CC BY
56
УДК 636.92.082:575.2
анализ аллелофонда кроликов отечественных пород методом issr-pcr
А.Р. ЖВАКИНА1, кандидат биологических наук, ученый секретарь (e-mail: [email protected])
И.А. ЕЛЬСУКОВА2, кандидат биологических наук, специалист
А.П. ЛЕГКОБИТ1, кандидат биологических наук, зав. лабораторией
Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства имени В.А. Афанасьева, ул. Трудовая, 6, пос. Родники, Раменскийр-н, Московская обл., 140143, Российская Федерация
2КоудайсМКорма, дер. Летово, 5, Москва, 142741, Российская Федерация
Резюме. В последние годы все возрастающий интерес в животноводстве приобретает развитие отрасли кролиководства - источника диетического мяса. Вследствие быстрых темпов воспроизводства (высокая плодовитость, скорость роста молодняка, получение 5-7 окролов в год на крольчиху и др.) и возможности получения прибыли в короткие сроки эта отрасль привлекательна и для развития бизнеса. В последние годы племенное поголовье кроликов часто завозят из-за рубежа, при этом отечественные породы необходимо совершенствовать по продуктивным показателям. Цель наших исследований - изучение возможности применения молекулярно-генетических методов в племенной работе с кроликами посредством выявления локусов, маркирующих селекционно значимые признаки (интенсивность прироста живой массы крольчат, принадлежность к определенной породе, величина помета). Получены данные по аллелофонду кроликов пород советская шиншилла и белый великан и их помесей с использованием ISSR-PCR метода, охарактеризованы спектры ампликонов, полученные при использовании двух олигонуклеотидов: (AG)9C и (GA)9C. Выявлены локусы, рецессивные аллели которых могут служить маркерами породы советская шиншилла и белый великан. Для первой из них - это аллель длиной 495 п.н. в спектре ампликонов прай-мера (AG)9C, и длиной 1870 и 455 п.н. в фингерпринте прай-мера (GA)C, для второй - аллель длиной 355 п.н. из спектра ампликонов праймера (AG)9C. Определены два локуса для ампликонов праймера (AG)^, частота встречаемости которых отличается у групп животных из разных пометов: алелли длиной 680 и 355 п.н. При этом доминантный аллель локуса длиной 355 п.н. не был обнаружен у животных из небольших пометов (6 и менее крольчат), что может быть использовано в качестве маркера этого признака.
Ключевые слова: кролик, селекция, молекулярно-гене-тический анализ, ISSR-PCR, фингерпринтинг. Для цитирования: Жвакина А.Р., Ельсукова И.А., Легкобит А.П. Анализ аллелофонда кроликов отечественных пород методом ISSR-PCR //Достижения науки и техники АПК. 2016. Т. 30. № 1. С. 72-74.
В селекции сельскохозяйственных животных XXI века значительную и все возрастающую роль призвана сыграть молекулярная генетика. Разработка и широкое использование методов этого направления существенно ускорит темпы генетического улучшения животных [1]. В селекции многих сельскохозяйственных животных уже внедрены молекулярно-генетические методы с целью более интенсивного увеличения темпов наращивания их продуктивных качеств [2]. В звероводстве и кролиководстве подобные работы только начинают проводить. Благодаря молекулярным маркерам появляются новые, более точные методы паспортизации пород животных, использование которых позволяет значительно ускорять процесс селекции [3].
В нашей стране впервые в звероводстве по данным молекулярного анализа генома (RAPD- и ISSR-методы)
были определены филогенетические связи и рассмотрены особенности генетической дифференциации пород и типов лисиц, песцов и енотовидной собаки клеточного разведения по полиморфизму мультилокусных фрагментов ДНК. Было установлено, что RAPD-анализ предпочтителен для изучения таксономических связей на уровне вид, порода, тип, в то время как ISSR-метод целесообразно применять, для проведения популя-ционных исследований пушных зверей семейства Сanidae [4].
Актуальными остаются вопросы сохранения, рационального использования биоресурсов и создания новых высокопродуктивных селекционных форм, пород, гибридов [5].
На протяжении последних лет из-за рубежа завозят гибридных кроликов, в основном, для быстрого получения потомства на мясо в крупных промышленных предприятиях. Но фермеры при этом попадают в зависимость от поставок новых прародительских форм. Одна из актуальных задач на сегодня в кролиководстве - это получение гибридных кроссов кроликов с повышенными темпами прироста живой массы, при сохранении хорошей плодовитости в период воспроизводства. С этой целью проводятся работы по выведению отечественного гибридного кролика и молекулярному маркированию признаков продуктивности для ускорения селекционного процесса.
