CC BY
40НАУКА И ПЕРЕДОВОЙ ОПЫТ_
УДК: 577.29 DOI: 10.24418/KIPZ.2019.4.0005
Синтетический трехпородный кросс кролика и его «новизна» по отношению к исходным породам
Е.С. ЩУКИНА1, м.н.с.
В.И. ГЛАЗКО1,2, д.с-х.н., академик РАН (иностранный член) Т.Т. ГЛАЗКО1,2, д.с-х.н., профессор Г.Ю. КОСОВСКИЙ1, д.б.н., профессор РАН А.Р. ШУМИЛИНА1, к.с-х.н.
1ФГБНУ НИИПЗК
2ФГБОУ ВО РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева
e-mail: [email protected]
Аннотация. Важнейшей задачей в настоящее время признана необходимость сохранения породного разнообразия одомашненных видов животных и его преумножение, от чего зависит устойчивое развитие кролиководства, направленное не только на увеличение продуктивности и сохранения отечественных генетических ресурсов, но и на повышение адаптивного потенциала животных. Особое значение в этой связи имеет сохранение имеющихся и создание новых пород домашнего кролика, животноводческая продукция которых имеет большое значение, как в производстве диетического мяса, так и в обеспечении сырья для производства меховых изделий. С целью формирования генофонда, в котором сочетается желательный баланс между продуктивным и адаптивным потенциалом животных, в ФГБНУ НИИПЗК создана новая синтетическая форма кролика на основе двух мясошкурковых (белый великан и советская шиншилла) и одной мясной (калифорнийская) пород по пятиэтапной схеме спариваний. Для контроля и управления созданным генофондом нового синтетического кросса необходим подбор наиболее информативных ДНК-маркеров полиморфизма геномных участков, позволяющих получать информацию об особенностях его генетической структуры, оценивать ее динамику в поколениях и разрабатывать методы ее коррекции в желательном направлении. Полилокусное генотипирование родительских форм кролика и синтетического кросса проводилось с использованием наиболее полиморфных молекулярно-генетических маркеров - мультилокусных ISSR-маркеров (Inter Simple Sequence Repeats) - межмикросателлитных последовательностей и IRAP (Inter-Retrotransposon Amplified Pofymorphism) - фрагментов геномной ДНК, фланкированных инвертированными повторами транспозонов. Генетические расстояния (Nei, 1972), рассчитанные по спектрам продуктов амплификации праймеров (GCT)6C, (ACC)6C и участка длинного концевого повтора ретротранспозона Sabrina 1336 (Shirasu et al., 2000), свидетельствуют о том, что синтетический породный кросс наиболее удален от калифорнийской родительской породы и близок к породе белый великан, что хорошо согласуется с историей формирования пород и нового кросса. Выполненный анализ позволил выявить ISSR и IRAP маркеры, по которым новый синтетический кросс существенно отличается от родительских пород, что подтверждает популяционно-генетическую новизну группы кроликов, полученных в результате селекционной работы.
Ключевые слова: кролик, синтетический трехпородный кросс, генотипирование, ISSR, IRAP, транспозоны, микросателлиты, молекулярные генетические маркеры, доля полиморфных локусов, PIC, EMR, MI.
Введение. Получение новых форм животных сельскохозяйственных видов, как известно, рассматривается как селекционные достижения в том случае, когда они удовлетворяют четырем показателям: новизна, отличимость, однородность и стабильность, которые определяют по диапазону изменчивости фенотипических характеристик животных. Поскольку фенотипическая изменчивость по многим признакам зависит от факторов окружающей среды, дополнительным показателем, увеличивающим надежность определения селекционного достижения, могли бы быть популяционно-генетические характеристики, отличающие новую форму животных от форм, используемых в процессе ее выведения.
Молекулярно-генетические маркеры являются наиболее универсальным инструментом для решения множества генетических задач в селекции животных, например, генотипирование пород, изучение их генеалогии
и взаимосвязей, разработка методов их улучшения путем целенаправленного использования собственного генетического потенциала и внесения генетического материала как от близкородственных, так и от удаленных форм [3]. К настоящему времени в популяционно-генетических исследованиях применяется широкий спектр молеку-лярно-генетических маркеров полиморфизма различных геномных элементов, наиболее широко используемые - микросателлитные локусы (например, [14]). В то же время, особый интерес среди микросателлитных локусов представляет та их часть, которая потенциально предрасположена к формированию вторичных структур ДНК за счет наличия инвертированных копий на относительно небольших расстояниях (2000 - 400 пар оснований - п.о.). Использование одного праймера для выявления его инвертированных повторов позволяет одновременно получать полилокусные спектры, что уменьшает экономические и
временные затраты на исследование. Наиболее информативными из молекулярно-генетических маркеров являются мультилокусные ISSR-маркеры (Inter Simple Sequence Repeats) - межмикросателлитные последовательности [5] и IRAP (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism) - фрагменты геномной ДНК, фланкированные инвертированными повторами терминальных участков (LTR- Long Terminal Repeat) транспозонов, отличительной чертой которых является то, что они наследуются по доминантному типу и являются высокополиморфными молекулярными маркерами [7] с предрасположенностью к формированию вторичных структур ДНК (шпилек и петель), что является основой для геномной нестабильности в участках их локализации [3].
