CC BY
47
УДК 612.015.13 : 615-015 : 616.33 - 018.73] - 092.9
Е.Ю. Животова1, Н.В. Масленникова1, М.Ю. Флейшман1, О.А. Лебедько2, Е.Н. Сазонова1, С. С. Тимошин1
СИСТЕМА NOS-NO — УНИВЕРСАЛЬНОЕ ЗВЕНО В РЕАЛИЗАЦИИ ГАСТРОПРОТЕКТИВНЫХ ЭФФЕКТОВ ОПИОИДНЫХ ПЕПТИДОВ
Дальневосточный государственный медицинский университет1, 680000, ул. Муравьева-Амурского, 35, тел.: 8(4212) 32-63-93, e-mail: [email protected]; Хабаровский филиал Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН - НИИ охраны материнства и детства2, 680022, ул. Воронежская, 49, кор.1, e-mail: [email protected], г. Хабаровск
Широкое внедрение в клиническую практику эндоскопических методов исследования выявило значительную распространенность эрозивно-язвенных поражений верхних отделов пищеварительного тракта [4]. Этиологические факторы, патогенетические механизмы развития и коррекции эрозивно-язвенных поражений желудка сложны, многообразны и не всегда ясны. Нами было проведено комплексное экспериментальное исследование гастропро-тективного влияния ряда биологически активных веществ на модели эрозивно-язвенного поражения слизистой оболочки желудка, индуцируемого введением нестероидного противовоспалительного препарата (НПВП) — индомета-цина.
Целью исследования было выявить общие механизмы реализации эффектов гастропротекторов различной природы.
Материалы и методы
В работе использовали рандомбредных половозрелых мышей-самцов массой 25-35 г. Повреждение слизистой оболочки желудка (СОЖ) моделировали внутрижелу-дочным введением индометацина в дозе 250 мг/кг («Бал-канфарма»). В качестве гастропротективных веществ использовали:
1) даларгин — синтетический аналог лей-энкефалина (Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg) и его безаргининовый аналог [ДА Lа] 2-лей-энкефалин (Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu);
2) седатин — синтетический аналог дерморфина (Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly) и его безаргининовый аналог (Tyr-D-Ala-Phe-Gly).
Пептиды вводили экспериментальным животным в дозе 100 мкг/кг пятикратно ежесуточно внутрибрюшинно.
3) Р-казоморфин-7 (Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile) — экзогенный опиоидный пептид, производное казеина молока, вводили экспериментальным животным в дозе 1 мг/кг пятикратно, ежесуточно внутрибрюшинно.
Исследуемые пептиды были получены в лаборатории синтеза пептидов Российского кардиологического центра РАМН. Через 1 ч после последнего введения пептида животным подопытной группы интрагастрально при помощи зонда вводили индометацин и через 48 ч выводили из эксперимента. Для оценки участия в реализации эффекта системы NO-NOS использовали неселективный ингибитор NOS NG-нитро-L-аргинин метилового эфира (L-NAME; «ICN Biomedicals Inc»), который внутрибрюшинно инъецировали животным в дозе 9,3 х10-5 М за 30 мин до введения пептидов.
Площадь эрозивно-язвенного поражения СОЖ измеряли с помощью компьютерной морфометрии на анализаторе изображения «Мекос-Ц» после видеозахвата под бинокулярной лупой (х6). Анализ пролиферативной активности эпителия желудка осуществляли методом авторадиографии, для чего животным за 1 ч до эвтаназии вводили Н3-тимидин из расчета 1 мкКюри на 1 г массы (уд. активность 84 Кюри/моль). Радиоавтографы готовили по принятой в лаборатории методике, использовали фотоэмульсию «Kodak Autoradiography» (Emulsion NTB Product code 8895666). Индекс меченых ядер (ИМЯ) определяли на основании подсчета 2500 эпителиоцитов СОЖ на продольных полнослойных срезах собственных желез желудка.
Для интегральной оценки процессов свобод-норадикального окисления использовали метод хемилюминесценции (ХМЛ). Регистрацию ХМЛ осуществляли на люминесцентном спектрометре LS 50В «PERKIN ELMER». Сигнал стандартизировали с помощью встроенной программы Finlab. Спонтанную и индуцированную Fe2+ ХМЛ исследовали по методу [3]. Определяли светосумму за 1 мин спонтанной ХМЛ (S ), максимум быстрой вспышки (h) индуцированной ХМЛ, светосумму (S1 инд.) за 4 мин после «быстрой» вспышки. Кинетику ХМЛ, инициированную Н2О2 в присутствии люминола [1, 10], анализировали по двум параметрам: максимуму быстрой вспышки (Н) и светосумме (S2 инд) за 4 мин.
