CC BY
37СИНТЕЗ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НЕКОТОРЫХ ФУЛЛЕРЕНА Сб0 -ПРОИЗВОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ И ПЕПТИДОВ
ЗАФАРОВ СОРБОН ЗАФАРОВИЧ
к.х.н. ассистент кафедры органической химии Таджикского национального университета,
Таджикистан
КОДИРОВ МУРОД ЗОКИРОВИЧ
к. х. н., доцент кафедры органической химии Таджикского национального университета,
Таджикистан
ОЛИФТАЕВА ЖОЛА АБДУНИЁЗОВНА,
к. х. н., ассистент кафедры естественные науки Государственного университета г. Хорога им.
М. Назаршоева, Таджикистан
МАВЗУНАИ УМАРХОН
научный сотрудник гр.ВМ-5 «Пептид» Таджикского национального университета,
Таджикистан
Аннотация В статье обсужден способ синтеза и исследование противовирусных свойств некоторых производных фуллерена Сев на основе аминокислот, пептидов и их композиции. Синтез приведен согласно методики получения аминокислотных производных фуллерена Сво с высокими антивирусными свойствами. В связи с этим для изучения противовирусной активности синтезирован аналогов фуллерена Сво с различными аминокислотами и пептидом в виде композита. Реакция взаимодействия аминокислот и пептидов с фуллереном Сво проводили при температуре 70-800С в среде ДМФА и арил-галогенид на примере (хлорбензол). Данный метод позволяет получить продукт с достаточно хорошими выходами и высокой степенью чистоты.
Структура и строение полученного соединения подтверждена тонкослойной хроматографией, результатами масс-спектрометрии и элементным анализом. Изучены противовирусные и токсичные свойства полученных соединений.
Ключевые слова: вирус, фуллерен, аминокислота, пептид, гепатит С, хроматография, спектр, композит.
Для синтеза соединений 1 мы использовали разработанную нами методику, заключающуюся во взаимодействии фуллерена Сбо со свободными или натриевыми и калиевыми солями аминокислот, а также их композитных составов и свободных пептидов [1,2,3] в щелочной среде диметилформамида (ДМФА) и галогенбензолов по схеме 1:
Схема 1.
Суть данного процесса заключается в следующем: к щелочному раствору ДМФА добавляют аминокислоту или смесь композитных составов аминокислот или пептидов, взятую в 4-10-кратном избытке и при перемешивании по каплям при 70-800С добавляют раствор фуллерена С60 в дихлорбензоле, бромбензоле или бромнафталине и перемешивают 7-8 ч. при установленной температуре.
Продукт самопроизвольно выпадает в виде темно-коричневого осадка. При этом выход N-C60 моно- или олигоаминокислот и пептидов, и их аналогов составляет 21% до 70%. Данный метод удобен тем, что во-первых, он позволяет получать фуллеро С60 аминокислоты и пептиды с достаточно хорошими выходами и высокой степенью чистоты без применения трудоемких способов очистки.
Во-вторых, на корковую часть фуллерена С60 можно присоединить до шести остатков одинаковых или разных аминокислот и пептидов. В-третьих, данным способом в реакцию с фуллереном одновременно можно вводить композиции от двух до четырёх разных аминокислот или коротких пептидов[4,5]. В результате аминокислоты, входящие в композитный состав в разном количественном соотношении, могут присоединиться на корковой поверхности фуллерена, образуя N-фуллеро С60 - аминокислотный олигомерный композитный комплекс с разными количествами аминокислотных остатков или пептидных фрагментов с общей формулой N-фуллеро С60 (H)m[NH-CH(R)-COOH] n или N-фуллеро С60-(Н)щ[-пептид] n.
При синтезе соединения (1) в виде композита было взято L-His-ONa, L-Ser-ONa и пептид, L-Ala-Ala-ONa успешно присоединившие к молекуле фуллерена Сбо.
Соединение 1
Синтезированный продукт растворим в максимальном количестве диметилсульфоксиде, воде и твине. В масс-спектре соединений (1) фуллеро C60(H)4[(His-ONa)(Ser-ONa)2(Ala-Ala-ONa)] присутствовали пики молекулярных ионов с m/z 1329,1306, 1283,1260, 1236, 1213, 1191, 1164, 1140, 1116, 1092, 1008, 721, 720, 699.