Относительно уменьшенный полиморфизм по микро-сателлитным локусам обнаружен у домашнего кролика по сравнению с популяциями дикого [9]. Несмотря на выраженную дифференциацию пород кроликов по ряду таких фенотипических признаков, как окрас и тип шерстного покрова, плодовитость крольчих, живая масса молодняка и некоторых других [4], их генетическое разнообразие не только по микросателлитам, но и по распространенности ряда эндогенных ретровирусов выше у диких по сравнению с домашними кроликами. В то же время, некоторые варианты эндогенных ретровирусов у домашнего кролика встречались существенно чаще, чем у дикого [18]. Предполагается, что такая разница между фенотипическим разнообразием и относительно пониженным полиморфизмом может быть обусловлена одомашниванием кролика [21].
На базе ФГБНУ НИИПЗК была создана новая синтетическая порода кролика, которого условно назвали трехпородным кроссом. В селекции использовали пя-тиэтапную систему скрещиваний трех пород кроликов: калифорнийская, советская шиншилла и белый великан [4]. Новая синтетическая форма кролика не уступает по продуктивным качествам импортным аналогам, разводимым на кроликокомплексах страны. С целью выяснения популяционно-генетических особенностей созданной группы кроликов в настоящей работе решались следующие задачи: 1) оценка популяционно-генетического сходства между родительскими породами кроликов по спектру фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросталеллитов и ретротранспозонов (ISSR-PCR, IRAP-PCR), и выявление наиболее информативных полилокусных маркеров, вовлеченных в межпородную дифференциацию; 2) сравнение популяционно-генети-ческих структур родительских пород и синтетического кросса по полилокусным спектрам; 3) генофондная оценка новизны генетических структур синтетического кросса по сравнению с родительскими формами. Схема взаимоотношений между исходными породами кроликов, использовавшихся при получении синтетического кросса, представлена на рис.1.
Порода кроликов белый великан была выведена на северо-западе Бельгии в регионе Фландрия, от чего произошло второе название бельгийского великана — фландр. Первые достоверные данные о них относятся к 60-м годам XIX века. Первый стандарт для этой породы учрежден
в 1893 году. В СССР белые великаны попали во второй половине двадцатых годов. Но поскольку климат отличался от места выведения породы - кролики замерзали и погибали. Советские селекционеры проделали работу по адаптации белых кроликов великанов путем селекции с кроликами породы шиншилла и серый великан, с последующим тщательным отбором лучших кроликов из помета, а также организацией их правильного кормления[2].
Калифорнийская порода кроликов создавалась на основе пород шиншилла и гималайская (ее также называют «русский горностаевый кролик». Полученное помесное потомство затем скрещивали с новозеландской белой породой кроликов. Выведенную таким способом породу назвали в честь штата Калифорния, на юге которого она и была создана [2].
Порода кроликов под названием «шиншилла» (Chinchilla) изначально была создана во Франции в начале прошлого века. Такое название для породы шкуркового направления было выбрано из-за схожести окраса кроликов с расцветкой грызуна шиншиллы из Южной Америки. Для выведения породы французские селекционеры скрестили голубого бевернского, русского горностаевого и дикого кроликов. Впервые порода шиншилла была представлена на парижской выставке в 1913 году, и в течение следующего десятилетия эти кролики быстро распространились по всей Западной Европе. В 1927—1928 годах в СССР была импортирована экспериментальная партия шиншилл - американские мелкие шиншиллы, имевшие густой и хороший мех, мелкие по размеру и массе. В результате скрещивания с белым великаном и длительного направленного отбора и подбора в условиях хорошего кормления, ухода и содержания значительно повысился их живой вес - до 5 кг. В 1963 году в СССР утверждена новая отечественная порода кроликов - советская шиншилла. Порода создана коллективами кролиководов зверосовхозов «Анисовский», «Черепановский» и НИИПЗК — Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства в 1932 году [2].
Рисунок 1. Схема происхождения пород кроликов, использовавшихся для получения нового синтетического кросса.
Материалы и методы. Опыт проведен в отделе биотехнологии Научно-исследовательского института пушного звероводства и кролиководства имени В.А. Афанасьева на кроликах трех пород: советская шиншилла, белый великан и калифорнийская и синтетической форме, полученной на основе этих пород.. Экстрагирование ДНК проводили с помощью набора ДНК-М-Сорб («Синтол», Россия). Полимеразную цепную реакцию (PCR) проводили в амплификаторе Swift Maxi (Esco, Сингапур) с использованием наборов ПЦР-РВ («Син-тол», Россия). В качестве праймеров в PCR использовали последовательности, представленные в табл.1. С готовой ПЦР смесью (20 мкл) амплификацию выполняли по следующей программе: 2 мин при 95 С; 40 циклов - 20 с при 94 °С, 20 с при 55 °С, 2 мин при 72 °С; 2 мин при 72 °С. Фракционирование продуктов амплификации проводили в 1,5% агарозном геле в 1X TAE буфере при постоянном напряжении 100 В и силе тока 100 А в течении 60-90 минут. Гель фотографировали и анализировали под ультрафиолетовыми лучами в системе фотогельдокументации Quantum-ST4 (Vilber Lourmat, Франция).