Статистическую обработку данных проводили с использованием ППП Statistica 6,0. Всего в экспериментах было использовано 266 животных.
Результаты и обсуждение
Интрагастральное введение индометацина в дозе 250 мг/кг вызывало выраженное поражение СОЖ. Площадь эрозивно-язвенного поражения СОЖ у подопытных животных достигала 10,92±2,05 мм2. В контрольной группе повреждения отсутствовали. Введение индометацина достоверно снижало ИМЯ эпителия СОЖ (рис. 1). Деструктивное изменение СОЖ сопровождалось формированием выраженного оксидативного стресса. Об этом свидетельствуют данные хемилюминесцентного анализа, регистрирующие значительное повышение интенсивности свободнорадикальных процессов в СОЖ (рис. 2). Предварительное (до воздействия индометацина) 5-кратное введение даларгина существенно изменяло реакцию
СОЖ на НПВП. Площадь эрозивно-язвенного поражения СОЖ снизилась до 1,79±0,54 мм2, что достоверно отличалось от показателя группы «индометацин». Введение даларгина полностью нивелировало угнетающее влияние индометацина на пролиферативную активность эпителия желудка (рис. 1) и значительно ослабило проявления ок-сидативного стресса в СОЖ (рис. 2). Ранее в клинических условиях нами было показано позитивное влияние даларгина на течение эрозивно-язвенной гастропатии, индуцированной применением НПВП [2].
Безаргининовый аналог даларгина не оказывал влияния ни на площадь эрозивно-язвенного поражения СОЖ (6,92±1,25 мм2), ни на пролиферативную активность эпителия (рис. 1). Имело место некоторое угнетающее влияние этого пептида на показатели тканевого оксидативного стресса. Однако антиоксидантный эффект безаргинино-вого пептида был существенно меньше, по сравнению с даларгином (рис. 2).
Положительное влияние на состояние СОЖ при НПВП-гастропатиях имело место при введении другого опиоидного пептида — седатина. Предварительное 5-кратное введение седатина достоверно уменьшало площадь эрозивно-язвен-ного поражения СОЖ до 4,24±1,12 мм2. НПВП-индуциро-ванное угнетение пролиферативной активности эпителия желудка снизилось с 45 до 17,5% (рис. 1). Хемилюминес-центные корреляты оксидативного стресса также были значительно ниже (рис. 2). Безаргининовый аналог седатина, так же, как и безаргининовый аналог даларгина, не корректировал негативных последствий воздействия индометаци-на на СОЖ экспериментальных животных.
Таким образом, в представленных выше экспериментах аргининсодержащие опиоидные пептиды проявляли защитное действие в модели НПВП-индуцированной гас-тропатии, а их безаргининовые аналоги были лишены гас-тропротективной активности. Это дает основание считать, что в реализации гастропротективного действия аргинин-содержащих опиоидных пептидов даларгина и седатина ведущая роль принадлежит присутствию в пептидах остатка молекулы Arg — субстрата для NO-синтаз.
ß-казоморфин^ не содержит в своей структуре аминокислоты Arg, однако так же обладает значительным гастропротективным действием. Предварительное введение ß-казоморфина-7 нивелировало повреждающее вли-
20 уровень контроля
so--'
40
20
п индометацин одаларгин + индометацин н [Оа1а]2-лейэнкефалин + индометацин и седатин + индометацин г седатин без аргинина+ индометацин и З-казоморфин + индометацин
Рис. 1. ДНК-синтетическая активность слизистой оболочки желудка подопытных животных исследуемых групп (% по отношению к контролю — контрольный параметр принят за 100%). * — р<0,05 по отношению к группе «индометацин»
Резюме
Изучали механизмы гастропротекции опиоидными пептидами индометацин-индуцируемых повреждений слизистой оболочки желудка. Опиоидные пептиды: да-ларгин - синтетический аналог лей-энкефалина (Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg) и безаргининовый аналог даларгина (Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu); седатин — синтетический аналог дерморфина (Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly) и безаргининовый аналог седатина (Tyr-D-Ala-Phe-Gly) вводили экспериментальным животным в дозе 100 мкг/кг пятикратно, ежесуточно, внутрибрюшинно. Р-казоморфин-7 (Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile) — экзогенный опиоидный пептид, вводили экспериментальным животным в дозе 1 мг/кг пятикратно, ежесуточно, внутрибрюшинно. После воздействия пептидов осуществляли однократное интрагас-тральное введение индометацина в дозе 250 мг/кг. Метод авторадиографии с Н3-тимидином применяли для анализа пролиферативной активности эпителия желудка. Уровень процессов свободнорадикального окисления оценивали с помощью метода хемилюминесценции (ХМЛ) по принятой в лаборатории методике. Результаты исследования позволяют рассматривать систему NOS-NO в качестве универсального функционального блока гастропротек-ции, осуществляемой опиоидными пептидами.
