CC BY
1
© Коллектив авторов, 2024
Бязрова М.Г.1' 2, Сухова М.М.1 3, Михайлов А.А.1 3, Гусева П.П.1 3,
Романова А.Ф.1, Прилипов А.Г.4, Филатов А.В.1' 3
Секвенирование генов Ig из единичных циркулирующих плазмабластов при острой 8ЛК8-СоУ-2-инфекции
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский университет дружбы народов им. Патриса Лумумбы» Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, 117198, г. Москва, Российская Федерация
3 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», 119234, г. Москва, Российская Федерация
4 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 123098, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Несмотря на бурное развитие высокопроизводительного секвенирова-ния, для генов ^ до сих пор основным методом остается секвенирование из единичных В-лимфоцитов по Сэнгеру. С помощью этого метода был получен целый ряд монокло-нальных антител (МкАт) для лечения и профилактики СОУГО-19.
В качестве источника генов ^ обычно выступают В-клетки памяти или плазматические клетки. Еще одним привлекательным объектом для секвенирования генов ^ и последующего создания антиген-специфических МкАт являются циркулирующие плазмабласты, которые совмещают в себе такие свойства, как высокий уровень экспрессии мРНК и экспрессия поверхностного В-клеточного рецептора.
Цель исследования - оптимизация метода секвенирования генов ^ из единичных циркулирующих плазмабластов. Исследование выполнено на примере плазмабластов, формирующихся при острой 8АЯ8-СоУ-2 инфекции.
Материал и методы. Забор крови у пациента с тяжелой формой СОУГО-19 проводили на 10-й день от появления первых симптомов. Плазмабласты выделяли из моно-нуклеарной фракции клеток крови с помощью проточного сортировщика клеток по фенотипу СБ 19+СВ27++СВ38++СВ3-СВ16-СБ14-. Секрецию определяли методом иммуноферментного анализа, а антитело-секретирующие клетки - методом ЕЫ8ро1 Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) клетки распределяли по одной на пробирку. После лизиса клеток синтез кДНК проводили с помощью набора Invitrogen 8ирег8спр! III (США). Далее образец делили пополам и раздельно проводили полугнездовую ПЦР для амплификации вариабельных генов тяжелой (УИ) и легкой (УЬ) цепи. Полученные ПЦР-продукты секвенировали по Сэнгеру. Нуклеотидные последовательности анализировали с использованием онлайн-инструмента Igblast с системой определения доменов ШвТ, а также программы ивЕ№Е (версия 50.0). ПЦР-продукты, полученные из одного образца, клонировали в экспрессионные векторы АЬУес-К^01-799 и АЬУес-К^Карра-798 для последующей наработки ^в. Клетки НЕК293 котрансфеци-ровали плазмидами, кодирующими легкую и тяжелую цепь
Результаты. В предварительных экспериментах было обнаружено, что при выделении В-клеток с помощью стандартного набора для иммуномагнитной сепарации происходит потеря популяции плазмабластов. В последующем плазмабласты выделяли методом сортировки с помощью проточного цитометра. Доля плазмабластов от всех В-лимфоцитов для обследованного пациента составила 15 %. Антитело-секретирующие клетки в популяции плазмабластов составляли 38 %. Были получены 15 парных последовательностей УЬ- и УИ-генов. Было выявлено 14 уникальных нуклеотидных последовательностей УЬ-генов и 10 уникальных нуклеотидных последовательностей УИ-генов. Полученные последовательности отличались от зародышевой конфигурации УИ и УЬ в пределах от 0 и до 25 % (медиана 9 %) и от 0 до 11 % (медиана 7 %) соответственно. СБКЗ-участки УИ генов заметно отличались друг от друга, в то время как СБЯ3-участки УЬ генов были схожи между собой. На основании определенных нуклеотидных после-
Для корреспонденции
Филатов Александр Васильевич -доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6460-9427
довательностей были получены два моноклона IgG, которые секретировались в супер-натант клеток HEK293, котрансфецированных экспрессионными векторами, несущими гены тяжелых и легких цепей IgG.
Заключение. Метод секвенирования генов Ig из единичных циркулирующих плазмабластов представляет собой перспективный подход для создания человеческих МкАт. Данный метод в сочетании с предварительной стимуляцией В-лимфоцитов in vitro, сортировкой антиген-специфичных клеток, а также использование иммунодефицит-ных мышей открывает новые возможности для разработки таргетных препаратов. Эти походы позволяют значительно ускорить процесс разработки новых терапевтических антител, что особенно важно в борьбе с новыми инфекционными заболеваниями.
Ключевые слова: плазмабласты; гены иммуноглобулинов; секвенирование; моноклональные антитела
Статья получена 10.09.2024. Принята в печать 28.10.2024.
Для цитирования: Бязрова М.Г., Сухова М.М., Михайлов А.А., Гусева П.П., Романова А.Ф. Прилипов А.Г., Филатов А.В. Секвенирование генов Ig из единичных циркулирующих плазмабластов при острой SARS-CoV-2-инфекции. 2024; 45 (6): 678-690. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-6-678-690
Финансирование. Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда (РНФ) № 23-2500486.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Сбор и обработка материала - Бязрова М.Г., Сухова М.М., Михайлов А. А., Гусева П.П., Романова А.Ф.; написание текста, редактирование - Бязрова М.Г.; окончательный вариант и целостность текста -Прилипов А.Г., Филатов А.В.
Byazrova M.G.1' 2, Sukhova M.M.1 3, Mikhailov A.A.1' 3, Guseva P.P.1' 3, Romanova A.F.1, Prilipov A.G.4, Filatov A.V.1, 3
Sequencing of Ig genes from single circulating plasmablasts during acute SARS-CoV-2 infection
1 National Research Center - Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency, 115522, Moscow, Russian Federation
2 Peoples' Friendship University of Russia named after P. Lumumba, Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation, 117198, Moscow, Russian Federation
3 M.V. Lomonosov Moscow State University, 119234, Moscow, Russian Federation
4 Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya, Ministry of Health of the Russian Federation, 123098, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. Despite the rapid development of high-throughput sequencing for Ig genes, the main method is still Sanger sequencing from single B lymphocytes. Using this method, a number of monoclonal antibodies have been generated for the treatment and prevention of COVID-19.
Memory B cells or plasma cells usually act as a source of Ig genes. Another attractive object for sequencing Ig genes and the subsequent generation of antigen-specific monoclonal antibodies are circulating plasmablasts, which combine such properties as high mRNA expression and expression of the surface B cell receptor.
The aim of the study is to optimize the method for sequencing Ig genes from single circulating plasmablasts. The study was carried out using the example of plasmablasts formed during acute SARS-CoV-2 infection.
