Скрининг микроорганизмов с целлюлазной и лакказной активностью Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 577.152.9; 577.154

Л. Х. Халимова (к. техн. н., доц.), Н. И. Петухова (к. биол. н., доц.), Т. С. Ногина (студ.), Л. М. Султанова (ст. преп.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)

S < I» I »

Скрининг микроорганизмов с целлюлазнои и лакказнои

активностью

Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail: [email protected]

L. H. Khalimova, N. I. Petukhova, T. S. Nogina, L. M. Sultanova, V. V. Zorin

Screening of microorganisms with cellulase and laccase activity

Ufa State Petroleum Technical University 1, Kosmonavtov Str., 450062 Ufa, Russia; рh. (347)2 431935; е-mail: [email protected]

Исследована целлюлазная и лакказная активность грибов, способных расти на лигноцеллю-лозных растительных материалах (древесных опилках, лузге подсолнечника, шишках хвойных деревьев). Выявлены культуры грибов, одновременно продуцирующие внеклеточные лак-казы и целлюлазы.

Ключевые слова: целлюлазная и лакказная активность; грибные продуценты; скрининг.

Вопросы ферментативной переработки целлюлозы рассматриваются в глобальном масштабе в связи с необходимостью защиты окружающей среды от загрязнения целлюлозо-содержащими отходами производств. В первую очередь, это касается образующейся в огромных масштабах лигнифицированной целлюлозы, которой богата одревесневшая растительная ткань, представляющая собой систему взаимопроникающих полимеров — целлюлозы и лигнина

Особенно актуальными являются процессы биоконверсии лигнифицированной целлюлозы — дешевого возобновляемого источника сырья для получения биотоплив второго поколения (биоэтанола, биобутанола, микробиоди-зеля) 2.

Для интенсификации этих процессов требуются недорогие эффективные ферментные

3

препараты лакказ, окисляющих лигнин а также целлюлаз, способных осуществлять глубокую деструкцию кристаллической целлюлозы 2.

С целью поиска продуцентов таких ферментов была исследована целлюлазная и лак-казная активность 14 культур мицелиальных

Дата поступления 08.12.09

The cellulase and laccase activity of fungi, which are able to grow on lignocellulose-containing vegetable material (sawdust, sunflower husk, strobiles) was researched. The cultures of fungi prodused extracellular laccase and cellulase simultaneously were found.

Key words: cellulase and laccase activity; fungal producers; screening.

грибов, способных расти на лигноцеллюлоз-ных материалах (древесных опилках, лузге подсолнечника, шишках хвойных деревьев).

Исследование способности препаратов внеклеточных ферментов грибов осуществлять гидролиз карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) показало, что большинство из них проявляет КМЦ-целлюлазную активность (рис. 1). Наиболее эффективно гидролизовали субстрат препараты грибов АИЗ-5 и АИЗ-12.

При исследовании лакказной активности внеклеточных препаратов ферментов в процессе окисления модельного субстрата (пирокатехина) было обнаружено, что все грибы синтезируют лакказы (рис. 2). Наибольшую окислительную активность показали культуры АИЗ-14 и АИЗ-21.

Сравнение результатов тестирования цел-люлазной и лакказной активности наиболее активных препаратов грибов показывает, что грибы АИЗ-14 и АИЗ-21 — продуценты лакказ практически не синтезируют целлюлазы. В то же время, грибы АИЗ-5 и АИЗ-12 являются продуцентами не только целлюлаз, но и ферментов с лакказной активностью. При этом лакказная активность данных микроорганизмов лишь на 30% меньше, чем у наиболее активного гриба АИЗ-12.

л н о о X ю X н и

CÖ «

eö X

!3

ч 2 ч ч

(U

3

Sä

X л

4

(U

н К о о к н

о

100 9080 7060 50 4030 2010 0

1

И

es m

rn vo о oo ON о

es m

rn vo о oo on

rooooooooooooooooo

о ^

CS CS

00 00

К К

< <

Рис. 1. Относительные значения целлюлолитической активности препаратов внеклеточных ферментов исследуемых грибов.

Sä

х

SS

и и

eö Ч

Sä

к л

ч

(U

н К о о к н

о

л н о о X ю К н и

CÖ

100 90807060 50 40 302010 0

оо

К

<

(Nm^mvOt^OOC^O

nnnnnnnn

к к к к к к к к

<<<<<<<<

es m

rn vo о oo c^ о i

'—'—'—'—1 '—<N <N

oooooooooooooooooooooooo

к к к к к к к к к к к к

Рис. 2. Относительная лакказная активность исследуемых грибов.

Таким образом, найдены новые штаммы грибов, продуцирующие внеклеточные ферменты с лакказной и целлюлазной активностью, представляющие интерес для создания методов переработки лигноцеллюлозной биомассы в сырье для производства биотоплив второго поколения с использованием существующих биотехнологий.

Материалы и методы

Выделение грибных культур и выращивание проводили на питательных средах: среда Чапека (г/л): сахароза — 20.0; NaNO3 — 2.0 K2HPO4 - 1.0; MgS04-7H20 - 0.5; KCl - 0.5 FeS04-7H20 - 0.1; CaC03 - 3.0; агар - 20.0 среда Гетчинсона (г/л): NaN03 - 2.5; K2HP04 -1.0; MgS047H20 - 0.3; NaCl - 0.1; FeCl3 -0.01; CaCl2 - 0.1 в присутствии 2-5 % древесно-растительного материала 1.

Целлюлолитическую активность микроорганизмов определяли по скорости образования редуцирующих сахаров 4. За единицу целлю-лолитической активности исследуемого гриба принимали количество фермента, образующее 1 микромоль восстанавливающих сахаров в реакции гидролиза 1% Ыа-КМЦ в 0.1 М ацетатном буфере за 1 мин в пересчете на 1 мг вносимого белка.

Лакказную активность определяли спект-рофотометрически при 410 нм, используя в качестве хромогенного субстрата 10 мМ раствор пирокатехина в 0.1М Ыа-ацетатном буфере рН 5.0) согласно 5. За условную единицу лакказной активности принимали увеличение оптической плотности 1 мл реакционной смеси за 1 мин, пересчитанную на 1 мг вносимого белка. Белок оценивали методом Лоури 6.

Литература

1. Проблемы биоконверсии растительного сырья / отв. ред. Г. К. Скрябин.— М:Наука.— 1986.— 296 с.

2. Скомаровский А. А., Марков А. В., Гусаков А.

B., Кондратьева Е. Г., Окунев О. Н., Беккаре-вич А. О., Матыс В. Ю., Синицын А. П. // Прикл. биох. микробиол.— 2006.— Т. 42, №6.-

C. 674.

3. Ревин В. В., Кадималиев Д. А., Шутова В. В., Самуилов В. Д. // Прикл. биохим. микроби-ол.- 2002.- Т. 38, № 5.- С. 529.

4. Целлюлазы микроорганизмов /Отв. ред В. Л. Кретович.- М: Наука.- 1981.- 213 с.

5. Королева О. В., Явметдинов И. С., Шлеев С. В., Степанова Е. В., Гаврилова В. П. // Биохимия.- 2001.- Т. 66, №6.- С. 762.

6. Практикум по биохимии /под ред. С. Е. Северина, Г. А. Соловьевой М: Изд-во МГУ.-1989.- 509 с.

Работа выполнена при поддержке аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 годы), проект №2.1.2/5048 «Создание научных основ хемо-, регио- и энантионаправленной биотрансформации органических соединений и биоокисления сульфидов металлов»