CC BY
17
УДК 619:613. 2:579.6
Новщька О., к. вет. н., асистент кафедри мжробюлогп, вiрусолоril та бютехнологп, novi [email protected], © Вербенюк О., студентка факультету ветеринарно1 медицини Нацональний университет бюресурсгв i природокористування Украгни, м. Knie
ЩОДО ПИТАННЯ ВИЗНАЧЕННЯ АНТИВ1РУСНО1 АКТИВНОСТ1
1НТЕРФЕРОН1В
У статтi обговорюеться питання щодо використання системи „ клтинна культура СНЕВ - вiрус ензоотичного енцефаломiелiту свиней " для визначення антивiрусног активностi ттерферотв.
Кючов слова: клтинна культура СНЕВ, вiрус ензоотичного енцефаломiелiту свиней, ттерферон.
Вступ. На раннш стадп розвитку вiрусноl шфекцп, до виникнення первинно! гуморально! вiдповiдi, найбiльш важливим захисним противiрусним механiзмом е швидка продукцiя iнфiкованими клiтинами iнтерферонiв 1 типу (1Фа та IФß). Утворення 1Фа пiд час вiрусноl шфекцп захищае сусiднi клiтини, стимулюе експресш молекул МНС та активуе цитокинпродукуючi Т-клiтини. 1нтерферон-у, подiбно 1Фа тдвищуе неспецифiчну цитотоксичну aктивнiсть цитокинпродукуючих кл^ин щодо iнфiковaних клiтин.
Окрiм aнтивiрусноl дп, iнтерферони проявляють протизапальну, протипухлинну та iмуномоделюючу aктивнiсть.
Проте, не завжди i не кожний оргашзм може активно продукувати iнтерферони, тому для лжування та профiлaктики патолопчних стaнiв iнтерферони виготовляються як окремi iмунологiчнi препарати.
Основним джерелом отримання препарата штерферошв е еритроцитарна маса кровi донорiв та iнтерферони, отримаш завдяки рекомбiнaнтним технологiям з генномодифжованих мiкрооргaнiзмiв-продуцентiв.
Одним з етатв виготовлення таких iнтерферонiв е визначення aнтивiрусноl aктивностi отриманих препaрaтiв.
За рекомендащями ВООЗ для визначення aнтивiрусноl aктивностi готових комерцiйних препaрaтiв штерферошв слщ використовувати систему клiтиннa культура MDBK (Madin-Darby bovine kidney cell) та тест^рус - вiрус везикулярного стоматиту (ВВС).
Проте ця система е надзвичайно вимогливою до культивування i не завжди у дослщниюв, якi проводять промiжнi випробування отриманих препaрaтiв, е можливкть перевiряти 1'х якiсть саме на цш системi.
Застосування альтернативно1 системи для визначення aнтивiрусноl aктивностi на промiжних стaдiях виготовлення препaрaтiв штерферошв дозволить ефективно оцшювати якiсть останшх.
© Новщька О., Вербенюк О., 2009 222
Матер1али i методи. Завданням нашо! роботи було з'ясувати можливкть використання для визначення aHTmipycHoi' активност препараив iнтерферонiв системи кл^инна культура СНЕВ (постiйна клiтинна культура кл^ин нирки ембрiона свинi) та тест^русу ензоотичного енцефаломieлiту свиней.
У робой були використаш готовi комерцшш препарати iнтерферонiв:
^ Лейкоцитарний штерферон людськiй з активнiстю 1000 МО/ мл
^ Комбiнований препарат штерферошв (а i у) отриманих вщ рекомбiнантних продуцентiв для ветеринарного застосування з актившстю 1 млн МО/мл.
Клiтинна культура СНЕВ, яка постшно пiдтримувалася у виглядi матрично! культури на пластикових та скляних матрациках об'емом 10 см3. Режим переЫву - кожш 72 години, коефiцieнт пересiву - 1:3. Поживне ростове середовище - сумш ГЛА/середовище 199 1:1 з 10% сироватки ВРХ.