Material and methods. Blood was collected from a patient with a severe form of COVID-19 on day 10 from the onset of the first symptoms. Plasmablasts were isolated from the mononuclear fraction of blood cells using a flow cell sorter by the CD19+CD27++CD38++CD3CD16CD14-phenotype. IgG secretion was determined by enzyme-linked immunosorbent assay, and antibody-secreting cells were determined by ELISpot. For PCR, the cells were distributed one cell per tube. After cell lysis, cDNA synthesis was performed using the Invitrogen SuperScript III kit. The sample was then divided in half and semi-nested PCR was performed separately to amplify the variable genes of the heavy (VH) and light (VL) chains. The resulting PCR products were sequenced according to Sanger. Nucleotide sequences were analyzed using the
For correspondence
Alexander V. Filatov -Dr.Sci., PhD, Professor, Head of the Immunochemistry Laboratory of NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6460-9427
Igblast online tool with the IMGT domain definition system and UGENE (version 50.0). PCR products obtained from one sample were cloned into the expression vectors AbVec-hIgG1-799 and AbVec-hIgKappa-798 for subsequent IgG production. HEK293 cells were co-transfected with plasmids encoding the Ig light and heavy chains.
Results. In preliminary experiments, it was found that the isolation of B cells using a standard immunomagnetic separation kit resulted in a loss of the plasmablast population. Plasmablasts were then isolated by flow cytometric sorting. The percentage of plasmablasts in total B lymphocytes for the patient studied was 15 %. Antibody-secreting cells accounted for 38 % of the plasmablast population. Fifteen paired sequences of the VL and VH genes were obtained. 14 unique nucleotide sequences of the VL genes and 10 unique nucleotide sequences of the VH genes were identified. The obtained sequences differed from the germline configuration of VH and VL within 0 to 25 % (median 9 %) and from 0 to 11 % (median 7 %), respectively. The CDR3 regions of the VH genes differed significantly from each other, while the CDR3 regions of the VL genes were quite similar. Based on the determined nucleotide sequences, two IgG monoclones were obtained, which was secreted into the supernatant of HEK293 cells co-transfected with expression vectors carrying the genes of IgG heavy and light chains.
Conclusion. The method of sequencing Ig genes from single circulating plasmablasts represents a promising approach for the creation of human monoclonal antibodies. This method, in combination with preliminary stimulation of B lymphocytes in vitro, sorting of antigen-specific cells, and the use of immunodeficient mice, opens up new possibilities for the development of targeted drugs. These approaches allow us to significantly accelerate the process of developing new therapeutic antibodies, which is especially important in the fight against emerging infectious diseases.
Keywords: plasmablasts; immunoglobulin genes; sequencing; monoclonal antibodies
Received 10.09.2024. Accepted 28.10.2024.
For citation: Byazrova M.G., Sukhova M.M., Mikhailov A.A., Guseva P.P., Romanova A.F., Prilipov A.G., Filatov A.V. Sequencing of Ig genes from single circulating plasmablasts during acute SARS-CoV-2 infection. Immu-nologiya. 2024; 45 (6): 678-90. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-6-678-690 (in Russian)
Funding. The study was supported by the grant of Russian Science Foundation (RSF) No. 23-15-00432.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. Collection and processing of material - Byazrova M.G., Sukhova M.M., Mikhailov A.A., Guseva P.P., Romanova A.F.; text writing, editing - Byazrova M.G.; final version and integrity of the text -Prilipov A.G., Filatov A.V.
Введение
Получение человеческих моноклональных антител (МкАт) - важное направление современной биотехнологии [1]. Для создания новых антиген-специфических МкАт используются как прямые, так и комбинаторные подходы, самые известные из них - гибридомная технология и фаговый дисплей. В последнее время к ним добавились методы иммортализации В-лимфоцитов [2] и секвенирования генов ]£ [3]. С развитием методов высокопроизводительного секвенирования (N08) стало возможно определение полного репертуара как наивных, так и активированных В-лимфоцитов [4]. Как правило, при высокопроизводительном секве-нировании теряется информация о спаривании тяжелых и легких цепей. Несмотря на то что в некоторых модификациях этого удается избежать [5, 6], основным методом секвенирования генов ]£ до сих пор остается секвенирование из единичных В-лимфоцитов по Сэн-геру [7, 8].
В зависимости от поставленной задачи в качестве источника генов ]£ могут быть использованы различ-
ные субпопуляции В-лимфоцитов. Плазматические клетки характеризуются высоким содержанием мРНК в цитоплазме, что облегчает проведение амплификации кДНК, полученной из единичных клеток [9]. Поиск антиген-специфических плазматических клеток осложнен тем, что клетки на данной стадии не несут поверхностный антиген-специфический рецептор. Концентрация плазматических клеток в крови доноров крайне мала [10] и единственным надежным источником плазматических клеток является костный мозг, однако забор таких клеток связан с рядом этических затруднений.
В качестве источника генов ]£ могут выступать также В-клетки памяти, которые, в отличие от плазматических клеток, несут на поверхности В-клеточный рецептор, что позволяет вести поиск антиген-специфических клеток при помощи флуоресцентно меченого антигена [11]. Основной сложностью при использовании В-клеток памяти в качестве источников генов ]£ является их малое количество в крови человека. Другим привлекательным объектом секвенирования могут являться плазмабласты.
Цель данного исследования - разработка и оптимизация метода получения МкАт методом секвенирования из единичных циркулирующих плазмабластов.
В нашем исследовании мы сосредоточились на оптимизации основных этапов метода, а именно на выделении интересующей нас субпопуляции плазмабластов, а также на амплификации и секвенировании генов Ig из единичных клеток. Исследование выполнено на примере плазмабластов, формирующихся в процессе иммунного ответа при острой SARS-CoV-2-инфекции. Метод секвенирования из единичных В-клеток хорошо подходит для быстрого получения человеческих МкАт.
Материал и методы
Участники исследования. В исследование был включен доброволец, который в период с апреля по сентябрь 2020 г. переболел острой формой COVID-19. Исследование прошло предварительную этическую экспертизу и было одобрено Этическим комитетом Института иммунологии (протокол № 3-1, 11 марта 2020 г.). Исследование было выполнено в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека в качестве испытуемого». Письменное информированное согласие от участника исследования было получено перед выполнением каких-либо процедур исследования.
Выделение плазмабластов. Мононуклеарные клетки крови выделяли центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина (р = 1,077 г/см3; «ПанЭко», Россия). Для окрашивания лимфоцитов использовали следующие антитела: CD19-PE (клон LT19), CD27-PECy5.5 (клон LT27), CD38-PECy7 (клон LT38), CD45-FITC (клон LT45), CD3-FITC (клон TB3), CD16-FITC (клон LNK16), CD14-FITC (клон LT14-FITC), против человеческого IgG-FITC (клон CH1), которые ранее были получены в нашей лаборатории [12], а также анти-каппа-FITC и анти-лямбда-PE (клоны TB28-2 и 1-155-2; Becton Dickinson, США). Флуоресценцию клеток регистрировали с помощью проточного цитометра CytoFLEX S (Beckman Coulter, США), оснащенного тремя диодными лазерами (488, 561 и 638 нм). Клетки сортировали на проточном сортировщике SH800S (Sony Biotechnology, США). Обработку цитофлуориметрических данных проводили при помощи программы Flow Jo (Becton Dickinson, США). Секрецию IgG определяли методом иммунофермент-ного анализа, а антитело-секретирующие клетки - методом ELISpot [13].