Ключевые слова: НПВП-гастропатия, свободноради-кальное окисление, пролиферация, даларгин, седатин, Р-казоморфин.
E.Yu. Zhivotova, N.V. Maslennikova, M. Yu. Fleishman, O.A. Lebedko, E.N. Sazonova, S.S. Timoshin
NOS-NO SYSTEM AS A UNIVERSAL LINK PROVIDING GASTROPROTECTIVE EFFECTS OF OPIOID PEPTIDES
The Far eastern state medical university; Khabarovsk Facility of State Founding Scientific
research institute of Mother and Child Care, Khabarovsk
Summary
Mechanisms of gastroprotection of NSAID-induced injury of gastric mucosa (GM) by opioid peptides were studied. Opioid peptides: dalargin — a synthetic leu-enkepalin analogue (Tyr-D-Ala-GLY-Phe-Leu-Arg) and non-agrinine dalargin analogue (Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu); sedatin — a synthetic demorphin analogue (Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly) and non-agrinine sedatin analogue (Tyr-D-Ala-Phe-Gly) were administered to experimental animals, in a dose of 100 mkg/kg five times daily, intraperitoneally. P-kazomorphin-7 (Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile) — exogenous opioid peptide was injected to experimental animals in a dose of 1 mg/kg five times daily, intraperitoneally. Autoradiography method with H3-timidine was used for analyzing proliferative activity of gastric mucosa. The level of free radical oxidation processes was evaluated by chemiluminiscence technique used in the laboratory. The role of remainder of arginine molecule present in dalargin, sedatin and Pro-Gly-Pro structure (which is formed in p-kazomorphin metabolism) in activation of NOS-NO system is being discussed. Findings allow us to consider NOS-NO system as universal gastroprotection block created by opioid peptides.
Key words: NSAID-gastropathy, oxidative stress, proliferation, dalargin, sedatin, P-kazomorphin.
S¡nd1
Sind 2
ЁЗ индометэцин ЕЭдаларгин+индометацмн
S [Dala]2- лемэнкефалин+мндометацин El седатин+индометацин И седатин без аргинина+индометацин El ß-казоморфин+индометацин
Рис. 2. Хемилюминесцентные показатели процессов свободнорадикального окисления в гомогенатах желудка животных исследуемых групп (% по отношению к контролю -контрольные параметры приняты за 100%).
* — р<0,05 по отношению к группе «индометацин»
яние индометацина на СОЖ: у животных, получавших индометацин на фоне казоморфина, язвенного поражения СОЖ выявлено не было. В группе животных, получавших индометацин на фоне воздействия Р-казоморфи-на-7, не было выявлено отклонений ДНК-синтетической активности эпителия СОЖ от контрольных показателей (рис. 1). Введение Р-казоморфина-7 значительно ослабило проявление оксидативного стресса, индуцированного индометацином (рис. 2). Исследуемые хемилюминесцентные показатели хотя не достигали уровня контроля, но были достоверно ниже показателей группы «индометацин». Таким образом, предварительное воздействие Р-ка-зоморфина-7 практически нивелировало повреждающее влияние индометацина на СОЖ, эффект сопровождался нормализацией пролиферативной активности эпителия СОЖ и значительным ослаблением оксидативного стресса на тканевом уровне. В целом, эффект Р-казоморфина-7 на СОЖ был практически аналогичен эффектам аргинин-содержащих пептидов даларгина и седатина. Возможным объяснением гастропротективного действия Р-казомор-фина-7 служат данные литературы о том, что в ходе метаболизма Р-казоморфина-7 образуется Рго-Gly-Pro, обладающий способностью стимулировать NOS, увеличивать кровоток в желудке, оказывать гастропротектив-ное влияние [5, 11].
