CC BY
38
УДК 579.582.28
Л. Х. Халимова (к.т.н., доц.), Л. И. Закирова (студ.), Н. И. Петухова (к. биол.н., доц.), В. В. Зорин (чл-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
Исследование влияния условий культивирования микромицетов на их лакказную активность
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и химической технологии 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail: [email protected]
L. Kh. Khalimova, L. I. Zakirova, N. I. Petukhova, V. V. Zorin
Research of influence of cultivation conditions of micromycetes on their laccase activity
Ufa State Petrolium Technical Univercity 1, Kosmonavtov Str, 450062 Ufa, Russia; ph. (347) 2431935, e-mail: [email protected]
С целью интенсификации синтеза внеклеточных лакказ почвенными грибами К-2 и Л-4 была исследована их лакказная активность в процессе глубинного культивировании на питательных средах (Чапека-Докса, среде Королевой-Скоро-богатько, глюкозо-аммонийной среде с кукурузным экстрактом), а также осуществлена моди-фицикация среды Чапека-Докса путем обогащения ее биогенными добавками (дрожжевой экстракт) и микроэлементами, в том числе ионами Си2+. Показано, что при росте микроорганизмов на среде Королевой-Скоробогатько достигается наибольшая лакказная активность (не менее 70 ед /мл), а модифицированная среда Чапека-Докса обеспечивает лакказную активность культуральных жидкостей исследуемых грибов не менее 50 ед/мл.
Ключевые слова: микромицеты; лакказная активность; питательная среда.
Перспективными направлениями применения лакказ (п-дифенол:кислород-оксидоре-дуктаз, КФ 1.10.3.2) микроорганизмов является их использование для обесцвечивания красителей, обеззараживания и очистки сточных вод от ксенобиотиков, создания топливных ячеек, биосенсоров, в иммуноферментном анализе, в органическом синтезе, в пищевой промышленности и других отраслях 1-4. В ряде работ в качестве продуцентов лакказ для этих процессов 1-7 предлагается использовать высшие ксилотрофные грибы, а также почвенные микромицеты.
Ранее нами был выделен и изучен ряд почвенных микромицетов, синтезирующих лак-казы при культивировании на среде Чапека-Докса, содержащей 10 мкМ пирокатехина, среди которых наибольшую активность про-
Дата поступления 01.11.11
The activity of extracellular laccases of soil fungi Ë-4 and K-2 during the submerged cultivation on Czapek-Dox, Koroljova-Skorobogat'ko and glucose-ammonium with addition of corn extract media was researched for the purpose of the these enzymes synthesis intensification. Also the Czapek-Dox medium was modified by its enrichment with biogenic additions (yeast extract) and minor elements like Cu2+. It has been shown that the highest rate of laccase activity (no less than 70 units/ml) is obtained on Koroljova-Skorobogat'ko medium. The modified Czapek-Dox medium allowing laccase activity of culture fluid of the researched fungi no less than 50 units/ml is suggested.
Key words: micromycetes; laccase; nutrient medium.
явили штаммы К-2 и Л-4 8. В настоящей работе был осуществлен поиск более эффективной среды для синтеза лакказ этими микроорганизмами.
Важнейшим компонентом питательных сред для культивирования продуцентов фенол-оксидазных ферментов являются ионы меди, которые, как известно, входят в состав активного центра этих ферментов. Поэтому для культивирования высокоактивных продуцентов лакказы (например, базидиомицетов рода ТгатеЬе$, Сеггепа) используются питательные среды (глюкозо-аммонийная среда, среда Королевой-Скоробогатько) с повышенным содержанием ионов меди (50—250 мг/л Си504-5Н20) 9'10. Кроме того, такие питательные среды содержат кукурузный экстракт (10 г/л) или пептон (3 г/л), служащие источниками органического аммонийного азота и широкого спектра легкоусвояемых питательных ве-
ществ, в том числе свободных аминокислот, витаминов, микроэлементов, факторов роста 9'10.
В то же время в стандартной для культивирования грибов минеральной среде Чапека-Докса, в составе которой отсутствуют органические ростовые факторы, азот присутствует в виде нитрат-ионов, а ионы меди содержатся в следовых концентрациях, возможность сверхпродукции лакказ для культивируемых грибов ограничена .
В связи с этим с целью интенсификации синтеза лакказ грибами К-2 и Л-4 была исследована их лакказная активность при культивировании на альтернативных средах (среде Ко-ролевой-Скоробогатько, глюкозо-аммонийной среде с кукурузным экстрактом), а также осуществлена модифицикация среды Чапека-Док-са путем обогащения ее биогенными добавками (дрожжевой экстракт) и микроэлементами, в том числе ионами Си+2.
Культивирование грибов осуществляли глубинным способом при 28—30 оС в течение 15 сут. Лакказную активность культуральной жидкости определяли спектрофотометричес-ким методом в реакции окисления хромогенно-го субстрата — пирокатехина, образующего темноокрашенный продукт — о-хинон 10.