Тест^рус - вакцинний штам вiрусу ензоотичного енцефаломieлiту свиней з iнфекцiйним титром 108 ЛД50/мл.
Визначення антивiрусноl активност даних iнтерферонiв проводили мiкрометодом на спещальних пластикових планшетах для культивування кл^ин (виробник Sarstedt) у декшька етапiв.
На першому етапi визначали титр вiрусу за загальновизнаною методикою.
На другому етат вносили в умовах боксу суспензш клiтин КК СНЕВ у лунки мжропланшети з поЫвною дозою 300 тис. кл /мл ростового поживного середовища у об'eмi 200 мкл/ лунку.
Культивування проводили в умовах 5% СО2. Пкля отримання моношару клiтин (через 24 год.) ростове середовище видаляли, моношар промивали розчином Хенкса та вносили десятикратш розведення iнтерферонiв у повторах.
Через 18 годин шкубаци при 37оС в умовах 5% СО2 культуральне пiдтримуюче середовище видаляли, кл^ини промивали розчином Хенкса та заражали вiрусом ензоотичного енцефаломieлiту свиней з множиншстю шфекци 100 ТЦД 50.
Вiрус iнкубували 30 хв. при 37оС, пiсля чого обробленi клггини вiдмивали розчином Хенкса. У лунки вносили тдтримуюче середовище.
Обов'язково залишали контролi клiтин без вiрусу та без штерферону та контроль робочо! дози вiрусу на клiтинах, необроблених штерферонами.
Культивування продовжували 24-48 годин.
Результати визначали у момент повно! дегенераци моношару iнфiкованих кл^ин. За антивiрусну активнiсть iнтерферонiв приймали число, яке вiдповiдаe розведенню препарату, при якому культура кл^ин у 50% лунок була повшстю захищена вiд цитопатогенно! ди iндикаторного вiрусу.
Результати дослiдження. Пiд час роботи було з'ясовано, що тест-вiрус добре культивуеться на клiтиннiй культурi СНЕВ i викликае цитопатичний ефект у виглядi заокруглення клiтин на 48 годину культивування.
223
1нтерферони у десятикратних розведеннях не викликали видимих змш у кл^инах моношару, за винятком розведення 10-1 лейкоцитарного штерферону, де спостер^алися деструктивш змши клiтин. Ми це пов'язуемо з дieю залишкових кiлькостей сечовини, яка використовуеться у процес виготовлення готового препарату.
Актившсть лейкоцитарного iнтерферону дещо поступалася комбшованому препарату iнтерферонiв.
Висновки. 1. 1нтерферони у десятикратних розведеннях не викликали видимих змш у кл^инах моношару, за винятком розведення 10-1 лейкоцитарного штерферону, де спостер^алися деструктивнi змши кл^ин.
2. Активнiсть лейкоцитарного штерферону дещо поступалася комбшованому препарату штерферошв.
Л1тература
1. Рабсон А., Ройт А., Делвз П. Основы медицинской иммунологии, -«Мир»: Москва: -2006. - С. 171.
2. Краснопольский Ю., Борщевская М. Биотехнология иммунобиологических препаратов. Харьков: «Фармитэк». - 2008. -312 с.
3. Gray P.W., Goeddel D.V. Strukture of the human immune interferon gene. Nature, 1982, 298:859-63.
4. Russel D.G. Of microbes and macrophages entry, survival and persistence. Current opinions in immunology. 1995. 7:479-484.
Summary
In the article questions come into question in relation to the use of the system cellular culture of PNEV - virus of enzootic encefalomielit of pigs for determination of antivirus activity of interferons.
Key word: cellular culture of PNEV, virus of enzootic encefalomielit pigs, interferon.
Стаття надшшла до редакцИ 7.04.2009
224