В ходе первого этапа исследований по созданию межпородного гибридного кролика было установлено наилучшее сочетание исходных пород: белый великан (БВ) - отцовская форма и советская шиншилла (СШ) - материнская форма. Помесный молодняк кроликов (БВ х СШ) показал хорошую скороспелость. Во все рассматриваемые периоды роста (45, 60, 77 и 90 дн.) особи этой гибридной группы по живой массе достоверно превосходили своих чистопородных (СШ «в себе», БВ «в себе») и реципрокных помесных (СШ х БВ) сверстников. Помесный молодняк (БВ х СШ) достиг рекомендуемой для промышленного кролиководства убойной кондиции по живой массе уже в возрасте 77 дн. [6].
Учитывая, что в зарубежных публикациях не приведено схем выведения гибридных кроссов кроликов и существует необходимость создания отечественного гибрида, представляет интерес всестороннее изучение молекулярно-генетических характеристик кроликов чистопородного разведения и при межпородном скрещивании.
Целью наших исследований было выявление локу-сов, маркирующих признаки, которые имеют важное селекционное значение (породность, число детенышей в помете, живая масса крольчат) при создании популяции отечественного гибридного кролика.
Таблица 1. Характеристика групп животных по величине живой массы в возрасте 45 дн.
Группа Число животных, гол. Живая масса крольчат
M ± m, г I а
1 14 1024,57 ± 39,2** 141,45 2 17 893,82 ± 13,3 53,19
Здесь и далее: * - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001
Таблица 2. Характеристика групп животных по
Условия, материалы и методы. Работа выполнена на базе ПЦР-лаборатории и экспериментальной фермы «Наука» НИИПЗК в 2011-2012 гг. Для проведения исследований были отобраны пробы биоматериала (цельная кровь) от четырех групп кроликов (кровь была взята от молодняка - приплода, полученного от разных вариантов спаривания, по 9 образцов в каждой группе): I - чистопородные (советская шиншилла - СШ),
и численность помета, из которого они рождены. В нашем опыте не имело смысла исключать таких особей из обсчета, так как мы не проводим взаимосвязей между разными показателями продуктивности.
ДНК из цельной крови кроликов экстрагировали сорбентным методом с использованием набора реактивов «ДНК-сорб-В» (ЦНИИ Эпидемиологии, Москва), в качестве праймеров использовали олигонуклеотиды (AG)9C и ^А)9С. Реакционная смесь для ПЦР общим объемом 25 мкл включала 1 ед. модифицированной Taq-полимеразы, 0,25 мМ каждого дНТФ, 2,5 мМ МдС12, 1х ПЦР-буфер Б и 21,5 пкмоль праймера (AG)9C или 10,0 пкмоль праймера ^А)9С («Синтол», Россия). Программа амплификации: 95°С - 2 мин; 35 циклов: 95°С -30 с, 55°С - 30 с, 72°С - 105 с; 72°С - 5 мин. Детекцию
типу рождения
Группа Количество животных, гол. В числе скольких родился
M ± m, гол. I a
1 20 9,21 ± 0,16*** 0,71 2 16 6,06 ± 0,29 1,12
Таблица 3. Характеристика локусов, частота встречаемости которых достоверно различается между группами животных
Характеристики локуса Частота встречаемости локуса у группы животных
Идентифицирован в длина бэнда, п.н. I II III IV
Спектр ампликонов праймера (AG)9C 960 760 680 600 560 0,5528*и,ш 0,3675 0,1056**и,ш 0,5528 0,3675 0,1835 0,1437*ш 0,1437*IV 0,2697* 0,1056*ш 0,2929 0,2929 0,5918 0,2929 0,1835 0,2929 0,134 0,2929 0,2929 0,134
Спектр ампликонов праймера (GA)9C 495 410 355 340 1870 575 550 455 0*И,Ш 0,5528*иш 0,5528*"J" 0,1056***и,ш 0**III 1,0*IV 0,2254 0*IV 0,0339 0,1437 0 0,0691 0,1056**ш 0,3169 0,4226 0,1835 0,0871 0 0,1835 0,0871 0,5918 0,2929 0,0871*IV 0,1835 0 0,2929 0,134 0,2929 0,134 0,134 1,0 0,5
Числа в надстрочных индексах указывают группы, с которыми отмечены достоверные различия
II - чистопородные (белый великан - БВ), III - ¿БВ х $СШ, IV - ¿СШ х $БВ. Для сравнения аллелофондов
исследуемых групп животных использовали метод
ISSR-PCR [7]. Значение генетического расстояния между группами животных рассчитали на основании полиморфизма ампликонов [8]. Кроме того, кроликов разделяли на группы в зависимости от типа рождения (в числе скольких родился) и живой массе в возрасте 45 дн. (табл. 1, 2). Для пяти кроликов не было данных об их живой массе в 45 дн., но известно, какой они породы
рисунок. Генетическое расстояние между группами животных. Достижения науки и техники АПК. 2016. Т. 30. № 1 _
продуктов амплификации проводили вертикальным электрофорезом в 6%-ном полиакриламидном геле в течение 3 ч при напряженности электрического поля 10 В/см с последующим окрашиванием бромистым этидием. Выравнивание гелей, выявление паттернов и определение молекулярных масс бэндов осуществляли с использованием программного обеспечения BioNumerics v.6.6. (Applied Math, США), статистическую обработку результатов - с использованием программы, рекомендованной ФАО, TFPGA v.1.3.