Статистический анализ. PIC (Polymorphic Information Content-полиморфное информационное содержание) определяет способность маркера устанавливать полиморфизм популяции в зависимости от числа обнаруживаемых аллелей и распределения их частот [12]. Для доминантных маркеров максимальное значение PIC составляет 0,5 [11], поскольку для используемых типов маркеров допускается только два аллеля на локус и обе величины подвержены влиянию числа и частоты аллелей [11] (формула 1).
PIC = 2f (1-f) (1)
где f - частота одного из двух аллелей, рассчитанная как f=VR, где R- частота вариантов, у которых отсутствовал фрагмент ДНК соответствующей длины.
Доля полиморфных локусов является одной из характеристик генетической структуры популяции [1] (формула 2).
ДПЛ = ^ х 100 (2)
Где np - полиморфные локусы, n- общее число ло-кусов.
Индекс разнообразия Шеннона основан на теории информации, т.е. его значение определяется вероятностью наступления цепи событий. Результат выражается в единицах неопределенности, или информации. Расчеты этого индекса предполагают, что особи попадают в выборку случайно из неопределенно большой генеральной совокупности, причем в выборке представлены все виды генеральной совокупности [8] (формула 3).
Н = ~Y.Pi х Inр (3)
где рi —доля особей i-го вида ^=ш/№).
Метод Нея позволяет анализировать эволюционные изменения за большой промежуток времени, когда важное значение имеет кумулятивный эффект мутаций [16]. Известно, что D (генетическая дистанция) = 0.00—0.05 между географическими популяциями и породами; 0.02—0.20 между подвидами; 0.1—2.0 между видами, а генетическое расстояние между родами превышает 1
[16]. Генетическая дистанция и генетическое сходство рассчитывалось в программе TreeCon [22].
Эффективное мультиплексное отношение (Effective Multiplex Ratio, EMR) определяют, как произведение общего числа полиморфных локусов (на праймер) и доли полиморфных локусов от их общего числа [17] (формула
4).
где np — число полиморфных локусов, n — общее число локусов.
Маркерный индекс (Marker Index, MI) — статистическая величина, используемая для оценки эффективности маркерной системы к применяемой методике. Маркерный индекс есть произведение величины информационного полиморфизма (или ожидаемой гетерозиготности, НЕ) и эффективного мультиплексного отношения (EMR)
[17] (формула 5).
Результаты и обсуждение. Выполнен сравнительный анализ генетических структур трех пород кроликов и синтетического кросса на основании оценки полимор-_Таблица 1
Нуклеотидные последовательности, используемые в качестве праймеров в полимеразной цепной реакции для полилокусного генотипирования кроликов.
Маркер Последовательность Маркер Последовательность
(AGC)6T AGCAGCAGCAGCAGCAGCT Sabrina 111 [13], AAACAAGAACTGACACTTGGCACT
(TGC)6G TGCTGCTGCTGCTGCTGCG Sabrina 1336 [19], TCATGGCGTTGGGAGCAAGC
(АСС)бС ACCACCACCACCACCACCC Bare 123A [13] CCCTCTCGTAGATGGACATCACC
(GCT^A GTCGTCGTCGTCGTCGTCC Helitron [10] GCAACGCGTGGCCGG
(GCT^C GCTGCTGCTGCTGCTGCTC (ACC^G ACCACCACCACCACCACCG
(АСС)бТ ACCACCACCACCACCACCT (CTC^ CTCCTCCTCCTCCTCCTCC
(GAG^C GAGGAGGAGGAGGAGGAGC
физма суммарно 95 фрагментов ДНК различной длины, полученных в спектрах продуктов амплификации с использованием в PCR в качестве праймеров фрагментов длинных концевых повторов ретротранспозонов (Sabrina 111, Sabrina 1336, Bare 123A), ДЦК-транспозона (Helitron), а так же фрагменты геномной ДНК, фланкированные инвертированными повторами микросателлитов ((AGC)6T, (TGC)6G, (ACC) 6C, (GTC) 6C, (GCT) 6C, (ACC) 6T, (GAG)6C, 6ACC)6G, (CTC)6C). В полученных спектрах присутствуют фрагменты ДНК в диапазоне длин 2000-600 п.о. ((GCT)6C- 9 локусов, 2 консервативных, 7 полиморфных; Sabrina 1336 - 7 локусов, 2 консервативных, 5 полиморфных), 1600-600 п.о. ((AGC)6T -6 локусов, 2 консервативных, 4 полиморфных), 1800-650 п.о. ((ACC)6C - 7 локусов, 2 консервативных 5 полиморфных; (TGC)6G - 4 локуса, 2 консервативных, 2 полиморфных), 2000-700 п.о. ((ACC)6T - 9 локусов, 3 консервативных, 6 полиморфных), 2000-800 п.о. ((GCT)6A - 7 локусов, 2 консервативных, 5 полиморфных), 2000-400 п.о. ((ACC)6G - 11 локусов, 2 консервативных, 9 полиморфных; Sabrina 111 - 8 локусов, 2 консервативных, 6 полиморфных), 1600-700 п.о. ((CTC)6C -7 локусов, 1 консервативный, 6 полиморфных), 1700-800 п.о. ((GAG) 6C - 7 локусов, 3 консервативных, 4 полиморфных) и 1200-600 п.о. (Bare 123A - 4 локуса, 1 консервативный, 3 полиморфных; Helitron - 6 локусов, 4 консервативных, 2 полиморфных).