Элементный состав синтезированных веществ соответствовал вычисленному. При температуре выше 4500С соединение 1 интенсивно разрушалось с отщеплением остатков С60 и лигандов, подвергшихся окислению или обугливанию - продукты пиролиза. Для
ОФ "Международный научно-исследовательский центр "Endless Light in Science"
определения количества лигандов, присоединившихся к поверхности С60, использовали формулу учёта молекулярной массы, полученную на основе масс-спектрограммы или вычитанной молекулярной массы на основе элементного анализа формуле (1):
mi - m9 W = -1--
a ' mn(1.2.3.4)
где W - количество аминокислот, присоединившихся к С60; m1 -общая масса вещества; m2 -масса С60 (720); mn(1.2.3.4) - масса аминокислоты или пептида взятое в реакции, а n-количество аминокислот или пептидов взятое в реакции присоединения к фуллерену, соответственно 1,2....
При хроматографическом исследовании кислотного гидролизата соединения (1) обнаружены аминокислоты: серин, аланин и гистидин.
Электрофорез гидролизата соединения (1) проводили на влажной хроматогра-фической бумаге, ватмане №3, MM в буферной системе (Г) при рН 11-12, силе тока 20 мА (400В) в течение 3 ч, проявитель - раствор нингидрина.
Видимую электрофоретическую подвижность соединений (1) определяли по известной формуле (2):
d • l
U = - см2 / вольт.сек.
v • t
d - путь, пройденный веществом от линии старта, l - длина полосы бумаги, t - время проведения электрофореза, v - напряжение.
Электрофоретический анализ кислотного гидролизата соединения (1) показал три окрашенных пятна, относящихся к аминокислотам: серин, аланин и гистидин. В качестве свидетелей на электрофоретическую бумагу рядом нанесли растворы Ser (2), Ala (3), His (4). Все аминокислоты переместились на определенное расстояние по направлению к аноду (рис.1).
В данном случае примесей свободных аминокислот при электрофорезе не обнаружено.
Продукт гидролизата соединения (1) на электрофореограмме показал три отдельные аминокислоты: серин, аланин и гистидин. Все аминокислоты переместились по направлению к аноду.
Рис.1.
Разделение аминокислот из гидролизатов фуллеро C60(H)4[(His-ONa)2(SerONa)(Ala-Ala-ONa)] (1) методом электрофореза. Аминокислоты 2-4 приведены в качестве свидетелей. Гидролизат фуллеро C60(H)4[(His-ONa)(Ser-ONa)2(Ala-Ala-ONa)] Ub=0,0021, Ш=0,00256, Ute=0,0044, (1). Свидетели (U): His=0.0022 (2), Ser=0.0256 (3), Ala= 0.00045(4).
Результаты изучения противовирусной активности веществ.
Результаты для фуллерена C60(H)4-[(-HisONa)(-SerONa)2(-Ala-AlaONa)] (1) отражены в виде данных таблиц 1 и 2, а именно, представлены данные исследования антивирусных свойств веществ на 5-й и 7-й дни после заражения монослоя клеток Vero(v) вирусом гепатита С [6,7,8,9].
Как видно из данных, представленных на табл.1., на 5-й день после заражения клеток Vero(v), когда в контольных, не обработанных веществами, культурах клеток произошла вирусиндуцированная гибель более 95% клеток, были обнаружены противовирусные свойства у всех веществ в отношении инфекции, вызванной вирусом гепатита С в культурах клеток Vero(v), однако прослеживались и определенные различия в проявлении противовирусной активности [10,11].
В частности, было показано, что максимальная противовирусная активность вещества за 24 часа до заражения вирусом. В 2 раза более низкой активностью характеризовались вещества фуллерена C60(H)4-[(-HisONa)(-SerONa)2(-Ala-AlaONa)] (1) в виде композита в этих условиях (ХТИ) составлял более 16, что совпадало с данными противовирусной активности препарата рибавирин в этих условиях. В случае внесения веществ сразу же после заражения клеток вирусом противовирусная активность снижалась и для ХТИ для фуллерен C60(H)4-[(-HisONa)(-SerONa)2(-Ala-AlaONa)] и рибавирина.
