CC BY
30
УДК 547.458.88+612.112
РОЛЬ ПЕКТИНА ПИЖМЫ ОБЫКНОВЕННОЙ В СОХРАННОСТИ ЯДЕРНЫХ КЛЕТОК КРОВИ ПРИ ЗАМОРАЖИВАНИИ
12Полежаева Т.В., 'Худяков А.Н., 2Патурова И.Г., 3Утемов С.В., 'Головченко В.В., 'Сергушкина М.И., 'Безмельцева О.М.
1ФГБУН Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН, Сыктывкар, Россия (167982, Республика Коми, г. Сыктывкар, ГСП-2, ул. Первомайская, 50), e-mail: [email protected] 2ФГБОУ ВО Кировский государственный медицинский университет Минздрава России, Киров, Россия (610027, г. Киров, ул. К. Маркса, 112), e-mail: [email protected]
3ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России», Киров, Россия (610027, г. Киров, ул. Красноармейская, 72), e-mail: [email protected].
Актуальным является поиск новых криозащитных сред для создания универсальных технологий длительного консервирования биологических объектов. Все известные криопротекторы были открыты эмпирически и относятся к разным классам химических соединений. Наличие у пектина пижмы обыкновенной функциональных групп, наиболее часто встречающихся у эффективных криопротекторов, указывает на возможность проявления криозащитного действия. Комплексный анализ химических, физико-химических, криозащитных свойств танацетана свидетельствует о его способности изменять характер кристаллизации воды и усиливать действие основного криопротектора глицерина, что свидетельствует о перспективе применения пектина при криоконсервировании биологических объектов в условиях температур электрических морозильников.
Ключевые слова: криоконсервирование, электрические морозильники, пектин танацетан, кристаллизация и плавление льда, жизнеспособность клеток.
THE ROLE OF PECTIN FROM TANACETUM VULGARE L. IN THE SAFETY OF NUCLEAR BLOOD CELLS DURING FREEZING
',2Polezhaeva T.V., 'Khudyakov A.N., 2Paturova I.G., 3Utemov S.V, 'Golovchenko V.V., 'Sergushkina M.I., 'Bezmeltseva O.M.
'Physiology Institute of Komi Scientific Center affiliated to the Ural Branch of the RAS, Syktyvkar, Russia (167982, Komi Republic, Syktyvkar, GSP-2, Pervomayskaya Street, 50), e-mail: [email protected] 2Kirov State Medical University, Kirov, Russia (610027, Kirov, K. Marx Street, 112), e-mail: [email protected] 3Kirov research Institute of Hematology and Blood Transfusion of the Federal Medical and Biological Agency of Russia, Kirov, Russia (610027, Kirov, Krasnoarmeyskaya Street, 72), e-mail: [email protected]
The search for new cryoprotective media to create universal technologies for the long-term conservation of biological objects is a challenge for researchers. All known cryoprotectants belong to different classes of chemical compounds. Pectin from Tanacetum vulgare L. contains functional groups most often found in effective cryoprotectants what indicates a possible cryoprotective mechanism. A comprehensive analysis of the chemical, physico-chemical, cryoprotective properties of tanacetan indicates its ability to change the character of water crystallization and increase the action of glycerol (as a basic cryoprotectant). This indicates the prospect of using pectin in the cryopreservation of biological objects in conditions of temperatures in electric freezers.
Key words: cryopreservation, electric freezers, pectin tanacetan, crystallization and melting ice, cell viability.
Введение
Пижма обыкновенная Tanacetum vulgare L. является широко распространенным растением. Она произрастает на всей территории Европы, в Турции, Монголии, Японии, встречается во многих регионах России. Интерес к этому растению был проявлен человеком очень давно. Широко известны различные способы применения пижмы в народной медицине, что связано с богатым химическим составом веществ в данном растении [17]. Современные научные данные о свойствах биологически активных веществ пижмы обыкновенной не только объясняют механизмы их лечебного действия, но и значительно расширяют границы практического применения данного растения [1, 5, 6, 10, 25]. Большой интерес вызывает вопрос о химическом строении и физиологической активности полисахаридов пижмы обыкновенной. Известно, что они способны связывать в сыворотке крови атерогенные
фракции холестерина [14, 16], ингибировать фактор некроза опухолей [2], обладают сильной противовоспалительной активностью [11], оказывают гепатопротекторное действие за счет уменьшения цитолиза и проявляют выраженное антиоксидантное действие [9], при этом не обладают токсичностью.
В связи с тем, что 43,3% от веса сухого полиса-харидного препарата пижмы обыкновенной составляют гликуроновые кислоты, данные полисахариды были отнесены к классу пектинов [21, 23] и получили название танацетаны [14]. Они имеют общий план строения - содержат линейную главную углеводную цепь галактуронана из а-1,4-связанных остатков Б-галактопиранозилуроновой кислоты и разветвленную область рамногалактуронана I [13]. В зависимости от способа выделения и используемых для этих целей частей растения, танацетаны могут отличаться
процентным содержанием галактуроновой кислоты и нейтральных моносахаридов (галактоза, арабиноза, рамноза, глюкоза, ксилоза, манноза [15]).