результаты и обсуждение. В первой части эксперимента при использовании двух праймеров выявлено 90 локусов (58 из них были идентифицированы в фингерпринте праймера (AG)9C, 32 - в фингерпринте праймера (GA)9C). Доля полиморфных локусов в среднем по группам была равна 79,44%,средняя гетерози-готность с учетом всех изученных локусов - 0,2731. Границы длин локусов фингерпринта, полученного при использовании праймера (AG)9C, составили 230-1270 пар нуклео-тидов (п.н.), олигонуклео-тида (GA)9C - 280-2410 п.н. Доля полиморфных
Таблица 4. Характеристика локусов из фингер-принта праймера (AG)9С, достоверно отличающих группы животных из большого и малого помета
Длина бэнда, п.н. Частота встречаемости доминантных аллелей
7 и более крольчат 6 и менее крольчат
680 0,1255 0,3977* 355 0,1956* 0
локусов по первому праймеру - 78,87%, по второму -80,01%. При сравнении полученных фингерпринтов всех четырех групп кроликов выявлены 9 информативных локусов в спектре праймера (АО)9С и 4 - в спектре праймера (ОА)9С (табл. 3).
В результате исследований выявлены локусы, рецессивные аллели которых могут служить маркерами пород советская шиншилла и белый великан. Для первой из них это аллель длиной 495 п.н. в спектре ампликонов праймера (АО)9С, а также длиной 1870 и 455 п.н. в фингерпринте праймера (ОА)9С, для второй -аллель длиной 355 п.н. из спектра ампликонов праймера (АО)9С. Индекс генетического сходства между породами составил 0,142, что показывает хорошую дифференциацию пород с использованием ISSR-PCR маркеров (см. рисунок).
Определены два локуса из спектра ампликонов праймера (АО)9С, частота встречаемости которых отличается во всех группах животных из разных пометов -аллели длиной 680 и 355 п.н. (табл. 4).
При этом доминантный аллель локуса длиной 355 п.н. не был обнаружен у животных из небольших поме-
тов (6 и менее крольчат), что может быть использовано в качестве маркера этого признака.
При сравнении животных с разной живой массой маркеров высокой (низкой) продуктивности выявлено не было.
Утверждение обнаруженных аллелей в качестве маркеров требует дальнейших исследований на большем поголовье животных.
выводы. Таким образом с использованием метода ISSR-PCR охарактеризованы участвующие в скрещивании чистопородные популяции животных и их помесные сверстники по молекулярно-биологическим и продуктивным признакам. Впервые в Российской Федерации получены данные по аллелофонду кроликов пород советская шиншилла, белый великан и их помесей, охарактеризованы спектры ампликонов, полученные при использовании двух олигонуклеотидов: (АО)9С и (ОА)9С. Определены локусы, рецессивные аллели которых могут служить маркерами породы советская шиншилла - аллель длиной 495 п.н. в спектре ампликонов праймера (АО)9С, и длиной 1870 и 455 п.н. в фингерпринте праймера (ОА)9С, а также породы белый великан - аллель длиной 355 п.н. из спектра ампликонов праймера (АО)9С. Определены два локуса для праймера (АО)9С, частота встречаемости которых отличается у групп животных из разных пометов: алелли длиной 680 и 355 п.н. При этом доминантный аллель локуса длиной 355 п.н. не обнаружен у особей из небольших пометов (6 и менее крольчат), что может быть использовано в качестве маркера этого признака.