Аналогичная закономерность наблюдалась и в опытах, когда вещества вносили через 24 часа после заражения клеток (табл.2). Несмотря на более низкие показатели противовирусной активности веществ в этих условиях, ЕС95 для веществ фуллерен C60(H)4-[(-HisONa)(-SerONa)2(-Ala-AlaONa)] составил 10 мкг/200 мкл против 20 мкг/ 200 мкл, что повлияло и на показатели ХТИ (>4 и более 2 соответственно).
Представляло интерес выяснить, сохраняются ли противовирусные свойства вещества в течение 7 суток наблюдения за инфекцией, вызванной ВГС в культурах клеток. Данные этих исследований представлены в табл.2. В случае внесения веществ в лунки с монослоем клеток за 24 часа до заражения также наблюдали максимальное проявление противовирусной активности вещества в отношении инфекции, вызванной ВГС в культурах клеток Vero(v).
В меньшей степени противовирусные свойства аналогов фуллерена были обнаружены в опытах, когда вещества вносили в лунки сразу же после заражения вирусом клетки и практически не значимые данные снижения продукции вируса гепатита С инфицированными клетками были получены в экспериментах, когда вещества добавляли через 24 часа после заражения монослоя клеток.
В то же время следует отметить, что противовирусная активность рибавирина в отношении инфекции, вызванной вирусом гепатита С в культурах клеток Vero(v), не намного превышала таковую для вещества-аналога фуллерена, исследованных в данной работе.
Если сравнивать результаты изучения противовирусных свойств предостав-ленных веществ в течение 5 и 7 дней их воздействия на инфицированные клетки, то, следует отметить, что в опытах, когда вещества вносили за 24 часа до заражения клеток, активность веществ была одинаковой как в течение 5, так и 7 дней течения инфекционного процесса. Однако в случае применения веществ сразу же после заражения или через 24 часа после заражения их противовирусные свойства заметно снижались (прибилизительно, в 2 раза).
Полученные результаты свидетельствуют, скорее всего, о необходимости многократного введения веществ в этих условиях, чтобы достичь эффекта сравнимого с активностью при профилактическом применении препарата.
Следует также отметить наблюдения, свидетельствующие о том, что при снижении концентрации вносимых веществ ниже приведенных в табл. 1 и 2 значений ЕС50 часто регистрировали защитные свойства веществ, однако определить истинное значение ЕС95 или ЕС50 не представлялось возможным из-за отсутствия зависимого от дозы эффекта.
ТАБЛИЦА 1. Противовирусная активность соединений в отношении инфекции, вызванной вирусом гепатита С в культурах клеток Vero-E6 (5-й день после заражения вирусом гепатита
С в дозе 0.1 ТЦИД ,50/клетка)
Время внесения соединений Наименование соединения ТС50 (мкг/200мкл) ЕС95 (мкг/200мк л) ЕС50 (мкг/200мкл) ХТИ
За 24 часа до заражения вирусом 1 > 20.0 2.5 1.25 >16.0
Рибавирин 10.0 1.25 0.62 16.0
Немедленно после заражения вирусом 1 > 20.0 10.0 5.0 >4.0
Рибавирин 10.0 5.0 >2.5 >4.0
Через 24 после заражения вирусом 1 > 20.0 20.0 10.0 >2.0
Рибавирин 10.0 5.0 >2.5 >4.0
ТАБЛИЦА 2. Противовирусная активность соединений в отношении инфекции, вызванной вирусом гепатита С в культурах клеток Vero-E6 (7-й день
после заражения вирусом гепатита С в дозе 0.1 ТЦ -1Д50/клетка)
Время внесения соединений Наименование соединения ТС50 (мкг/200мкл) ЕС95 (мкг/200мкл) ЕС50 (мкг/200мк л) ХТИ
