов также давали усиление в 1,8-2,6 раза, максимальный коэффициент 2,6 достигался при концентрациях агонистов L18-MDP 0,2 мкг/мл и LPS 100 нг/мл. И, наконец, парные сочетания TLR9+NOD2 агонистов давали усиление в 1,2-1,9 раза, максимальный коэффициент 1,9 достигался при концентрациях агонистов L18-MDP 0,2 мкг/ мл и ODN CpG 0,2 мкг/мл. Тройное воздействие на TLR4, TLR9 и NOD2 по сравнению с соответствующим парным через TLR4+TLR9 плюс NOD2 давало усиление в 1,4-2,1, максимальный коэффициент 2,1 достигался при концентрациях агонистов LPS 20 нг/ мл , ODN CpG 0,2 мкг/мл и L18-MDP 0,2 мкг/мл. Максимальный сигнал, равный 4728 ± 130 395 пг/мл, что превышает исходный уровень в 198 раз, был получен при максимальной концентрации всех агонистов.
Комбинированное воздействие через TLR4, TLR9 и NOD2 не усиливает продукцию IL-1a, MIP-1a и MCP-1 по сравнению с действием одиночных агонистов.
Совсем другой тип ответа макрофагов на комбинированное воздействие через TLR4, TLR9 и NOD2 мы наблюдали для таких цитокинов и хемокинов как IL-1a, MIP-1a и MCP-1. Спонтанная продукция IL-1a макрофагами была очень низкой - 3,8 ± 0,1 пг/мл и достаточно слабо стимулировалась всеми агонистами. Так, LPS в концентации 20 нг/мл увеличивал продукцию IL-1a до 125 ± 22 пг/мл, ODN CpG в концентации 1 мкг/мл практически не увеличивал продукцию IL-1a (до 10 ±0,7 пг/мл) и L18-MDP в концентации 1 мкг/мл увеличивал продукцию IL-1a до 99 ± 20 пг/мл. Парные сочетания агонистов (TLR4+TLR9) и (TLR4+NOD2) не давали усиление продукции IL-1a по сравнению с ответами на одиночные воздействия. Парные сочетания TLR4+NOD2 агонистов давали усиление в 1,5 раза при концентрациях агонистов L18-MDP 0,2 мкг/мл и LPS 100 нг/мл. Тройное воздействие по сравнению с парными давало усиление в 1,5 при концентрациях агонистов LPS 100 нг/мл, ODN CpG 0,2 мкг/мл и L18-MDP 0,2 мкг/ мл. Однако абсолютное значение ответа было практически сравнимо с ответом только на LPS в концентрации 20 нг/мл.
Спонтанная продукция MIP-1a макрофагами составляла 26 ± 5 пг/мл, LPS в концентации 100 нг/мл увеличивал продукцию MIP-1a в 5 раз до 150 ± 4 пг/ мл, ODN CpG в концентации 1 мкг/мл увеличивал продукцию MlP-1a в 14 раз до 378 ± 66 пг/мл и L18-MDP в концентации 1 мкг/мл увеличивал продукцию MIP-1a в 6 раз до 165 ± 105 пг/мл. Ни одно из парных сочетаний агонистов (TLR4+TLR9), (TLR4+NOD2) и (TLR9+NOD2) не давало усиления продукции MIP-1a по сравнению с воздействим одиночных агонистов.
Также и тройное воздействие по сравнению с парными не давало усиление и даже не превосходило ответа на одиночное воздействие через TLR9. Максимальный сигнал выработки MIP-1a (378 ± 66 пг/мл) был получен при одиночном воздействии на TLR9 ODN CpG в концентации 1 мкг/мл.
Спонтанная продукция MCP-1 макрофагами была очень высокой и составляла 2331 ± 251 пг/мл. Одиночные лиганды увеличивали выработку, но коэффициент усиления был небольшой из-за высокого спонтанного производства. Так, LPS в концентации 100 нг/мл увеличивал продукцию MCP-1 3,6 раза до 8436 ± 309 пг/мл, ODN CpG в концентации 1 мкг/мл увеличивал продукцию MCP-1 в 1,8 раза до 4274 ± 537 пг/мл и L18-MDP в концентации 1 мкг/ мл увеличивал продукцию MCP-1 1,8 до 4243 ± 644 пг/мл. Ни одно из парных сочетаний агонистов (TLR4+TLR9), (TLR4+NOD2) и (TLR9+NOD2) не давало усиление продукции MCP-1 по сравнению с воздействием одиночных агонистов. Также и тройное воздействие по сравнению с парными не давало усиление и даже не превосходило ответа на одиночное воздействие через TLR4. Максимальный сигнал выработки MCP-1 (8436±309 пг/мл) был получен при одиночном воздействии на TLR4 LPS в концентации
1 мкг/мл.