Для доказательства универсальной роли NOS-NO в реализации гастропротективного эффекта исследуемых опиоидных пептидов нами были проведены опыты с блокадой NOS с помощью L-NAME — неселективного ингибитора NO-синтаз. На фоне блокады образования NOS ни один из исследованных пептидов не реализовывал свое корригирующее действие на тканевой гомеостаз СОЖ по показателям ДНК-синтетической активности эпителия.
Таким образом, можно говорить об участии системы NO-NOS в реализации гастропротективных эффектов ре-гуляторных пептидов при НПВП-индуцированных гаст-ропатиях.
Данные [8] свидетельствуют, что гастропротективное действие морфина осуществляется посредством системы NOS-NO. Система NOS-NO не ограничивается протек-тивным действием опиатов. Через него реализует свое действие широкий класс веществ. Гастропротективный
эффект, обусловленный повышением активности eNOS в СОЖ, был описан для пептида грелина [14], орексина-А [7], простагландинов [9], омепразола и других ингибиторов протоновой помпы [12, 13].
Согласно представлениям A.M. Уголева [6], различные функции, в том числе специализированные, складываются из элементарных функций, которые реализуются определенным сочетанием ограниченного числа функциональных блоков. Система NOS-NO может служить одной из иллюстраций универсального функционального блока, принимающего участие в регуляции различных физиологических процессов.
Литература
1. Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиок-сидантной системы организма: метод. рек. - СПб., 2000.
- С. 198.
2. Болоняева Н.А., Животова Е.Ю., Флейшман М.Ю. и др. // Дальневост. мед. журнал. - 2005. - №2. - С. 28-30.
3. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И. Свободные радикалы в живых системах // ВИНИТИ АН ССР: Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. - М., 1991. - Т. 29. - С. 147.
4. Маев И.В., Орлов Л. Л., Нефедова Ю.В. Эрозивные поражения слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки // Клин. медицина. - 1997. - №6. - С. 57-60.
5. Самонина Г.Е., Копылова Г.Н., Сергеев В.И. и др. Коррекция кровотока желудка как один из возможных механизмов противоязвенных эффектов коротких про-линсодержащих пептидов // Рос. физиол. журнал. - 2001.
- Т. 87, №11. - С. 1488-1492.
6. Уголев A.M. Функциональная эволюция и гипотеза функциональных блоков // Журнал эволюц. биохимии и физиологии. - 1983. - № 4. - С. 390-399.
7. Brzozowski Т., Konturek P.С., Sliwowski Z. et al. Gastroprotective action of orexin-A against stress-induced gastric damage is mediated by endogenous prostaglandins, sensory afferent neuropeptides and nitric oxide // Digestion.
- 2007. - Vol. 75(4). - P. 188-197.
8. Gyires K. The role of endogenous nitric oxide in the gastroprotective action of morphine // Eur. J. Pharmacol. -1994. - Vol. 255 (1-3). - P. 33-37.
9. Konturek S.J., Brzozowski Т., Majka J. et al. Nitric oxidein gastroprotection by sucralfate, mild irritant, and nocloprost. Role of mucosal blood flow // Dig. Dig. Sci. -1994. - Vol. 39(3). - P. 593-600.
10. Kuzmenko A.I. Characterization of H2O2 - initiated oxidation of blood serum lipids by kinetic parameters // West. Med. J. - 1999. - Vol. 71, №4. - P. 63-66.
11. Lameu C., Pontieri V., Guerreiro J.R. et al. Brain nitric oxide production by a proline-rich decapeptide from Bothrops jararaca venom improves baroreflex sensitivity of spontaneously hypertensive rats // Hypertens Res. - 2010. -Vol. 33(12). - P. 1283-1288
12. Le Q. L. Zang J., Xu Q.Z., Gao H. Y. Role of nitric oxide in omeprazole protection of the gastric mucosa in rat // Di Yi Jim Yi Da Xue Xue Bao. - 2001. - Vol. 21(12). - Р. 926-928.
13. Murakami I., Satoh H., Asano S., Maeda R. Role of capsaicin-sensitive sensory neurons and nitric oxide in the protective effect of lansoprazole, a proton pump inhibitor,
on gastric mucosa in rats // Jpn. J. Pharmacol. - 1996. - Vol. 72(2). - Р. 137-147.
14. Sibilia V., Pagani F., Rindi G. et al. Central ghrelin gastroprotection involves nitric oxide/prostaglandin crosstalk // Br J Pharmacol. - 2008. - Vol. 154(3). - P. 688-697.