Секвенирование генов IgG. Клетки суспендировали в физиологическом растворе в концентрации 200 клеток/мл и по 5 мкл разносили в пробирки объемом 0,2 мл. В каждую пробу добавляли по 10 мкл дважды дистиллированной воды и пробирки замораживали при -70 °C. После разморозки с помощью набора Invitro-gen SuperScript III (США) в пробирках проводили синтез кДНК. Далее образец делили пополам и раздельно проводили полугнездовую полимеразную цепную реак-
Таблица 1. Праймеры для амплификации VH- и VL-генов IgG
Название Последовательность праймера 5'-3'
Прямые
VH-1 ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG
VH-2 AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG
VH-3 CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG
VH-4 CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG
Vk-1/2 ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG
Vk-3 CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG
Vk-4 ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTG
Обратные
R1-HC GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC
R2-HC GTTCGGGGAAGTAGTCCTTGAC
R1-Kappa GTTTCTCGTAGTCTGCTTTGCTCA
R2-Kappa GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT
цию (ПЦР), используя праймеры, указанные в табл. 1. Все праймеры использовали в концентрации 50 мМ. Отдельно смешивали праймеры для VH- и VL-генов, амплификацию VH- и VL-генов проводили в отдельных пробирках.
Амплификацию проводили при следующих параметрах: предварительная денатурация при 96 °С 3 мин, далее 35 циклов ПЦР с денатурацией при 96 °С 15 с, отжигом при 60 °С 15 с и элонгацией при 72 °С в течение 1 мин. В первом раунде ПЦР использовали обратные праймеры R1-HC или R1-Kappa, а во втором раунде -R2-HC или R2-Kappa соответственно.
Проверку ПЦР-продуктов проводили методом гель-электрофореза в агарозном геле. Полученные ампли-коны секвенировали по Сэнгеру с помощью прибора капиллярного электрофореза модели «3130 XL Genetic Analyzes (Thermo Fisher Scintific, США).
Экспрессия IgG. Плазмиды, кодирующие тяжелые и легкие цепи Ig, собирали на основе полученных ПЦР-продуктов и векторов AbVec-hIgG1-799 и AbVec-hIgKappa-798. Исходные векторы были любезно предоставлены А.А. Горчаковым. Для выделения плаз-мид использовали наборы «NucleoBond Xtra Midi» (Marcherey-Nagel, США). Трансфекцию клеток HEK293 проводили в 10-сантиметровых чашках Петри (Costar, США). 3,6 • 106 клеток в среде DMEM/F12 (Панэко, Россия) с добавлением 10 % ЭТС (Панэко, Россия) транс-фецировали кальциевым методом, добавляя к клеткам 30 мкг плазмидной ДНК [2]. Соотношение AbVec-hIgG1 и AbVec-hIgKappa было 2 : 1. Через 5 дней культивирования культуральный супернатант собирали и тестировали на наличие IgG иммуноферментным методом, как было описано ранее [13].
Анализ данных. Нуклеотидные последовательности были аннотированы с использованием онлайн-инструмента Igblast с системой определения доменов IMGT (ImMunoGeneTics information system, Франция), a также программы UGENE (версия 50.0) (Унипро, Россия). Нуклеотидные последовательности тяжелой и легкой цепи были проанализированы с помощью базы данных IMGT, которая сравнивает полученные после-
довательности с базой данных известных аллелей зародышевой линии и определяет, какие аллели зародышевой линии использует конкретная последовательность. Филогенетические деревья нуклеотидных последовательностей с расчетом расстояний были построены с помощью программы UGENE.
Результаты
Секвенирование генов Ig из единичных клеток культуры IM-9
Прежде всего метод секвенирования генов Ig из единичных лимфоцитов мы оптимизировали на клетках линии IM-9, которые обладают некоторыми чертами циркулирующих плазмабластов.
При внутриклеточном окрашивании антителами против тяжелых и легких цепей каппа мы регистрировали яркую и умеренную флуоресценцию соответственно, что свидетельствовало об активном синтезе IgG (рис. 1А). Внутриклеточное окрашивание антителами против легких цепей лямбда не показало значимой флуоресценции. Чтобы убедиться в активной секреции IgG клетками IM-9 мы определяли антитело-секретирую-щие клетки (АСК) методом ELISpot (рис. 1Б). Доля IgG-секретирующих клеток в культуре IM-9 достигала 94 %.
Следующим этапом стала разработка и оптимизация метода полугнездовой ПЦР с чувствительностью, достаточной для получения ампликонов из единичных клеток. Клетки IM-9 разводили до концентрации 200 клеток в 1 мл и разносили по 5 мкл на ПЦР-про-бирку. После размораживания-оттаивания происходило высвобождение из клетки РНК, которая использовалась для последующего проведения реакции обратной транскрипции и двух раундов полугнездовой ПЦР. Для единичных клеток IM-9 после второго раунда ПЦР были получены ампликоны вариабельных генов тяжелой (VH) и легкой (VL) цепи (рис. 1В-Г). Полученные фрагменты по размеру соответствовали ожидаемым: размер VH-гена составил 715 п.н., а размер VL-гена легкой цепи каппа - 510 п. н. Следует отметить, что в некоторых образцах отсутствовали или VH-, или VL-ампликоны. Это указывает на то, что полная амплификация проходила не для каждого образца. Анализ последовательностей легкой и тяжелой показал, что ген тяжелой цепи IgG клеток IM-9 относится к семейству IGHV3-9*01, а легкая цепь - к IGKV1-5*03. Полученные нами нук-леотидные последовательности полностью совпадали с опубликованными данными, которые были получены при секвенировании пула клеток IM-9 [14]. Это позволило на следующем этапе перейти к секвенированию генов IgG из единичных плазмабластов крови.
Секвенирование генов Ig из единичных плазмабластов
Забор крови у пациента с тяжелой формой COVID-19 проводили на 10-й день от появления первых симптомов (рис. 2 А). Ранее для выделения популяции В-кле-ток мы использовали набор для иммуномагнитной сепарации «Dynabeads Untouched human B cell kit» (Thermo
Fisher Scientific, США). Этот метод прост в исполнении, обладает высокой производительностью. Однако наши первоначальные попытки выделения плазмабластов с помощью этого набора оказались безрезультатными. Вероятно, это связано с тем, что в наборе имеются СБ43-антитела, которые не связываются с наивными и В-клетками памяти, но удаляют из образца плазма-бласты. Для выделения плазмабластов мы вынуждены были прибегнуть к более трудоемкому и менее производительному методу сортировки с помощью проточного цитометра.
Для этого выделенные мононуклеарные клетки периферической крови окрашивали коктейлем антител CD19-PE, CD27-PC5.5, CD38-PC7, CD3-FITC, CD14-FITC, CD 16-FITC. Плазмабласты выделяли из мононуклеарной фракции клеток крови с помощью проточного сортировщика клеток по фенотипу CD19+CD27++CD38++CD3CD16CD14- (рис. 2Б). Доля плазмабластов от всех В-лимфоцитов для этого пациента составила 15 %. Способность плазмабластов секре-тировать IgG определяли в тесте ELISpot (рис. 2В). Доля антитело-секретирующих клеток среди выделенных плазмабластов составила 38 %. При этом В-лимфоциты с фенотипом CD19+CD27lowCD38lowCD3 CD16 CD14-, выделенные из того же образца, IgG не секретировали. Cубпопуляцию плазмабластов использовали для получения ампликонов VH- и VL-генов Ig (рис. 2A). Для этого суспензию плазмабластов разводили до концентрации 200 клеток в 1 мл и разносили по 5 мкл в пробирку, что в среднем соответствовало 1 клетке на пробирку. Далее проводили реакцию обратной транскрипции, как было описано выше для клеток IM-9. Полученную кДНК использовали в ПЦР для амплификации последовательностей генов легкой и тяжелой цепей Ig. Для упрощения задачи амплификации подвергались VH-гены только IgG-изотипа и VL-гены, принадлежавшие каппа-цепи. Образцы, для которых были получены ампликоны как для легкой, так и для тяжелой цепи IgG, секвенировали по Сэнгеру.