Обсуждение
Ранее нами был получен результат, что все парные сочетания агонистов TLR4+TLR9, TLR4+NOD2 и TLR9+NOD2 дают значительное синергическое усиление выработки IL-12p40 дендритными клетками костномозгового происхождения [10]. Аналогичные данные получены и в данной работе на костномозговых макрофагах: парные сочетания TLR4+TLR9, TLR4+NOD2 и TLR9+NOD2 давали коэффициент синергизма от 2,4 до 7,3. Новым результатом было установление возможности дальнейшего усиления ответа при сочетании одновременно всех трёх агонистов. Данное усиление было возможно в области небольших концентраций всех трёх агонистов LPS 20 нг/мл, ODN CpG 0,2 мкг/мл и L18-MDP 0,2 мкг/мл (коэффициент усиления 2,3). Для IL-10 и RANTES результаты, полученные ранее на дендритных клетках [10] и в данной работе на макрофагах существенно отличаются: на дендритных клетках парные сочетания TLR4, TLR9 и NOD2 агонистов практически не давали синергического усиления продукции IL-10 и RANTES. Воздействие же на парные сочетания агонистов TLR4+TLR9, TLR4+NOD2 и TLR9+NOD2 на макрофаги усиливало производство IL-10 - в 2, 2,7 и
2 раза, а RANTES - в 1,7, 2,6 и 1,9 раза. Тройное воздействие на TLR4, TLR9 и NOD2 по сравнению с соответствующим парным через TLR4+TLR9 плюс NOD2 усиливало выработку IL-10 в 2,2 раза, а RANTES - в 2,1 раза.
Обратное соотношение было обнаружено для хемоки-нов MIP-1a и MCP-1: все парные сочетания TLR4, TLR9 и NOD2 агонистов на дендритных клетках давали синергическое усиление продукции MIP-1a и MCP-1 [10], а на макрофагах синергизм как парных, так и тройного воздействия отсутствовал.
Разница в ответах на комбинированные воздействия через рецепторы врождённого иммунитета дендритных клеток и макрофагах может быть обусловлена различием в рецепции и внутриклеточного взаимодействия сигнальных путей. Так, в работе Пащенкова М.В. и
соавт. [11] обнаружена разница в кинетике производства цитокинов и хемокинов дендритными клетками и макрофагами человека при активации через NOD1 и TLR4. Разница в интеграции ответа между дендритными клетками и макрофагами может быть также обусловлена и на уровне рецепции. Guang Sheng Ling и соавт. [12] обнаружили, что в дендритных клетках ответ на LPS, транслируемый через TLR4, дополнительно усиливается сигналом через интегрин CD11b, чего не происходит в макрофагах. Выявленные отличия в производстве IL-10, RANTES, MIP-1a и MCP-1 при комбинированном воздействии через TLR4, TLR9 и NOD2-рецепторы между дендритными клетками и макрофагами могут отражать различную роль этих клеток в реакции на бактериальную инфекцию и требуют дальнейшего изучения.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Работа была выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ 15-15-00102.
ЛИТЕрАТУрА (пп. 1—9, 12 см. в REFERENCES)
10. Пичугин А.В., Багаев А.В., Лебедева Е.С., Чулкина М.М. Си-нергическая продукция цитокинов дендритными клетками в ответ на одновременную активацию парами агонистов разлилч-ных рецепторов врожденного иммунитета. Иммунология. 2017; 38(2): 118—23.
11. Пащенков М.В. и др. Особенности индукции провоспалитель-ных генов в дендритных клетках и макрофагах под действием глюкозаминилмурамилтрипептида грамотрицательных бактерий. Иммунология. 2013; 34(1): 10—5.
references
1. Himanshu Kumar, Taro Kawai, Shizuo Akira. Pathogen Recognition by the Innate Immune System. Int. Rev. Immunol. 2011; 30: 16-34. doi: 10.3109/08830185.2010.529976.
2. Christoph A. Thaiss et al, Integration of Innate Immune Signal-
ORIGINAL ARTICLE
ing, Trends in Immunology. 2016; 37(2): 84-101. http://dx.doi. org/10.1016/j.it.2015.12.003
3. Sky W. Brubaker et al. Innate Immune Pattern Recognition: A Cell Biological Perspective. Annu. Rev. Immunol. 2015; 33: 10.1-10.34. doi:10.1146/annurev-immunol-032414-112240.
4. Tan R.S., Ho B., Leung B.P., Ding J.L. TLR cross-talk confers specificity to innate immunity. Int. Rev. Immunol. 2014; 33(6): 443-53, d oi:10.3109/08830185.2014.921164
5. Madan-Lala R., Pradhan P., Roy K. Combinatorial Delivery of Dual and Triple TLR Agonists via Polymeric Pathogen-like Particles Syn-ergistically Enhances Innate and Adaptive Immune Responses. Sci Rep. 2017; 7(1): 2530. Available from: http://www.nature.com/ar-ticles/s41598-017-02804-y.
6. Poltorak A. et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 1998; 282(5396): 2085—8.
7. Arthur M. Krieg et al CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. Nature. 1995; 374: 546—9. | doi:10.1038/374546a0
8. Hiroaki Hemmi A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature. 2000; 408: 740—5.
9. Kufer T.A., Banks D.J., Philpott D.J. Innate Immune Sensing of Microbes by Nod Proteins. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2006; 1072: 19-27 (). doi: 10.1196/annals.1326.020.
10. Пичугин А.В., Багаев А.В., Лебедева Е.С., Чулкина М.М. Синергическая продукция цитокинов дендритными клетками в ответ на одновременную активацию парами агонистов разлилчных рецепторов врожденного иммунитета. Иммунология. 2017; 38(2): 118—23.
11. Пащенков М.В. и др. Особенности индукции провоспалитель-ных генов в дендритных клетках и макрофагах под действием глюкозаминилмурамилтрипептида грамотрицательных бактерий. Иммунология. 2013; 34(1): 10—5.
12. Guang Sheng Ling et al. Integrin CD11b positively regulates TLR4-induced signalling pathways in dendritic cells but not in macrophages. Nature communications.2014; 5: 3039. DOI: 10.1038/ncomms4039.
Поступила 17.07.17 Принята в печать 16.08.17