Проведена статистическая обработка данных на основании бинарной матрицы спектров продуктов амплификации фланкированных инвертированными повторами микросателлитов и ретротранспозонов по формулам №1, №2, №3, результаты представлены в таблице 2.
Из данных, представленных в таблице 2 видно, что полиморфное информационное содержание у исследованных групп кроликов по разным типам (ISSR-PCR и
IRAP-PCR) молекулярных маркеров варьирует от 0,188 до 0,495 (на примере PIC у породы белый великан) и если усреднять значение PIC для каждой породы по всем спектрам продуктов амплификации, как представлено на гистограмме (рис.2), полученные сглаженные значения не указывают на какие-либо выраженные различия между исследуемыми породами кроликов.
Средиее значение PIC
IRAP
■ Калифорнийская порода ■ Советская шиншилла ИБелый великан ■ С.шпнхм»кросс
Рисунок 2. Гистограмма среднего значения полиморфного информационного содержания у 3 пород кролика и синтетического кросса по спектрам продуктов амплификации, полученных с использованием ISSR-PCR и IRAP-PCR.
Усреднение значений доли полиморфных локусов, так же, как и полиморфного информационного содержания, не позволяет выявить межгрупповые различия у исследованных групп животных. Так, в среднем по ISSR маркерам ДПЛ составляет 47,97% (у породы калифорнийская), при этом разброс по спектрам продуктов амплификации разных праймеров варьирует от 20% до 71,42%, из чего следует, что более информативными маркерами для полилокусного генотипирования будут являться те, которые дают больше полиморфных ло-
Таблица 2
Полиморфное информационное содержание (PIC), доля полиморфных локусов (ДПЛ) и индекс Шеннона.
Маркеры Калифорнийская Советская шиншилла Белый великан Синтетический кросс Индекс Шеннона
ДПЛ,% PIC ДПЛ,% PIC ДПЛ,% PIC ДПЛ,% PIC
(GCT)6C 50,00 0,456 62,50 0,464 28,57 0,464 42,8 0,441 1,333
Sabrinal 11 57,14 0,390 50,00 0,376 62,50 0,392 62,5 0,382 1,332
(AGC^T 50,00 0,425 33,30 0,480 40,00 0,343 40,0 0,439 1,332
Sabrina 1336 71,42 0,457 42,85 0,464 50,00 0,425 33,3 0,341 1,332
(АСС)бС 42,85 0,345 40,00 0,454 20,00 0,414 50,0 0,439 1,320
(АСС)бТ 62,50 0,422 25,00 0,311 42,85 0,446 42,8 0,392 1,368
(TGC^G 25,00 0,494 25,00 0,432 25,00 0,495 25,0 0,464 1,386
Bare 123A 75,00 0,372 75,00 0,440 75,00 0,475 75,0 0,347 1,386
(GCT)6A 71,42 0,477 71,42 0,415 42,85 0,421 42,8 0,474 1,354
Helitron 20,00 0,495 20,00 0,273 16,60 0,188 16,6 0,188 1,386
(ACC^G 44,40 0,381 44,40 0,439 60,00 0,265 62,5 0,290 1,371
(СТС)бС 42,08 0,400 85,70 0,402 71,40 0,374 57,1 0,343 1,354
(GAG^C 42,08 0,292 42,80 0,387 57,10 0,390 33,3 0,301 1,357
Геномика
о.: Ч-
0.1 Ч-
ол Ч-
о.:
н-
L.1
ч-
Белый ьмнин Советски шлкшнхла Сптгтпкп! кресс
■ БёЛИМ Ei.TilhHH
■ Ka.it форный? кап
■ Свкт«ич«смй Kp«t
Рисунок 3. Кластерный анализ значений генетических дистанций между исследованными группами кроликов, рассчитанных на основании спектров фрагментов геномной ДНК, фланкированных (ACC)6C и ^0)6^ с использованием программы TгeeCon.