Комплекс структурных особенностей танаце-танов, большое количество функциональных групп, способных модифицировать молекулы воды [24], позволили предположить наличие у данного вида пектина способности к проявлению криозащитного действия, а отсутствие токсичности указывает на перспективу его использования в составе криозащитных сред. Для решения данного вопроса был проведен комплекс исследований, который включал в себя анализ осмотических и термографических характеристик водных растворов пектина, кинетику в них процессов кристаллизации и плавления льда, влияние пектина на функциональные показатели ядерных клеток, в том числе при их введении в криоанабиоз разной глубины (-20°С, -40°С, -80°С).
Материал и методы
В работе использован пектин танацетан, выделенный в отделе иммунологии и биотехнологии Института физиологии Коми НЦ УрО РАН методом последовательной экстракции [14] из воздушно-сухих соцветий пижмы обыкновенной Tanacetum vulgare L., собранной в окрестностях г. Сыктывкара. Полисаха-ридная фракция в своем составе имела 64% галактуроновой кислоты и 25% нейтральных моносахаридов (галактоза - 8,5%, арабиноза - 8,4%, рамноза - 5,5%, глюкоза - 1,2%, ксилоза - 0,9%, манноза - 0,5%).
Исследованы свойства растворов танацетана в концентрации 1,0%, 0,4%, 0,2% вес/объем, которые были приготовлены на дистиллированной воде. Выбор указанных концентраций был основан на ранее полученных данных об использовании других пектиновых полисахаридов в составе криозащитных сред [4, 20].
Осмолярность растворов пектина и криоконсер-ванта оценивали криоскопическим методом с использованием осмометра ОСКР-1 (С.-Петербург). Погрешность в диапазоне измерений от 0 до 500 мОсм/л составляла ± 2.0.
При термографическом анализе растворы по 1 мл в пластиковых криопробирках (Nunc, Германия) размещали в камере программного замораживателя (ЗП10 производства СКТБ ИПКиК НАН Украины) и охлаждали со скоростью 1°С/мин. Измерение температуры проводили непосредственно в образце с использованием многофункционального двуканального измерителя ОВЕН ТРМ 200 (Россия).
Морфологические особенности кристаллической структуры, формирующейся при фазовом переходе в растворах пектина «вода-лед» на этапе охлаждения и «лед-вода» на этапе отогрева, изучали методом крио-микроскопии. Образцы в виде капли наносили на предметное стекло рабочей камеры криоприставки крио-микроскопического комплекса для криобиологических исследований [12] (производства СКТБ ИПКиК НАН Украины). Для снятия переохлаждения и визуализации поля зрения в каплю вносили кристаллики AgJ. Каплю покрывали покровным стеклом для исключения высыхания и получения тонкослойного препарата, позволяющего получить четкое изображение на просвет. Образцы охлаждали со скоростью 1°С/мин. до завершения видимых изменений морфологии кристаллической структуры (-15°С...-20°С) и затем отогревали со скоростью 1°С/мин. Регистрацию температуры при охлаждении контролировали в рабочей камере криосто-лика. Регистрацию кинетики процесса кристаллизации
и плавления растворов осуществляли с использованием видеокамеры-окуляра DCM-300 в режиме фото- и покадровой видеосъемки со скоростью 1 кадр через 5 сек. или со скоростью 1 кадр через 3 сек., при этом каждый последующий кадр соответствовал снижению (повышению) температуры в рабочей камере на 0,08°С или 0,05°С, соответственно.
В качестве биологического объекта в экспериментах использовали наиболее чувствительные к неблагоприятному действию холода ядерные клетки - лейкоциты крови человека. Лейкоциты выделяли из цельной крови доноров-добровольцев (39,4±12,2 года) путем цитафереза (2500 об./мин. c охлаждением 5 минут, Sorvall, США). Клетки смешивали (1:1) с криоконсервантом, содержащим танацетан в исследуемой концентрации 0,2%, классический криопротектор проникающего действия глицерин (Самарамедпром, Россия) в низкотоксичной 7,0% концентрации, антикоагулянт трилон Б (Лабтех, Россия) в концентрации 0,1%. Охлаждение клеток осуществляли по медленным нелинейным программам (средняя скорость охлаждения от +20°С до -20°С составила 2.6 °С/мин., далее до -40°С по 3 °С/мин., далее до -80°С по 3,5°С) с использованием электрических морозильников. На первом этапе после 15 минут экспозиции лейкоцитов с криоконсервантом полимерный контейнер «Компопласт 300» (Синтез, Россия) переносили в спиртовую ванну (96% этиловый спирт), которую помещали в камеру электроморозильника, обеспечивающего стабильную температуру -20°С (Derby, Дания), и выдерживали 15 мин. После этого контейнер переносили для дальнейшего замораживания и хранения в воздушную среду камеры электроморозильников, обеспечивающих стабильную температуру -20°С, -40°С (Derby, Дания), -80°С (Vestfrost, Дания), в зависимости от выполняемой серии. Через 1 сутки хранения образцы отогревали в 20-литровой водяной ванне (+38°С) при интенсивном покачивании контейнера в течение 15-40 сек. в зависимости от температуры хранения.