За 24 часа до заражения вирусом 1 > 20.0 2.5 1.25 >16
Рибавирин 10.0 1.25 0.62 16
Немедленно после заражения вирусом 1 > 20.0 20.0 10.0 >2.0
Рибавирин 10.0 2.5 1.25 8.0
Через 24 после заражения вирусом 1 > 20.0 > 20.0 > 20.0 >1.0
Рибавирин 10.0 10.0 5.0 2.0
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали L-аминокислоты L-His, L-Ser и готовый пептид L-Ala-L-Ala фирмы Reanal (Венгрия). ТСХ проводили на хроматографических пластинках Silufol (ЧСФР) и Kiesegel- 60 на стекляной подложке .№5724 (Merk, Германия) в следующих системах растворителей: бутанол - уксусная кислота - вода, 4:1:5; (А); толуол-бромбензол-уксусная кислота, 60:40:50 (Б); хлоро-форм-метанол-аммиак 20:12:14 (В); триэтиламин-аммиак-метанол-вода, 10:10:200:400 (Г); уксусная кислота-хлороформ, 50:25 (Д); электрофорез проводился в бумаге Ватман ММ в системе (Г) при рН 11-12, 400В. Вещество обнаруживали на хроматограммах и электрофореограммах с помощью нингидрина и пары йода. ИК-спектры
записывали на приборе SHIMADRU FTIR Measurement. Данные элементного анализа соединений соответствуют расчетным.
Для идентификации аминокислотных остатков в полученных соединениях проводили кислотный гидролиз в 6н и 12н HCl в запаянной ампуле при 1200С в течение 22 ч. Образующиеся свободные аминокислоты и С60 идентифицировали с помощью ТСХ, БХ и электрофорез в системе (А и Г). Растворители удаляли на роторном испарителе при 40-600С. Температуру плавления определяли на приборе Boetus (Германия).
Гидролиз N-фуллероС6o(Н)4[(-HisONaX-SerONa)2(-Ala-AlaONa] для аминокислотного анализа проводили в стандартных условиях 6^HCl (1200С 24 ч). Аминокислотный анализ осуществляли на аминокислотном анализаторе LC 2000 (Германия).
N-фуллероС60(Н)4[(-HisONa)(-SerONa)2(-Ala-AlaONa] (1)
В маленькой конической колбочке, снабженной обратным холодильником, капельной
воронкой, установленной на магнитной мешалке в композитной смеси, помешают 0.088 г
(0.00056моль) L-Ala-L-Ala в 8-кратном избытке, 0.056 г (0.00052 моль) серина в 7-кратном
избытке, 0.088 г (0.00056 моль) гистидина в 4.8-кратном избытке, в 6 мл диметилформамиде
содержащий 0.4 мл 6н NaOH (pH-10).
При интенсивном перемешивании при 70-800С из капельной воронки прикапывают
раствор 0.050 г. (0.00007 моль) фуллерен С60 в 3 мл 1,2-дихлорбензоле. Перемешивание
продолжают в течение 5 ч.
После трёхчасового перемешивания происходит помутнение реакционной среды,
наблюдается переход окраски из фиолетового цвета в темно-коричневый и постепенное
выпадение из раствора темно-коричневого осадка, по окончании реакции (через 8ч) выпавший
осадок фильтруют. Осадок промывают толуолом до исчезнования фиолетовой окраски,
содержащий непрореагировавший фуллерен С60 и щелочным метанолом для удаления
невступивших в реакцию натриевых солей лигандов и в конце промывают метанолом.
Осадок удаляют с помощью фильтрации, высушивают и получают 0.059 г чистого
(21%) продукта (1) соответствующим фуллерену С60 композитному составу соединения (1). Rf
0.49 (г), проявители пары йода и УФ-лучи и Rf 0.38 (B) пары йода.
Продукт растворяется в ДСО, воде и тмине в максимальном количестве. Найдено %: С
74.71; Н 3.15; N 8.60 C81H41N8On(1301). Вычислено %: С 75.06; Н 3.28; N 7.81. ИК- спектр
квг, см-1: 3400 (ОН), 2740 (С60 NH), 365 (NH), 1720-1740 (С=О), 820(С=С), 1430 (С60), 1180
(С60). m/z: 1329,1306, 1283, 1260, 1236, 1213, 1191, 1164, 1140, 1116, 1092, 1008, 721, 720, 699.