Литература.
1. Эрнст Л.К. Генетические основы селекции сельскохозяйственных животных. М.: ВИЖ РАСХН. 2004. 37 с.
2. Роль ДНК-маркеров признаков продуктивности сельскохозяйственных животных/Н.А. Зиновьева, О.В. Костюнина, Е.А. Гладырь, А.Д. Банникова, В.Р. Харзинова, П.В. Ларионова, К.М. Шавырина, Л.К. Эрнст//Зоотехния. 2010. № 1. С. 9-10.
3. Сулимова Г. Е. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области применения// Успехи современной биологии. 2004. Т. 124. № 3. С. 260-271.
4.Легкобит А.П. Молекулярно-генетическое разнообразие и филогения пород и типов пушных зверей семейства Canidae: автореф. дис. ... канд. биол. наук. Родники, 2013. 21 с.
5. Создание гибридов домашней козы и сибирского козерога с использованием криоконсервированного эпидидимального семени / Б.С. Иолчиев, П.М. Кленовицкий, В.А. Багиров, В.А. Воеводин, В.П. Кононов, Ш.Н. Насибов // Проблемы биологии продуктивных животных. 2011. № 1. С.29-31.
6. Продуктивность чистопородного и помесного молодняка кроликов отечественных пород белый великан и советская шиншилла / В.Н. Александров, К.В. Харламов, А.Р. Жвакина, Т.Л. Чичкова //Кролиководство и звероводство. 2013. № 6. С. 16-18.
7. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by sequence repeat (SSR) - anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics. 1994. № 20. P.176-183.
8. Nei M., Li W.-H. Mathemetical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases // Proc. Natn. Acad. Sci. USA. - 1979. V.76. - P.5269-5273.
ANALYSIS OF ALLELE POOL OF LOCAL BREEDS OF RABBITS BY ISSR-PCR
A.R. Zhvakina1, I.A. Elsukova2, A.P. Legkobit1
1 V.A. Afanasiev Research Institute of Fur Farming and Rabbit Breeding, ul. Trudovaya, 6, pos. Rodniki, Ramensky r-n, Moskovskaya obl., 140143, Russian Federation
2 KoudajsMKorma, der. Letovo, 5, Moskva, 142741, Russian Federation
Summary. In recent years, there is a growing interest in the livestock industry in rabbit-breeding as a source of dietetic meat. Due to the rapid race of reproduction (high productivity, growth rate of young animals, 5-7 litters in a year per a doe-rabbit, etc.) and due to the short-term profit opportunities, the industry is attractive for business development. In recent years the breeding rabbit stocks are imported from abroad and there is a need to improve the productive qualities of rabbits of domestic breeds. The goal of our research was to study the possibility of using molecular genetic techniques in breeding work with rabbits by identifying loci that mark characteristics used in breeding (the live weight gain intensity, belonging to a particular breed, litter size). The paper describes the allele pool data of rabbit breeds Soviet Chinchilla and White Giant and their hybrids, obtained by ISSR-PCR method; amplicons spectra by using two oligonucleotides: (AG)9C and (GA)9C are characterizes. Loci were identified, the recessive alleles of which may be markers for the Soviet Chinchilla and the White giant breeds. For the former this is the allele with the length of 495 bp in the amplicon spectrum of the primer (AG)9C, and the allele with the length of 1870 and 455 bp in fingerprint of the primer (GA)9C. For the latter this is the allele with the length 355 bp from the spectrum of amplicons of the oligonucleotide (AG)9C. There were identified two loci from the spectrum of the amplicons of the primer (AG)9C, the incidence of which is different for the groups of animals from different litters: the alleles with the lengths of 680 and 355 bp. Dominant allele locus length 355 bp was not detected in animals from small litters (6 kits and less), which can be used as a marker for this trait.
Keywords: rabbit, breeding, molecular genetic analysis, ISSR-PCR, fingerprinting.
Author Details: A.R. Zhvakina, Cand. Sc. (Biol.), academic secretary (e-mail: [email protected]); I.A. Elsukova, Cand. Sc. (Biol.), specialist; A.P. Legkobit, Cand. Sc. (Biol.), head of laboratory.
For citation: Zhvakina A.R., Elsukova I.A., Legkobit A.P Analysis of Allele Pool of Local Breeds of Rabbits by ISSR-PCR. Dostizheniya nauki i tekhnikiAPK. 2016. Vol. 30. No 1. Pp. 72-74 (in Russ.).