В результате нами были получены 15 парных последовательностей VH- и VL-генов, которые были проанализированы с помощью базы данных IGMT (табл. 2, 3). На рис. 3А, Б представлены филогенетические деревья нуклеотидных последовательностей с указанием расстояний, рассчитанных с помощью F84-модели.
Среди нуклеотидных последовательностей VL-генов было выявлено 14 уникальных последовательностей. Последовательности #8 и 16 были идентичными между собой. Среди нуклеотидных последовательностей VH-генов было определено 10 уникальных последовательностей. Последовательности #10 и 14; #8, 16 и 18; #40 и 46, а также #52 и 58 были идентичными между собой. Вероятно, что последовательности #8 и 16 принадлежали одному В-клеточному клону, поскольку имели идентичные VH- и VL-гены. Очевидно, что другие идентичные последовательности (#10 и 14; #18; #40 и 46; #52 и 58) не принадлежали к одним и тем же В-клеточным клонам, поскольку отличались между собой по нуклеотид-
'I ....... ......
Внутриклеточное окрашивание
п ....... .......
CD45-FITC
анти-IgG-FITC
CD19-PE
1721
69 %
Т ......I ....... ......1
1 1 2 % 1
анти-kappa-FITC
анти-lambdaPE
э
IgG
IgM
94/100
0/100
Рис. 1. Секвенирование генов тяжелой и легкой цепи Ig из единичных клеток IM-9
А — внутриклеточное окрашивание тяжелой цепи IgG, а также легких цепей каппа и лямбда в клетках IM-9; Б — определение IgG- (слева) и IgM- (справа) секретирующих клеток в культуре IM-9 методом ELISpot; В, Г — репрезентативные электро-фореграммы ПЦР-продуктов, полученных после второго раунда полугнездовой ПЦР с использованием наборов праймеров, специфичных для VH- (В) и VL-генов (Г). Ампликоны VH- и VL-генов были получены в параллельных реакциях.
510 п.н
Э
/
день
10 _1_
Появление симптомов COVID-19
Забор крови
Выделение PBMC
Сортировка плазмабластов V Y
а1 п
Получение последовательностей г тяжелых и легких цепей Ig 1
IgG ELISpot j
Клонирование в вектор
О
о
Котрансфекция клеток HEK293
Определение антител в супернатанте
IgG ELISA
э
э
31 %
имфоциты
SSC-A
FSC-H
CD3/CD14/CD16
В-клетки
Плазмабласты
Рис. 2. Выделение циркулирующих плазмабластов для последующего секвенирования
А - схема эксперимента; Б - стратегия сортировки субпопуляции плазмабластов (гейт выделен красным) и В-лимфоцитов (гейт выделен зеленым) из популяции мононуклеарных клеток пациента с COVID-19; В - определение количества антитело-секрети-рующих клеток методом ELISpot в популяции В-лимфоцитов (слева) и плазмабластов (справа).
ш V-ген и аллель % мутаций в V-регионе J-ген и аллель % мутаций в J-региоие Длина CDR1.CDR2.CDR3, aa CDR3
4 IGKV1-33*01 F; IGKV1D-33*01 F 11 IGKJ4*01 F 16 6.3.9 CQQYEHLPLSF
8 IGKVl-5*03 F 5 IGKJ2*01 F 10 6.3.9 CQQYHLYPYTF
10 IGKV1-39*01 F; IGKV1D-39*01 F 9 IGKJ1*01 F 11 6.3.10 CQQSYITPPWTF
14 IGKV1D-13*01 F 7 IGKJ4*01 F 6 6.3.6 CQQFNNVF
16 IGKVl-5*03 F 9 IGKJ2*01 F 8 6.3.9 CQQYHLYPYTF
18 IGKV1-39*01 F; IGKV1D-39*01 F 7 IGKJ2*01 F 5 6.3.9 CQQSFDTPYTF
20 IGKV4-1*01 F 11 IGKJ4*01 F; IGKJ4*02 (F) 11 12.3.9 CQQYFSTPLTF
32 IGKVl-5*04 F 8 IGKJ1*01 F 0 6.3.9 CQQYKTYSRTF
40 IGKV1-39*01 F; IGKV1D-39*01 F 7 IGKJ3*01 F 8 6.3.9 CQQSYSSPHTL
42 IGKV1-16*01 F 6 IGKJ4*01 F 8 6.3.9 CLQYNTYPFTF
46 IGKV4-1*01 F; IGKV4-1*03 F 3 IGKJ2*01 F 3 12.3.9 CQQYYTIPYAF
50 IGKV1-39*01 F; IGKV1D-39*01 F 8 IGKJ4*01 F 11 6.3.9 CQQTSSPPLTF
52 IGKV4-1*02 F; IGKV4-1*03 F 3 IGKJ3*01 F 0 12.3.10 CQQYYSTPLFTF
54 IGKV2-30*01 F 0 IGKJ1*01 F 0 11.3.9 CMQGTHWPWTF
58 IGKV1-5*01 F 1 IGKJ2*01 F 2,56 6.3.9 CQQYNSYPYTF
Примечание. Здесь и в табл. 3: цветом выделены идентичные последовательности.