В результате исследования динамики лак-казной активности грибов Л-4 и К-2 в процессе культивирования было установлено ее увеличение на среде Королевой-Скоробогатько и модифицированной среде Чапека в 2—2.5 раза по сравнению со средами Чапека-Докса и глюкозо-аммонийной среде с кукурузным экстрактом. Наибольший уровень лакказной активности исследуемых грибов на среде Королевой-Скоробо-гатько составлял 68—71 ед/мл, а на модифицированной среде Чапека — 54—56 ед/мл (рис. 1).
Рис. 1. Максимальная лакказиая активность исследуемых грибов К-2 и Л-4 при выращивании на различных средах в присутствии индуктора: 1 — модифицированная среда Чапека; 2 — среда Королевой-Скоробогатько; 3 — среда Чапека-Докса; 4 — глю-козо-аммонийная среда с кукурузным экстрактом
Таким образом, для эффективного синте-3ä лакказ грибами Л-4 и К-2 наиболее перспективными являются среды (модифицированная среда Чапека-Докса, Королевой-Скоробогать-ко), содержащие ионы меди и органические добавки в виде пептона или дрожжевого экстракта, обеспечивающие выход внеклеточного фермента исследуемых грибов с активностью 50-70 ед/мл.
Экспериментальная часть
Грибы выращивали при температуре 28-30 оС методом глубинного культивирования в колбах на 250 мл, содержащих 50 мл среды, при перемешивании (150 об/мин) в течение 15 сут.
В качестве среды для культивирования грибов использовали:
- среду Чапека-Докса (сахароза — 10 г/л; NaNO3 — 3 г/л; KH2PÜ4-2H20 — 0.3 г/л; ZnSO4 — 0.04 г/л; MgSÜ4-7H20 — 0.25 г/л; KCL — 0.25 г/л; FeSÜ4-7H20 — 0.01 г/л);
- модифицированную среду Чапека-Док-са (сахароза — 10 г/л; NaNO3 — 3 г/л; KH2PÜ4-2H20 — 0.3 г/л; ZnSÜ4-7H20— 0.001 г/л; MgSO4-7H2O — 0.25 г/л; KCL — 0.25 г/л; FeSÜ4-7H20 — 0.001 г/л; MnSÜ4-5H20 — 0.05 г/л; CuSO4-5H2O — 0.05 г/л; дрожжевой экстракт — 0.2 г/л);
- глюкозо-аммонийную среду с кукурузным экстрактом (глюкоза — 20 г/л; (NH4)2SO4 — 2.5 г/л; мочевина — 0.7 г/л; KH2P04 — 0.6 г/л; K2HP04 — 0.6 г/л; MgSO4 — 0.5 г/л; кукурузный экстракт — 10 г/л);
- среду Королевой-Скоробогатько (глюкоза — 10 г/л; KH2PÜ4-2H20 — 0.6 г/л; K2HPÜ4-3H20 — 0.4 г/л; MgSO4-7H2O — 0.5 г/л; пептон — 3 г/л; CuSÜ4-5H20 — 0.25 г/л; CaCl2 — 0.5 г/л; ZnSÜ4-7H20 — 0.001 г/л; FeSÜ4-7H20 — 0.0005 г/л) 9-10.
^чальная кислотность сред составляла рH 6. Для индукции лакказной активности в среды вносили пирокатехин, в концентрации 10 мкМ. В среду Королевой-Скоробогатько сульфат меди вносили на третьи сутки роста грибов.
В качестве инокулята использовали агаровые блоки (1х1 см) грибных культур, выращенных на агаризованной среде Чапека-Докса.
Лакказную активность исследуемых микроорганизмов определяли спектрофотометри-ческим методом при длине волны 410 нм в реакциях трансформации 10 мМ пирокатехина c фильтратом культуральной жидкости в 0.1М ацетатном буфере рH 5 10. За единицу услов-
ной лакказной активности принимали изменение оптической плотности исследуемого раствора субстрата в течение 1 мин, отнесенное к 1 мл фильтрата культуральной жидкости.
Литература
1. Морозова О. В., Шумакович Г. П., Шлеев С. В., Ярополов А. И. // Прикл. биохим. микроби-ол.- 2007.- Т.43, №5.- С.583.
2. Call H. P., Mucke I. // J. Biotechnol.- 1997.-V.53.- P.163.
3. Hao O. J., Kim H., Chiang P. C. // Crit. Rev. Environ. Sci. Technol.- 1999.- V.30.- P.449.
4. Bumpus J. A. // Appl. Environ. Microbiol.-1989.- V.55.- P.154.
5. Roy-Arcand J., Archibald J. S. // Enzym. Microb. Technol.- 1991.- V.13.- P.194.
6. Александрова А. В., Медведева С. A. // Хим. раст. cbipM.- 1999, №2.- C.81.
7. Бабицкая В. Г., Щерба В. В. // Микробиол.-1994.- №1.- C.27.
8. Халимова Л. Х., Шараева А. А., Петухова Н. И., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2010.- Т.17, №5.- С.46.
9. Методы экспериментальной микологии / под ред. Билай В. И.- Киев: Наук. дум.- 1982.550 с.
10. Koroljova-Scorobogat'ko O., Stepanova E., Gav-rilova V., Morozova O., Lubimova N., Dzchafarova A., Yaropolov A., Makoweev A. // J. Biotech. Appl. Biochem.- 1998.- V.28, №1.-P. 47