кусов в спектре продуктов амплификации отдельных праймеров. Так, наиболее полиморфным маркером для породы калифорнийская из представленных последовательностей молекулярных маркеров является Sabrina 1336 (ДПЛ=71%), для белого великана - Sabrina 111 (ДПЛ=62%), у породы советская шиншилла наиболее полиморфным является микросателлит (СТС)бС (ДПЛ=85%), а у синтетического трехпородного кросса
- (ACC)6G (ДПЛ=62%). Подобные примеры усреднения показателей для генетических маркеров по ДПЛ в ISSR-PCR есть и у остальных пород. Так, у советской шиншиллы средние значение ДПЛ 47,97% при разбросе данных 25-85,7%, у белого великана- 43,08% с минимальным 20% и максимальным 71,4% значениями, ДПЛ 44,05% в среднем обнаруживается у синтетического кросса при 20% - 62,5% разбросе данных по спектрам разных праймеров. По спектрам продуктов амплификации, фланкированных инвертированными повторами траспозонов, у калифорнийской породы кроликов среднее значение ДПЛ равно 55,89%, при минимальном значении в 20% по спектру ДНК-транспозона Helitron. Примерно сходные значения ДПЛ выявлены у пород советская шиншилла и белый великан. У синтетического кросса минимальный показатель ДПЛ составляет 16,6 (Helitron), при средних в 51,02% и 46,85% по ISSR-PCR и IRAP-PCR соответственно. Усреднение значений доли полиморфных локусов и полиморфного информационного содержания при полилокусном генотипировании пород по спектрам продуктов амплификации, полученных с использованием разных праймеров, не является информативным и такой метод анализа данных в исследовании межпородных генетических взаимоотношениях представляется недостаточно полным.
По рассчитанным генетическим расстояниям Нея [17] самая большая величина дистанции выявлена между синтетическим кроссом и калифорнийской породой по спектрам продуктов амплификации праймеров (GCT)6C
- 0,377; (ACC)6C - 0,151 и транспозоном Sabrina 1336
- 0,129. Наименьшее значение генетических расстояний обнаружено между трехпородным кроссом и родительской породой белый великан по спектрам праймеров (AGC>T - 0,009, (TGC>G - 0,0009, Sabrina 1336 - 0,004. На основании результатов расчета дистанций Нея выпол-
нен кластерный анализ методом UPGMA с построением дендрограмм (рис. 3).
По спектрам 4-х праймеров ((ACC>C, (ACC>T, (ACC)6G и Sabrinain) синтетический кросс выделяется в автономную «ветку» на дендрограммах (рис.3) по отношению к родительским породам. По-видимому, геномные участки, фланкированные инвертированными повторами этих праймеров, вовлекались в процессы формирования новой синтетической группы кроликов. В дальнейшем это может быть использовано для контроля популяционно-генетической структуры этой новой синтетической группы кроликов в поколениях.
Проведенный кластерный анализ с построением ден-дрограмм на основании расчета генетических дистанций [17] по спектрам продуктов амплифкации, позволил выделить пять праймеров ((GCI>C, (AGC>T, (TGC>G, Bare 123A и Sabrina i336), при использовании которых новый синтетической кросс выделяется в отдельный кластер вместе с породой белый великан. Это может объяснить не только тем, что белого великана использовали в создании новой синтетической формы кролика, но и участием белого великана в формировании породы советская шиншилла (рис.4), которая также входила в исходные породы при создании кросса.
Генетическое сходство пород белый великан и советская шиншилла по спектрам праймеров (АСС)бС - 0,942; (TGC)6G - 0,990; Bare 123 А - 0,996 и Sabrina 111 - 0,997),
0,1
Калифорнийская
Советская шиншилла
Белый б .лез пан
-Синтетический кросс
Рисунок 4 Кластерный анализ значений генетических дистанций между исследованными группами кроликов, рассчитанных на основании спектров фрагментов геномной ДНК, фланкированных Sabrina 1336, с использованием программы TreeCon
оцененное по методу Нея [17], соответствует схеме происхождения родительских форм кроликов (рис.1) и может объясняться участием породы белый великан в выведении породы советская шиншилла [6].
Спектры продуктов амплификации (ампликонов) праймеров (GCT^A, (CTCbC и (GAG>C при кластерном анализе формируют схемы кластеризации, отличные от представленных выше. По спектрам праймера (GCT)6A (рис.5) синтетический кросс кластеризуется с родительской породой калифорнийская, от которых в отдельную ветвь выделяется белый великан, примерно такая же кластеризация обнаруживается по спектрам праймера (СТС)бС (рис.6). Спектры ампликонов праймера (GAG>C (рис.7) формируют два кластера, группирующих кроликов следующим образом: советская шиншилла вместе с белым великаном в одной группе и калифорнийская с синтетическим кроссом в другой. Следует отметить, что последовательности (СТС)бС и (GAG)6C являются пурин/пиримидиновыми треками, предрасположенными к формированию таких вторичных структур ДНК, как триплексы, которые могут быть вовлечены в системы регуляции генной экспрессии [20], что может сопровождаться специфическими особенностями полиморфизма именно по этим последовательностям.