Таблица 3. Характеристика последовательностей тяжелых цепей IgG, полученных из единичных циркулирующих плазмабластов
Ш V-ген и аллель % мутаций в V-регионе J-ген и аллель % мутаций в J-регионе D-ген и аллель Ддина CDR1. CDR2. CDR3, aa CDR3
4 IGHV1-8*01 F 25 IGH.T5*02 F 6 IGHD6-6*01 F 8.8.10 CARGPLAWFDPW
8 IGHV4-6P01 F, orIGHV4-61*08 F 9 IGH.T6*02 F 14 IGHD2-21*01 F 10.7.23 CARAKGPGGGGDFGTKYIYYGMDIW
10 IGHV4-34*01 F 6 IGH.T4*02 F 4 IGHD1-26*01 F 8.7.25 CARDRKIAPPAFSMGPTHRLKGYFDYW
14 IGHV4-34*01 F 6 IGH.T4*02 F 4 IGHD1-26*01 F 8.7.25 CARDRKIAPPAFSMGPTHRLKGYFDYW
16 IGHV4-6P01 F; IGHV4-61*08 F 9 IGH.T6*02 F 14 IGHD2-21*01 F 10.7.23 CARAKGPGGGGDFGTKYIYYGMDIW
18 IGHV4-6P01 F; IGHV4-61*08 F 9 IGH.T6*02 F 14 IGHD2-21*01 F 10.7.23 CARAKGPGGGGDFGTKYIYYGMDIW
20 IGHV4-6P08F 12 IGH.T4*02 F 13 IGHD6-13*01 F 8.7.15 CARPSTPSTAAGAFDSW
32 IGHV5-5P01 F 13 IGH.T4*02 F 17 IGHD6-19*01 F 8.8.13 CARHSIGVSSGFDSW
40 IGHV3-30*01 F 6 IGH.T4*02 F 8 IGHD5-18*01 F 8.8.11 CAREERGYFVGYW
42 IGHV3-7*03 F 10 IGH.T4*02 F 17 IGHD6-19*01 F 8.8.12 CVRDGSGWHYDHW
46 IGHV3-30*01 F; IGHV3-30*03 F или IGHV3-30*04 F или IGHV3-30*06 F 10 IGH.T4*02 F 13 IGHD5-18*01 F X.X.ll CAREERGYFVGYW
50 IGHV4-38-2*02 F 5 IGH.T4*02 F 10 IGHD4-23*01 ORF 9.7.12 CARASGYSREIDFW
52 IGHV4-30-4*09 F; IGHV4-3P03 F 3 IGH.T4*02 F 10 IGHD3-9*01 F 10.7.17 CARIPSPVTSDYKGVFDYW
54 IGHV3-33*01 F 0 IGH.T4*02 F 15 IGHD2-15*01 F 8.8.16 CARDGEDIVVVVAAPDYW
58 IGHV4-30-4*09 F; IGHV4-3P03 F 9 IGH.T4*02 F 10 IGHD3-9*01 F 10.7.17 e
ё >
а 8
3 tc
и ^ 8 И
I И
— О
Э
Нуклеотидные последовательности генов тяжелых цепей Ig
0.118
■О
0.039
с
0.261
0.209
-О
0.083
0.082
0.302 0.037 "-Ö.Ö01'
0.027
С
0.143
0.081
0.015
0.036
О
0.129
0
0.063
0.008
£
0.091
0.13
-О 0.001 0.002
14 ■32 ■4 ■40 ■46 42 ■54 16 18 ■8 50 20 52 58 10
Нуклеотидные последовательности генов легких цепей Ig
0.023
0.061
О
0.098
0.011
О
0.113
0.094^
8
58 32 46 52
0.006^ """ ' 20 0102. 54
0.046
бО 0.04
0.297
0.021
О
0.036
40
0.024^ ' ' 50 0.003Y 0.083
£
р 0 054
0.074
0.012
0.079
0.01
0.007
18 10
4
42
0.009^"""" 14 0.076
16
0.17
^ 0.088
э
CDR3 тяжелой цепи Ig
1 2 4
C A Б D Б
C A Б D Б
C A Б A K
C A Б A K
C A Б A K
C A Б I P
C A Б I P
C A Б E E
C A Б E E
C A Б P S
C A Б H S
C A Б G P
C V Б D G
C A Б A S
C A Б D G
6 8 10
к I A P P
к I A P P
24
27
- G P G G G G
- G P G G G G
- G P G G G G
A F S MG P A F S MG P D D D
F G F G F G
P V P V
H Б L K G
H Б L K G
K Y I Y Y
K Y I Y Y
K Y I Y Y
DYK DYK
- R G
- R G
Y
Y G G G
G V G V
Y F
Y F
F F M M M F F VG VG
TP
S T A AG A I G V S S G AW
D YW D YW I W I W I W D YW D YW YW YW S W S W P W
ED I VVVVAA
D F W D YW
1 2
CDR3 легкой цепи Ig
4 6 8 10
12
C Q Q S Y I T P P W - T F
C Q Q F N N V F
C Q Q Y H L Y - P Y - T F
C Q Q Y H L Y - P Y - T F
C Q Q S F D T - P Y - T F
C Q Q Y Y S T - P L F T F
C Q Q Y N S Y - P Y - T F
C Q Q S Y S S - P H - T L
C Q Q Y Y T I - P Y - A F
C Q Q Y F S T - P L - T F
C Q Q Y K T Y - S Б - T F
C Q Q Y E H L - P L - S F
C L Q Y N T Y - P F - T F
C Q Q T S S P - P L - T F
C M Q G T H W - P W - T F
Рис. 3. Анализ последовательностей легких и тяжелых цепей полученных из циркулирующих плазмабластов
A, Б - филогенетические деревья, построенные на основе нуклеотидных последовательностей тяжелых (А) и легких (Б) цепей;
B, Г - выравнивание аминокислотных последовательностей СБКЗ-участка генов УИ (В) и УЬ (Г).
0
0
0
0
0
ным последовательностям УЬ-генов. Следует отметить, что большая часть (9/15) последовательностей УИ-генов относилась к семейству УИ4, а остальные последовательности принадлежали к семействам УИЗ (4/15), УИ1 (1/15) и УИ5 (1/15). 11 из 15 последовательностей УЬ-генов относились к семейству ЮКУ1. Полученные последовательности отличались от зародышевой конфигурации УИ и УЬ в пределах от 0 и до 25 % (медиана - 9 %) и от 0 до 11 % (медиана - 7 %) соответственно.
На рис. 3В, Г представлено выравнивание по СБЯЗ-участку УИ- и УЬ-генов. Обращает на себя внимание, что СБЯЗ-участки УИ-генов заметно отличались друг от друга, в то время как СБЯЗ-участки УЬ-генов были схожи между собой.
Для проверки того, что полученные последовательности могут обеспечивать синтез и секрецию ^в,
ПЦР-продукты, полученные из одного образца, клонировали в экспрессионные векторы AbVec-hIgG1-799 и AbVec-hIgKappa-798 для последующей наработки IgG. Клетки HEK293 котрансфецировали плазмидами, кодирующими легкую и тяжелую цепи Ig. Секрецию IgG определяли с помощью ELISA в супернатантах трансфецированных клеток. Нами был получен моно-клональный IgG, который соответствовал образцу #40. Полученный IgG в тесте ELISA был неактивен в отношении связывания с RBD-доменом S-белка SARS-CoV-2.
Обсуждение
Плазмабласты являются объектом, удобным для секвенирования генов Ig. Этому благоприятствуют несколько обстоятельств.
Во-первых, уровень экспрессии мРНК генов ]£ плаз-мабластами в среднем в 100 раз выше, чем В-клетками памяти, и в 250 выше, чем наивными В-лимфоцитами [3]. В норме плазмабласты являются малочисленной субпопуляцией В-лимфоцитов, размеры которой у здоровых доноров не превышают 1 % от циркулирующих В-лимфоцитов. Вскоре после иммунизации плазмаблас-ты на непродолжительное время появляются в периферической крови, однако и в этом случае размеры этой субпопуляции невелики - как правило, не более 10 % от количества В-лимфоцитов [15]. При некоторых инфекционных заболеваниях, таких как лихорадка Денге [16, 17], лихорадка Эбола [18], а также СОУГО-19 [19, 20], доля плазмабластов может сильно увеличиваться, достигая от 20 до 50 % от количества В-лимфоцитов. При тяжелом течении СОУШ-19 плазмабласты обнаруживаются в крови даже через 2 мес после появления симптомов [19].