Координаты для связи с авторами: Животова Елена Юрьевна — канд. мед. наук, ст. науч. сотр. ЦНИЛ ДВГМУ, [email protected]; Масленникова Наталья Викторовна — науч. сотрудник ЦНИЛ ДВГМУ, тел.:
8(4212) 32-99-64; Флейшман Марина Юрьевна — канд. мед. наук, вед. науч. сотр. ЦНИЛ, e-mail: marfl@yandex. ru; Лебедько Ольга Антоновна — доктор мед. наук, вед. науч. сотр. НИИ ОМиД, e-mail: [email protected]; Сазонова Елена Николаевна — зав. кафедрой нормальной физиологии ДВГМУ, e-mail: [email protected]; Тимошин Сергей Серафимович — зав. ЦНИЛ ДВГМУ, тел.: 8(4212) 32-99-64, е-mail: [email protected].
□□□
УДК 616 - 053.1 : 612.82 - 599.323.4 Е.Н. Сазонова, А.А. Симанкова, С.Ю. Крыжановская, С.С. Тимошин
ВЛИЯНИЕ АНТЕНАТАЛЬНОЙ ГИПОКСИИ НА НЕКОТОРЫЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ГОЛОВНОГО МОЗГА БЕЛЫХ КРЫС В РАННЕМ ПЕРИОДЕ ПОСТНАТАЛЬНОГО ОНТОГЕНЕЗА
Дальневосточный государственный медицинский университет1, 680000, ул. Муравьева-Амурского, 35, тел.: 8(4212)32-63-93, е-mail: nauka@mail ru; НИИ охраны материнства и детства СО РАМН2, 680022, ул. Воронежская, 49, кор. 1, e-mail: [email protected]; Дорожная клиническая больница ст. Хабаровск-I ОАО «РДЖ»3, 680022, ул. Воронежская, 49, тел.: 8(4212) 98-03-58, г. Хабаровск
Антенатальная гипоксия вызывает существенные изменения функционирования многих систем организма, при этом, в первую очередь, страдает центральная нервная система. До 72% новорожденных, перенесших гипоксию в антенатальном и интранатальном периодах, имеют психоневрологический дефицит различной степени тяжести [4]. Проблему последствий антенатальных ги-поксических поражений головного мозга нельзя считать решенной. Особенно актуальным является выявление связей изменений в нервной ткани на клеточном уровне с выраженностью неврологического дефицита и расстройствами высшей нервной деятельности [5, 8]. Этот вопрос и определил цель предлагаемого исследования.
Материалы и методы
В работе использовали потомство рандомбредных 3-месячных белых крыс-самок, подвергнутых гипокси-ческому воздействию с 14 по 19 сут гестации. Использование белых крыс в качестве модели антенатальных гипоксических повреждений ЦНС оправдано имеющимися данными о выраженном сходстве между грызунами и высшими млекопитающими по церебральному кровоснабжению и биологии нервных клеток [10]. Беременных крыс-самок помещали в барокамеру СБК-48 натощак и «поднимали» на высоту 9000 м над уровнем моря, что соответствовало давлению 224 мм рт.ст. и парциальному давлению кислорода 42 мм. рт.ст. Ежесуточную 4-часовую экспозицию проводили с 9 до 13 ч в течение 6 дн. По
данным литературы, такая гипоксия может быть расценена как тяжелая [7].
После рождения крысят, в каждом выводке оставляли по 8-10 животных, у которых проводили регистрацию ряда показателей развития. Уравнивание выводков было необходимо для исключения влияния на регистрируемые параметры нутритативного фактора. Осуществляли наблюдение за подопытными животными до достижения ими 17-суточного возраста. В динамике оценивали массу тела животных. В 1- и 7-суточном возрасте определяли массу головного мозга гравиметрическим методом. Исследование пролиферативной активности нейрональных структур осуществляли методом авторадиографии с меченым тритием тимидином у 7-суточных животных. Подсчитывали индекс меченых ядер (ИМЯ, %) в неокортексе собственной теменной доли и гиппокампе. Для оценки функционального состояния ЦНС в неонатальном возрасте (с 1 по 7 сут жизни) проводили тест на отрицательный геотропизм и тест на удержание животного на передних лапах в висячем положении на горизонтальной проволоке [3]. Статистическую обработку полученных экспериментальных данных осуществляли по критерию Стьюдента при помощи пакета прикладных программ 81а11811ка 5,0. Всего в эксперименте было использовано 76 животных.
Результаты и обсуждение
Исследование в динамике массы тела животных, перенесших антенатальную гипоксию, выявило достовер-