Результаты выполненного анализа сходства пород советская шиншилла и калифорнийская согласуются с данными об их происхождении и взаимосвязи, так между этими группами животных схожесть генетического спектра была наивысшей по праймеру (TGC)6G - 0,997. Высокие показатели индекса сходства наблюдались также в спектрах праймеров (ACC^C -0,953; (AGC)6T -0,981; (GCT>C-0,961.
Параметры EMR и MI широко используются в многочисленных исследованиях для выявления информативного потенциала молекулярных маркеров. Данная система позволяет просчитать соотношение между уровнем обнаруженного полиморфизма и общей характеристикой эффективности маркерной системы по выявлению множественных полиморфизмов [15].
По результатам подсчета значений EMR и MI (таб.2) можно выделить ряд молекулярных маркеров, которые одинаково высоко информативны для этих показателей для нескольких пород. К ним относятся, например, спектры транспозона Bare-123A в которых значения EMR, MI и ДПЛ (75%) трех пород - калифорнийская, советская шиншилла и белый великан - одинаково высоки. По спектрам праймера (GCT^C сходные высокие значения по этим показателям одновременно наблюдались у пород советская шиншилла и калифорнийская.
Обнаружено сходство показателей EMR и MI между белым великаном и новым синтетическим трехпород-ным кроссом по праймерам Sabrina 111 и (ACC^G (рис.8), но при этом по спектрам этих праймеров синтетический кросс выделяется в отдельную ветку, а не в общую группу с родительской формой. Объединение пород советская шиншилла и белого великана (рис.8)
0,2 0.1
Калифорнийская
Синтетический кросс
-Белый великан
-Советская шиншилла
Рисунок 5 Кластерный анализ значений генетических дистанций между исследованными группами кроликов, рассчитанных на основании спектров фрагментов геномной ДНК, фланкированных (0СТ)6А, с использованием программы ТгееСоп.
0,1
Калифорнийская
Синтетический кросс
- Белым великан
- Советская шиншилла
Рисунок 6 Кластерный анализ значений генетических дистанций между исследованными группами кроликов, рассчитанных на основании спектров фрагментов геномной ДНК, фланкированных (СТС)6С, с использованием программы ТгееСоп.
0.1
Советская шиншилла
Белый великан Калифорнийская
-Синтетический кросс
Рисунок 7 Кластерный анализ значений генетических дистанций между исследованными группами кроликов, рассчитанных на основании спектров фрагментов геномной ДНК, фланкированных (0А0)6С, с использованием программы ТгееСоп.
0.3 0.2 0.1
Советская шиншилла
Белый великан
- калифорнийская
- Синтетический кросс
Рисунок 8 Кластерный анализ значений генетических дистанций между исследованными группами кроликов, рассчитанных на основании спектров фрагментов геномной ДНК, фланкированных (АСС)60, с использованием программы ТгееСоп.
Таблица 3
Эффективное мультиплексное отношение и маркерный индекс спектров продуктов амплификации ISSR-PCR и 1ВДР-РСР
Маркеры Калифорнийская Советская шиншилла Белый великан Синтетический кросс
EMR MI EMR MI EMR MI EMR MI
(GCT)6C 2,00 0,912 3,571 1,658 0,571 0,265 1,285 0,566
Sabrina111 2,285 0,893 2,00 0,753 3,125 1,227 3,125 1,194
(AGC)6T 1,500 0,638 0,666 0,319 0,800 0,275 0,800 0,351
Sabrina 1336 3,571 1,633 1,285 0,596 1,500 0,680 0,666 0,225
(ACC)6C 1,285 0,444 0,800 0,363 0,200 0,082 1,00 0,439
(ACC)6T 3,125 1,319 0,500 0,155 1,285 0,573 1,285 0,466
(TGC)6G 1,00 0,494 0,250 0,108 0,250 0,123 0,250 0,086
Bare 123A 2,250 0,931 2,250 0,992 2,250 1,068 2,250 0,780
(GCT)6A 3,571 1,704 3,571 1,483 1,285 0,541 1,500 0,711
Helitron 0,200 0,099 0,200 0,054 0,166 0,031 0,166 0,031
(ACC)6G 1,777 0,678 2,000 0,879 3,600 0,954 3,125 0,909
(CTC)6С 1,285 0,518 5,142 2,071 3,571 1,337 1,285 0,441
(GAG)6C 1,285 0,375 1,285 0,498 2,285 0,897 0,666 0,199
в общий кластер может объясняться тем, что кроликов породы белый великан селекционеры использовали как основную породу для скрещиваний при формировании породы советская шиншилла.
Заключение. Спектры продуктов амплификации, полученные при использовании в качестве праймеров участков микросателлитных локусов (ISSR-PCR маркеры) существенно отличаются друг от друга, так же как и при применении в этих же целях участков мобильных генетических элементов (длинных концевых повторов эндогенных ретровирусов, идентификационной последовательности ДНК транспозона хелитрона). Исходя из кластерного анализа данных, с построением дендро-грамм методом UPGMA на основе расчета генетических дистанций, новый синтетический трехпородный кросс выделяется в отдельную ветвь суммарно по спектрам четырех праймеров (ACC>C, (ACC>T, (ACC>G и Sabrinain. По спектрам праймеров (GCT^C, (AGC>T, (TGC)6G, Bare 123A и Sabrina 1336 синтетический кросс объединяется в общий кластер с породой белый великан, что хорошо согласуется с участием белого великана в происхождении других родительских пород синтетического кросса. Полученные данные об уникальности генетической структуры трехпородного кросса по сравнению с исходными родительскими породами свидетельствуют о высокой эффективности селекционной работы, которая привела к формированию группы кроликов, популяционно-генетическая структура которой может генетически обоснованно считаться новой среди исследованных пород.