Во-вторых, плазмабласты являются клетками, которые несут поверхностный рецептор ВСЯ и одновременно способны секретировать антитела, что позволяет проводить предварительную антиген-специфическую селекцию этих клеток. По фенотипу эти клетки можно разделить на ранние и поздние плазма-бласты. Ранние плазмабласты имеют фенотип СШ910»С027++СВ38++СВ138- и несут большое количество поверхностного ]£. Поздние плазмабласты характеризуются фенотипом СБ 191о*С027++СВ38++СБ138+ и сниженной экспрессией поверхностного ]£. Тяжелое течение СОУГО-19 зачастую ассоциировано с отсутствием выраженного 8ЛЯ8-СоУ-2-специфичного плазма-бластного ответа. Например, доля ЯВБ-специфичных клеток у пациентов с тяжелой формой СОУГО-19 в среднем составляла 4 % от всех плазмабластов, а у пациента, включенного в данное исследование, - 15 %. Учитывая это обстоятельство, для получения последовательностей генов ]£ мы использовали общую популяцию плазмабластов без предварительной антигенной селекции.
Проведенное нами секвенирование единичных плазма-бластов позволило получить 15 пар последовательностей генов легких и тяжелых цепей ]£. Полученные последовательности УЕ-генов принадлежали к четырем семействам: УЕ4 (9/15), УЕ3 (4/15), УЕ1 (1/15) и УЕ5 (1/15). Обращает на себя внимание, что распределение по семействам резко отличалось от нормального репертуара ]£, где доминирует семейство УЕ3 [21].
Наши данные хорошо согласуются с наблюдением о том, что УЕ-гены, характерные для плазмабластов, при острой 8ЛЯ8-СоУ-2-инфекции в основном принадлежат подсемейству ЮЕУ4-34 [22]. Другой особенностью полученных последовательностей УЕ- и У£-генов являлся низкий уровень мутагенеза и доминирование клонотипов, максимально близких к зародышевой линии [23]. Все эти особенности в сочетании с олиго-клональностью иммунного ответа указывают на экстрафолликулярный путь созревания плазмабластов при СОУГО-19 [22].
В задачи нашего исследования не входило получение конкретных МкАт против антигенов SARS-CoV-2, тем не менее мы экспрессировали два IgG-клона. К сожалению, они не связывались с RBD-доменом S-белка SARS-CoV-2. Отчасти это объясняется малой выборкой экспрессированных клонов. Также известно, что у пациентов с тяжелой формой COVID-19 доля RBD-специфичных плазмабластов невелика - в среднем составляет 4 % от всех плазмабластов. Кроме того, на данном этапе исследования мы не проводили антиген-специфическое обогащение плазмабластов.
Поскольку антиген-специфические В-клетки в крови встречаются крайне редко, это может стать ограничением при сортировке методом проточной цитометрии. Предварительная стимуляция in vitro позволяет значительно увеличить количество материала для секвени-рования [2, 11]. Более того, такая стратегия стимуляции дает возможность оценить функциональные и нейтрализующие свойства антител до проведения секвениро-вания, повышая эффективность метода. Стимуляция наивных В-клеток и клеток памяти позволяет дифференцировать их в наиболее подходящий источник для секвенирования - плазмабласты и плазматические клетки.
Получение антиген-специфичных плазмабластов может быть связано с некоторыми этическими трудностями, так как далеко не все антигены могут быть использованы для иммунизации человека. Эту проблему потенциально можно решить, используя иммуно-дефицитных мышей SCID/beige в качестве временных хозяев для B-лимфоцитов человека [24].
Таким образом, несмотря на свою невысокую производительность, секвенирование генов Ig из единичных В-лимфоцитов методом Сэнгера обладает рядом неоспоримых достоинств. Прежде всего он позволяет сохранить информацию о корректном спаривании легких и тяжелых цепей. Кроме того, антитела, полученные этим методом, имеют естественное, а не комбинаторное происхождение, что снижает вероятность развития анафилактического шока и сывороточной болезни у пациентов. Разработка новых подходов к получению человеческих МкАт дает надежду на создание платформы для быстрого получения необходимых таргетных препаратов.
Заключение
Метод секвенирования генов Ig из единичных циркулирующих плазмабластов представляет собой перспективный подход для создания человеческих МкАт. В сочетании с предварительной стимуляцией В-лимфоцитов in vitro, сортировкой антиген-специфичных клеток, а также с использованием иммунодефицитных мышей данный метод открывает новые возможности для разработки таргетных препаратов. Эти походы позволят значительно ускорить процесс разработки новых терапевтических антител, что особенно важно в борьбе с новыми инфекционными заболеваниями.
■ Литература
1. Лушова А.А., Бязрова М.Г., Прилипов А.Г., Садыкова Г.К., Копылов Т.А., Филатов А.В. Новое поколение методов получения человеческих моноклональных антител. Мол. Биол. 2017; 51 (6): 1-8. DOI: https://doi.org/10.1134/S0026893317060103
2. Бязрова М.Г., Михайлов А.А., Сухова М.М., ПрилиповА.Г., Филатов А.В. Биохимическая и функциональная характеристика мультимеризованных белков, содержащих рецепторный домен CD40L. Иммунология. 2023; 44 (6): 697-708. DOI: https://doi. org/10.33029/0206-4952-2023-44-6-697-708
3. Лебедин М.Ю., Турчанинова М.А., Егоров Е.С., Брита-нова О.В., Чудаков Д.М. Анализ данных высокопроизводительного секвенирования репертуаров антител с использованием уникальных молекулярных идентификаторов. Иммунология. 2017; 38 (1): 59-63. DOI: https://doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-1-59-63
4. Briney B., Inderbitzin A., Joyce C., Burton D.R. Commonality despite exceptional diversity in the baseline human antibody repertoire. Nature. 2019; 566: 393-7. DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-019-0879-y
5. Tan Y.-C., Blum L.K., Kongpachith S., Ju C.-H., Cai X., Lindstrom T.M. High-throughput sequencing of natively paired antibody chains provides evidence for original antigenic sin shaping the antibody response to influenza vaccination. Clin. Immunol. 2014; 151: 55-65. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.clim.2013.12.008
6. Busse C.E., Czogiel I., Braun P., Arndt P.F., Wardemann H. Single-cell based high-throughput sequencing of full-length immunoglobulin heavy and light chain genes. Eur. J. Immunol. 2014; 44: 597-603. DOI: https://doi.org/10.1002/eji.201343917
7. Wrammert J., Smith K., Miller J., Langley W.A., Kokko K., Larsen C. Rapid cloning of high-affinity human monoclonal antibodies against influenza virus. Nature. 2008; 453: 667-71. DOI: https://doi. org/10.1038/nature06890
8. Zhou Y., Liu Z., Wang Z., Zhang Q., Mayer C.T., Schoofs T. et al. Single-Cell Sorting of HBsAg-Binding Memory B Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and Antibody Cloning. STAR Protoc. 2020; 1: 100129. DOI: https://doi.org/10.1016/j.xpro.2020.100129
9. Lanzavecchia A. Dissecting human antibody responses: useful, basic and surprising findings. EMBO Mol. Med. 2018; 10: e8879. DOI: https://doi.org/10.15252/emmm.201808879