Количество аминокислот в соединении (1) определяют по формуле (1).
m, _ m2 609 609 , „ „
W= —1-- = - = - = 1,93-2 остатка Ser
а - mn 3 106 318
w _ 609 = 1.3 остатка His 465
_609_ 609 _ 1.26 остатка Ala-Ala 3-160 480
Кислотный гидролиз соединения (1) для идентификации аминокислотных остатков проводится в 12н. HCl в течение 22ч. при 1220С. Освобожденные аминокислоты идентифицируют с помощью БХ в системе (А). На хроматограмме обнаруживают три аминокислоты Ser с Rf 0.68; His с Rf 0.62; Ala с Rf 0.44 проявитель раствор нингидрина.
ЛИТЕРАТУРА
1. Khalikov Sh.H. Synthesis of a-Amino Acid Derivatives of Fullerene C60 with Antiviral Properties / Sh.H. Khalikov, D.A. Sharipova, S.Z. Zafarov, M. Umarkhon, M. Jalalifar // International Journal of Modern Chemistry - 2016. 8(1). - Р. 1-18.
2. Khalikov, Sh. Kh. Synthesis and characterization of fuller-C60 a-amino acids with antiviral properties / Sh. Khalikov, D. Sharipova, S.Z. Zafarov // Journal Chemistry of Natural Compounds. - 2017. - №1. Vol. 53. - P.121-127.
3. Холиков, Ш.Х. Синтез и идентификация фуллеро С60 a-аминокислот с антивирусными свойствами / Ш.Х. Холиков, Д.А. Шарипова, С.З. Зафаров, М. Умархон, С.В. Алиева // Химия природных соединений. - 2017. - №1. - С.102-108.
4. Холиков, Ш.Х. Синтез аминокислотных и пептидных производных фуллерена С60 и их противовирусная активность в отношении вируса гепатита С / Ш.Х. Халиков, С.З. Зафаров, С.В. Алиева, М. Умархон // Журнал<^1оЬш» «Технические науки». - Санкт-Петербург. - 2019. Выпуск 7 (31). - С. 27-36.
5. Холиков, Ш.Х. Синтез и идентификация фуллеро С60 a-аминокислот с антивирусными свойствами / Ш.Х. Халиков, С.З. Зафаров, С.В. Алиева, М. Умархон, Д.А. Шарипова//Хими я природных соединений. - 2017. - №1. - С.102-108.
6. Лобзин, Ю.В. Вирусные гепатиты: / К.В. Жданов, В.М. Волжанин, Д.А. Гусев // клиника, диагностика, лечение. - СПб: «Фолиант», - 2006. - 183 с.
7. Жданов, К.В. Вирусные гепатиты / К.В. Жданов , Ю. В. Лобзин, Д. А. Гусев, К. В. Козлов // СПб. Фолиант. - 304 - (2011).
8. Lozano, R. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: / R. Lozano, M. Naqhav, K. Foreman, S. Lim, K. Shibuya // a sis tematil analysis for the Global Burden of Disease study 2010 Lencet. - 380. - (2012).
9. Мукомолов. С. Л. Эпидемиология и инфекционные болезни / С.Л. Мукомолов, И.А. Левакова, Л.Г. Сулягина, Е.В. Синайская, Д.Д. Болсун, Н.В. Иванова // Актуальные вопросы - №6. - 21-25 - (2012).
10. Анджапаридзе, О.Г. Культура ткани в вирусологических исследованиях / О.Г. Анджапаридзе, В.И. Гаврилов, Б.Ф. Семенов, Л.Г. Степанова // - М.: Гос. изд. мед. литературы. - 1962. - C. 235
11. Анисимова, Э. Проникновение вируса гриппа в клетки перевиваемой линии клеток почек собаки / Э. Анисимова, Н.К. Воркунова, В. Вонка, А.Г. Букринская // Цитология. - 1984. Т.24. - С. 316-318.