Можно заключить, что генетическую идентификацию пород советская шиншилла и белый великан следует проводить по спектрам ампликонов, полученных с использованием микросателлитов (ACC)6G и (GAG)6C в
качестве праймеров, так как по представленным прай-мерам кластерный анализ с построением дендрограмм методом UPGMA, основанным на дистанциях Нея, выявляет картину схожую с историей формирования этих пород. Эффективное мультиплексное отношение и маркерный индекс выявили наивысшие значения этих показателей для данных пород кроликов (советская шиншилла - EMR=2,0 и MI=0,8; белый великан - EMR=3,6 и MI=0,9 по спектрам микросателлита (ACC^G; по спектрам (GAG)6C советская шиншилла - EMR=1,2 и MI=0,4; белый великан - EMR=2,3 и MI=0,8), что наглядно свидетельствует о возможности выявлять породоспецифические особенности популяционно-ге-нетических структур исследованных групп кроликов с использованием ISSR и IRAP маркеров.
Список литературы:
1. Айала Ф., Кайгер Дж./Современная генетика В трех томах/ Том 3 Перевод с английского д-ра физ.-мат. наук А. Д. Ба-зыкина МОСКВА "МИР" 1988
2. Вагин Е. А., Цветкова Р. П. «Кролиководство в личных хозяйствах» / Под ред. Балакирева Н. А.. — М.: Московский рабочий, 1981. — 160 с. — 75 000 экз. — ISBN 5-75450579-5.
3. Глазко В. И., Гладырь Е. А., Феофилов А. В., Бардуков Н. В., Глазко Т. Т. ISSR-PCR маркеры и мобильные генетические элементы в геномах сельскохозяйственных видов млекопитающих // С.-х. биол., Сельхозбиология, S-h biol, Sel-hoz biol, Sel'skokhozyaistvennaya biologiya, Agricultural Biology. 2013. №2.
4. Жвакина А.Р., Харламов К.В., Тинаев Н.И., Голованова Е.В. Создание отечественного мясного гибрида кроликов // Кролиководство и звероводство. 2017. №3. - С. 22-24
5. Лиманская С.В., Мирошниченко Л.А., Гопций Т.И., Корне-ева О.С. Полиморфизм RAPD- и ISSR-маркеров у зерновых видов амаранта // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2017;21(2):189-197 DOI 10.18699/VJ17.236
6. Мирось В.В. Совершенствовать продуктивные качества
кроликов / В.В. Мирось // Кролиководство и звероводство. — 1988. — № 4. — С. 10-11
7. Нигматуллина Н.В., Кулуев А.Р., Кулуев Б.Р. Молекулярные маркеры, применяемые для определения генетического разнообразия и видоидентификации дикорастущих растений. // Биомика. 2018.Т10(3).С. 290-318. DOI: 10.31301/2221-6197.bmcs.2018-39
8. Розенберг Г.С. /Информационный индекс и разнообразие: Больцман, Котельников, Шеннон, Уивер... 2010 Самарская Лука: проблемы региональной и глобальной экологии. 2010. - Т. 19, № 2. - С. 4-25. УДК 574.5 9
9. Alves JM, Cameiro M, Afonso S, Lopes S, Garreau H, Boucher S, et al. (2015) Levels and Patterns of Genetic Diversity and Population Structure in Domestic Rabbits. PLoS ONE 10(12): e0144687. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0144687
10. Babii A, Kovalchuk S, Glazko T, Kosovsky G, Glazko V. Helitrons and Retrotransposons Are Co-localized in Bos Taurus Genomes. Curr Genomics. 2017 Jun;18(3):278-286.doi: 10.2174/138920291866616 1108143909
11. Bolaric S., Barth S., Melchinger A.E., Posselt U.K. Genetic diversity in European perennial ryegrass cultivars investigated with RAPD markers. Plant Breed., 2005, 124: 161-166 (doi: 10.1111/j. 1439-0523.2004.01032.x)
12. Botstein D., White R.L., Skalnick M.H., Davies R.W. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphism. Am. J. Hum. Genet., 1980, 32: 314-331
13. Caldwell,K.S.,Langridge,P. And Powell,W. Comparative sequence analysis of the region harboring the hardness locus in barley and its colinear region in rice JOURNAL Plant Physiol. 136 (2), 3177-3190 (2004)
14. Kanthaswamy S, Oldt RF, Montes M, Falak A. Comparing two commercial domestic dog (Canis familiaris) STR genotyping kits for forensic identity calculations in a mixed-breed dog population sample. Anim Genet. 2019;50(1):105-111. doi: 10.1111/age.12758
15. Medhia K., D.K.Sarmaha, M.Dekab, B.S.Bhau./High gene flow and genetic diversity in three economically important Zanthoxylum Spp. of Upper Brahmaputra Valley Zone of NE India using molecular markers Volume 2, December 2014, Pages 706-721./Meta Gene https://doi.org/10.1016/j. mgene.2014.09.009
16. Nei M. The genetic distance between populations // Amer. Natur. 1972. V. 106. P. 283-291
17. Powell W., Morgante M., Andre C., Hanafey M., Vogel J., Tingey S., Rafalski A. The utility of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis. Mol. Breed., 1996, 2: 225-238 (doi: 10.1007/BF00564200)