10. Caraux A., Klein B., Paiva B., Bret C., Schmitz A., Fuhler G.M. Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells. Haematologica. 2010; 95: 1016-20. DOI: https://doi. org/10.3324/haematol.2009.018689
11. Sokal A., Chappert P., Barba-Spaeth G., Roeser A., Fourati S., Azzaoui I. Maturation and Persistence of the Anti-Sars-Cov-2 Memory B Cell Response. Cell. 2021; 184: 1201-13.e14. DOI: https://doi. org/10.1016/j.cell.2021.01.050
12. Лушова А.А, Жеремян Э.А, Астахова Е.А, Спиридонова А.Б., Бязрова М. Г., Филатов А.В. Субпопуляции В-лимфоцитов: функции и молекулярные маркеры. Иммунология. 2019; 40 (6): 63-76. DOI: https://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-16009
13. Астахова Е.А., Фролов Е.А., Шилкина А.Б., Бязрова М.Г., Латышева Е.А., Латышева Т.В., Филатов А.В. Стимуляции В-клеток
в системе HH-21/CD40L в норме и у пациентов с общей вариабельной иммунной недостаточностью. Иммунология. 2021; 41 (6): 631-40. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-631-640
14. Watkins B.A., Davis A.E., Fiorentini S., Reitz M.S. V-Region and Class Specific RT-PCR Amplification of Human Immunoglobulin Heavy and Light Chain Genes from B-Cell Lines. Scand. J. Immunol. 1995; 42: 442-8. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-3083.1995.tb03678.x
15. Byazrova M.G., Kulemzin S.V., Astakhova E.A., Belovezhets T.N., Efimov G.A., Chikaev A.N., Kolotygin I.O., Gorchakov A.A., Tara-nin A.V., Filatov A.V. Memory B Cells Induced by Sputnik V Vaccination Produce SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies Upon Ex Vivo Restimulation. Front. Immunol. 2022; 13: 840707. DOI: https://doi.org/10.3389/ fimmu.2022.840707
16. Garcia-Bates T.M., Cordeiro M.T., Nascimento E.J.M., Smith A.P., Soares De Melo K.M., McBurney S.P. Association between Magnitude of the Virus-Specific Plasmablast Response and Disease Severity in Dengue Patients. J. Immunol. 2013; 190: 80-7. DOI: https://doi.org/10.4049/jim-munol.1103350
17. Wrammert J., Onlamoon N., Akondy R.S., Perng G.C., Pol-srila K., Chandele A. Rapid and Massive Virus-Specific Plasmablast Responses during Acute Dengue Virus Infection in Humans. J. Virol. 2012; 86: 2911-8. DOI: https://doi.org/10.1128/JVI.06075-11
18. McElroy A.K., Akondy R.S., Davis C.W., Ellebedy A.H., Mehta A.K., Kraft C.S. Human Ebola virus infection results in substantial immune activation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2015; 112: 4719-24. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.1502619112
19. Byazrova M., Yusubalieva G., Spiridonova A., Efimov G., Mazurov D., Baranov K., Baklaushev V., Filatov A. Pattern of circulating SARS-CoV-2-specific antibody-secreting and memory B-cell generation in patients with acute COVID-19. Clin. Transl. Immunol. 2021; 10. DOI: https://doi.org/10.1002/cti2.1245
20. Kuri-Cervantes L., Pampena M.B., Meng W., Rosenfeld A.M., Ittner C.A.G., Weisman A.R. Comprehensive mapping of immune perturbations associated with severe COVID-19. Sci. Immunol. 2020; 5: eabd7114. DOI: https://doi.org/10.1126/sciimmunol.abd7114
21. Kitaura K., Yamashita H., Ayabe H., Shini T., Matsutani T., Suzuki R. Different Somatic Hypermutation Levels among Antibody Subclasses Disclosed by a New Next-Generation Sequencing-Based Antibody Repertoire Analysis. Front. Immunol. 2017; 8: 389. DOI: https://doi. org/10.3389/fimmu.2017.00389
22. Woodruff M.C., Ramonell R.P., Nguyen D.C., Cashman K.S., Saini A.S., Haddad N.S. Extrafollicular B cell responses correlate with neutralizing antibodies and morbidity in COVID-19. Nat. Immunol. 2020; 21: 1506-16. DOI: https://doi.org/10.1038/s41590-020-00814-z
23. Castleman M.J., Stumpf M.M., Therrien N.R., Smith M.J., Leste-berg K.E., Palmer B.E. Autoantibodies elicited with SARS-CoV-2 infection are linked to alterations in double negative B cells. Front. Immunol. 2022; 13: 988125. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.988125
24. Lin Z., Chiang N.Y., Chai N., Seshasayee D., Lee W.P., Balazs M. In vivo antigen-driven plasmablast enrichment in combination with antigen-specific cell sorting to facilitate the isolation of rare monoclonal antibodies from human B cells. Nat. Protoc. 2014; 9: 1563-77. DOI: https:// doi.org/10.1038/nprot.2014.104
■ References
1. Lushova A.A., Biazrova M.G., Prilipov A.G., Sadykova G.K., Kopylov T.A., Filatov A.V. Next-Generation Techniques for Discovering Human Monoclonal Antibodies. Mol Biol. 2017; 51: 782-7. DOI: https:// doi.org/10.1134/S0026893317060103
2. Byazrova M.G., Mikhailov A.A., Sukhova M.M., Prilipov A.G., Filatov A.V. Biochemical and functional characterization of multimerized proteins containing the CD40L receptor domain. Immunologiya. 2023; 44: 697-708. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-6-697-708 (in Russian)
3. Lebedin M.Y., Turchaninova M.A., Egorov E.S., Britanova O.V., Chudakov D.M. High-throughput immunoglobulin sequencing data analysis with the use of unique molecular identifiers. Immunologiya. 2017; 38 (1): 59-63. DOI: https://doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-1-59-63 (in Russian)
4. Briney B., Inderbitzin A., Joyce C., Burton D.R. Commonality despite exceptional diversity in the baseline human antibody repertoire. Nature. 2019; 566: 393-7. DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-019-0879-y
5. Tan Y.-C., Blum L.K., Kongpachith S., Ju C.-H., Cai X., Lindstrom T.M. High-throughput sequencing of natively paired antibody chains provides evidence for original antigenic sin shaping the antibody response to influenza vaccination. Clin Immunol. 2014; 151: 55-65. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.clim.2013.12.008
6. Busse C.E., Czogiel I., Braun P., Arndt P.F., Wardemann H. Single-cell based high-throughput sequencing of full-length immunoglobulin heavy and light chain genes. Eur J Immunol. 2014; 44: 597-603. DOI: https://doi.org/10.1002/eji.201343917
7. Wrammert J., Smith K., Miller J., Langley W.A., Kokko K., Larsen C. Rapid cloning of high-affinity human monoclonal antibo-
dies against influenza virus. Nature. 2008; 453: 667-71. DOI: https://doi. org/10.1038/nature06890
8. Zhou Y., Liu Z., Wang Z., Zhang Q., Mayer C.T., Schoofs T., et al. Single-Cell Sorting of HBsAg-Binding Memory B Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and Antibody Cloning. STAR Protoc. 2020; 1: 100129. DOI: https://doi.org/10.1016/j.xpro.2020.100129
9. Lanzavecchia A. Dissecting human antibody responses: useful, basic and surprising findings. EMBO Mol Med. 2018; 10: e8879. DOI: https://doi.org/10.15252/emmm.201808879
10. Caraux A., Klein B., Paiva B., Bret C., Schmitz A., Fuhler G.M. Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells. Haematologica. 2010; 95: 1016-20. DOI: https://doi. org/10.3324/haematol.2009.018689
11. Sokal A., Chappert P., Barba-Spaeth G., Roeser A., Fourati S., Azzaoui I. Maturation and Persistence of the Anti-Sars-Cov-2 Memory B Cell Response. Cell. 2021; 184: 1201-13.e14. DOI: https://doi. org/10.1016/j.cell.2021.01.050