18. Rivas-Carrillo SD, Pettersson ME, Rubin CJ, Jern P. Whole-genome comparison of endogenous retrovirus segregation across wild and domestic host species populations. Proc Natl Acad Sci US A. 2018;115(43):11012-11017. doi: 10.1073/ pnas.1815056115
19. Shirasu,K.,Schulman,A.H., Lahaye,T. and Schulze-Lefert,P. A contiguous 66-kb barley DNA sequence provides evidence for reversible genome expansion JOURNAL Genome Res. 10 (7), 908-915 (2000)
20. Tatiana T. Glazko 2 Gleb Yu. Kosovskiy 3 Svetlana N. Kovaltchuk 4 Boris L. Zybailov 5 Valery I. Glazko./Genomic Scanning Using Inverted Repeats of Microsatellites (GAG)6C, (AG)9C./Biogeosystem Technique, 2015, Vol.(4), Is. 2June 2015 with 64 Reads. DOI: 10.13187/bgt.2015.4.138
21. Whitman BD. Domestic Rabbits & Their Histories: Breeds of the World. Leathers Publishing; 2004.
22. http://bioinformatics.psb.ugent.be/downloads/psb/Userman/ treeconw.html
DOI: 10.24418/KIPZ.2019.4.0005 Synthetic three-breed cross-rabbit and its "novelty" in comparison to the parent breeds
E.S. SHCHUKNA1, junior researcher
V.I GLAZKO12, Dr. Sc. (Agriculture), Academician of RAS (foreign member)
T. T. GLAZKO12, Dr. Sc. (Agriculture), Professor G.Yu. KOSOVSKY1, Dr. Sc. (Biology), Professor of RAS A.R. SHUMILINA 1, Ph.D (Biology)
1FSBSI NIIPZK 2RSAU-MTAA
e-mail: [email protected]
Summary. The most important task at now is the need to preserve the breed diversity of domesticated animal species and its multiplication, on which depends the sustainable development of rabbit breeding, aimed not only the increasing the productivity and conservation of domestic genetic resources, but also to increase the adaptive potential of animals. In this regard the particular importance is the preservation of existing and the creation of new breeds of domestic rabbit, livestock products of which have of great importance, both in the production of dietary meat and in the provision of raw materials for the fur production. With the purpose of formation of the gene pool, which combines the desirable balance between productive and adaptive potential of animals it was created in FSBSI NIIPZK the new synthetic rabbit form on the basis of two meat-skin (White Giant and Soviet Chinchilla) and the meet (California) breeds according to the five-stage scheme of mating. It is necessary to use the most informative DNA markers of genomic sites polymorphism to control and manage the gene pool of a new synthetic breed, allowing to obtain information about the features of its genetic structure and its dynamics in generations and to develop methods for its correction in the desired direction, Polylocus genotyping of the parental forms of the rabbit and synthetic cross were carried out using the most informative molecular genetic markers - multilocus ISSR markers (Inter Simple Sequence Repeats) - between inverted microsatellite sequences and IRAP (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism) - fragments of genomic DNA flanked by inverted repeats of transposons. The greatest genetic distance (M. Nei, 1972) in the studied rabbit breeds on the molecular genetic markers, according to the calculations of the amplification product spectra, was observed between the synthetic three-breed cross and Californian breed by primers (GCT)6C; (ACC)dC and transposon Sabrina 1336. EMR (Effective Multiplex Ratio) and MI (Marker Index), widely used in numerous studies with the aim of identifying the informative potential of molecular markers, the results of which are comparable to the high values of the indicators to each other, we can identify a number of primers, which are highly informative for several rabbit breeds, so the transposon Bare-123A equally high for EMR and MI to California, Soviet Chinchilla and White Giant breeds. Comparative evaluation of dendrograms, polymorphic information content and such indicators as EMR and MI allowed to reveal molecular markers necessary for genetic identification of parent rabbit breeds in comparison with synthetic three-breed cross. In this study, 40 animals (10 animals from each breed) were genotyped, 95 loci were analyzed, of which 66 were polymorphic and 29 were conservative.
Keywords: rabbit, synthetic three-breed cross, genotyping, ISSR, IRAP, transposons, microsatellites, molecular genetic markers, proportion of polymorphic loci, PIC, EMR, MI.