12. Lushova A.A., Zheremyan E.A., Astakhova E.A., Spiridono-va A.B., Byazrova M.G., Filatov A.V. B-lymphocyte subsets: functions and molecular markers. Immunologiya. 2019; 40 (6): 63-76. DOI: https://doi. org/10.24411/0206-4952-2019-16009 (in Russian)
13. Astakhova E.A., Frolov E.A., Shilkina A.B., Byazrova M.G., Latysheva E.A., Latysheva T.V., Filatov A.V. Stimulation of B cells in the IL-21/CD40L system in healthy donors and in patients with common variable immunodeficiency. Immunologiya. 2021; 41 (6): 631-40. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-631-640 (in Russian)
14. Watkins B.A., Davis A.E., Fiorentini S., Reitz M.S. V-Region and Class Specific RT-PCR Amplification of Human Immunoglobulin Heavy and Light Chain Genes from B-Cell Lines. Scand J Immunol. 1995; 42: 442-8. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-3083.1995.tb03678.x
15. Byazrova M.G., Kulemzin S.V., Astakhova E.A., Belovezhets T.N., Efimov G.A., Chikaev A.N., Kolotygin I.O., Gorchakov A.A., Tara-nin A.V., Filatov A.V. Memory B Cells Induced by Sputnik V Vaccination Produce SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies Upon Ex Vivo Restimulation. Front Immunol. 2022; 13: 840707. DOI: https://doi.org/10.3389/ fimmu.2022.840707
16. Garcia-Bates T.M., Cordeiro M.T., Nascimento E.J.M., Smith A.P., Soares De Melo K.M., McBurney S.P. Association between Magnitude of
■ Сведения об авторах
Бязрова Мария Георгиевна - науч. сотр. лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; ассистент каф. иммунологии ФГАОУ ВО РУДН им. П. Лумумбы Минобрнауки России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-9858-7596
Сухова Мария Михайловна - мл. науч. сотр. лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; аспирант каф. иммунологии биол. факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4572-1878
Михайлов Артем Андреевич - лаборант лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; студент каф. иммунологии биол. факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Российская Федерация
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-8356-8077
the Virus-Specific Plasmablast Response and Disease Severity in Dengue Patients. J Immunol. 2013; 190: 80-7. DOI: https://doi.org/10.4049/jim-munol.1103350
17. Wrammert J., Onlamoon N., Akondy R.S., Perng G.C., Pol-srila K., Chandele A. Rapid and Massive Virus-Specific Plasmablast Responses during Acute Dengue Virus Infection in Humans. J Virol. 2012; 86: 2911-8. DOI: https://doi.org/10.1128/JVI.06075-11
18. McElroy A.K., Akondy R.S., Davis C.W., Ellebedy A.H., Mehta A.K., Kraft C.S. Human Ebola virus infection results in substantial immune activation. Proc Natl Acad Sci USA. 2015; 112: 4719-24. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.1502619112
19. Byazrova M., Yusubalieva G., Spiridonova A., Efimov G., Mazurov D., Baranov K., Baklaushev V., Filatov A. Pattern of circulating SARS-CoV-2-specific antibody-secreting and memory B-cell generation in patients with acute COVID-19. Clin Transl. Immunol. 2021; 10. DOI: https://doi.org/10.1002/cti2.1245
20. Kuri-Cervantes L., Pampena M.B., Meng W., Rosenfeld A.M., Ittner C.A.G., Weisman A.R. Comprehensive mapping of immune perturbations associated with severe COVID-19. Sci Immunol. 2020; 5: eabd7114. DOI: https://doi.org/10.1126/sciimmunol.abd7114
21. Kitaura K., Yamashita H., Ayabe H., Shini T., Matsutani T., Suzuki R. Different Somatic Hypermutation Levels among Antibody Subclasses Disclosed by a New Next-Generation Sequencing-Based Antibody Repertoire Analysis. Front Immunol. 2017; 8: 389. DOI: https://doi. org/10.3389/fimmu.2017.00389
22. Woodruff M.C., Ramonell R.P., Nguyen D.C., Cashman K.S., Saini A.S., Haddad N.S. Extrafollicular B cell responses correlate with neutralizing antibodies and morbidity in COVID-19. Nat Immunol. 2020; 21: 1506-16. DOI: https://doi.org/10.1038/s41590-020-00814-z
23. Castleman M.J., Stumpf M.M., Therrien N.R., Smith M.J., Leste-berg K.E., Palmer B.E. Autoantibodies elicited with SARS-CoV-2 infection are linked to alterations in double negative B cells. Front Immunol. 2022; 13: 988125. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.988125
24. Lin Z., Chiang N.Y., Chai N., Seshasayee D., Lee W.P., Balazs M. In vivo antigen-driven plasmablast enrichment in combination with antigen-specific cell sorting to facilitate the isolation of rare monoclonal antibodies from human B cells. Nat Protoc. 2014; 9: 1563-77. DOI: https://doi. org/10.1038/nprot.2014.104
■ Authors' information
Maria G. Byazrova - Researcher of the Immunochemis-try Lab., NRC Institute of Immunology FMBA of Russia; Assistant of RUDN n.a. P. Lumumba, MSHE of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-9858-7596
Maria M. Sukhova - Junior Researcher of the Immuno-chemistry Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Student of the Immunology Chair, Biology Faculty, M.V. Lomonosov MSU; Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4572-1878
Artem A. Mikhailov - Technician of the Immunochemis-try Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Student of the Immunology Chair, Biology Faculty, M.V. Lomonosov MSU, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-8356-8077
Гусева Полина Павловна - лаборант лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; студент каф. иммунологии биол. факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Российская Федерация
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0009-0005-4197-7656
Романова Альфира Фердинандовна - мл. науч. сотр. лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected]
Прилипов Алексей Геннадьевич - д-р биол. наук, зав. лаб. молекулярной генетики ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-8755-1419
Филатов Александр Васильевич - д-р биол. наук, проф., зав. лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; проф. каф. иммунологии МГУ биологического факультета им. М.В. Ломоносова, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6460-9427
Polina P. Guseva - Technician of the Immunochemis-try Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Student of the Immunology Chair, Biology Faculty, M.V. Lomonosov MSU, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0009-0005-4197-7656
Alfira F. Romanova - Junior Researcher of the Immuno-chemistry Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0009-0003-4125-0153
Alexei G. Prilipov - Dr.Sci., PhD, Head of the Molecular Genetics Lab., N.F. Gamaleya FRCEM of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid. org/0000-0001-8755-1419
Alexander V. Filatov - Dr.Sci., PhD, Prof., Head of the Immunochemistry Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Prof. of the Immunology Chair, Biology Faculty, M.V. Lomonosov MSU, Moscow, Russian Federation
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6460-9427