После отогрева методом световой микроскопии (Nikon H550S, Япония) оценивали [20]: общее количество лейкоцитов в камере Горяева, степень крио-устойчивости различных популяций клеток в мазках, окрашенных по Май-Грюнвальду и Романовскому, целостность клеточной мембраны лейкоцитов в пробах с 1,0% раствором суправитального красителя эозина, процент фагоцитирующих нейтрофилов с использованием инертных частиц латекса диаметром 0,08 мкм (Sigma-Aldrich, Германия).
Влияние танацетана на интенсивность перекисно-го окисления липидов в мембранах лейкоцитов оценивали с помощью метода индуцированной (перекисью водорода с сульфатом железа) хемилюминесценции на биохемилюминометре БХЛ-07 (ЦНИЛ НГМА, Россия). В измерительную кювету прибора вносили 0,1 мл исследуемого клеточного субстрата, либо субстрата с танаце-таном в исследуемой концентрации, 0,4 мл фосфатного буфера (рН=7,5), добавляли 0,4 мл 0,01 мМ раствора сульфата железа (Спектр-Хим, Россия) и помещали в измерительную кювету. После чего в нее быстро вносили 0,2 мл 2% раствора перекиси водорода (Химпром, Россия) и регистрировали сигнал в течение 30 сек. Оценивали следующие параметры: Imax (мВ) - максимальную интенсивность быстрой вспышки, отражающей потенциальную способность биологического объекта к свободно радикальному окислению; S (мВ*сек.) - све-
тосумму за 30 сек., отражающую содержание радикалов; tg(-2а) - тангенс угла наклона кривой оси времени (характеризует максимальную крутизну спада кривой, со знаком «-»), чем выше значение показателя tg(-2a), тем выше активность ферментативных систем клеток, регулирующих содержание гидроперекисей.
При статистической обработке данных вычисляли среднее арифметическое значение ± среднее квадратичное отклонение (М±5). Для выявления статистической значимости различий между группами применяли непараметрический критерий Уилкоксона с использованием компьютерной программы для медико-биологической статистики «БЮ8ТЛТ» [8].
Результаты и их обсуждение
Установлено, что осмолярность растворов та-нацетана очень низкая. Например, для 1,0% раствора она составляет 30 мОсм/л (осмолярность дистиллированной воды 0,002 мОсм/л). Ранее нами показано [3], что растворы пектинов обладают низкой осмо-лярностью, однако при добавлении, в частности, та-нацетана (0,2%) к криопротектору глицерину (7%), осмолярность последнего увеличивалась, а температура начала кристаллизации раствора снижалась. Возможно, данная особенность способствует проявлению криофилактического эффекта у танацетана.
Термографический анализ показал, что присутствие танацетана в растворах даже в столь низких концентрациях (0,4% и 0,2%) оказывает влияние на кинетику кристаллизационных процессов. Так, начало кристаллизации в 0,4% и 0,2% растворах танацетана наблюдается соответственно при температурах -7,2°С и -5,9°С, что свидетельствует об их способности к довольно глубокому переохлаждению. Плато кристаллизации регистрируется при -0,07°С и -0,06°С, а его длительность соответственно составляет 7,2 мин. и 5,3 мин. Более длительное время теплового равновесия процесса кристаллообразования в 0,4% растворе танацетана может быть связано как с большей вязкостью раствора, так и с ограниченным доступом молекул воды к фазовой границе роста в силу особенностей пространственной структуры молекулы данного пектина.
При криомикроскопическом анализе особенностей кристаллической структуры, формирующейся при фазовом переходе в растворах данного пектина, установлено следующее. В 0,2% растворе танаце-тана фазовый переход наблюдается при температуре -1,76°С в виде линейно направленного роста кристаллической структуры и формирования каналов жидкой фракции. При дальнейшем понижении температуры вымораживание воды в жидкой фракции сопровождается непрерывным сужением каналов и закономерным увеличением концентрации полисахарида в них. При температуре -15°С концентрированный пектин вытесняется из каналов, которые практически превращаются в границы между кристаллическими зернами, в виде включений.
Особенностью морфологической структуры льда, которая формируется в 0,4% растворе пектина при температуре -1,88°С, является первичное формирование довольно плотной сети каналов, часть которых имеет строго линейный вид, а другая - вид разнонаправленных искаженных линий. Границей между этими областями явился сформировавшийся в структуре широкий канал. Вполне вероятно, что имело место образование нескольких источников роста кристаллов в разных направлениях или же в силу возникшего при фазовом
переходе градиента концентрации первоначально линейный фронт потерял устойчивость и возникла нерегулярность роста кристаллов.
Кинетика процесса плавления в 0,4% и 0,2% растворах танацетана принципиально не отличалась. Признаки плавления хорошо фиксировались при -10°С появлением локальных жидких областей. По мере повышения температуры расширение каналов развивалось довольно медленно до температуры -3,96°С. В интервале температур -3,56°С... -3,24°С наблюдалось интенсивное плавление кристаллов льда до их полного исчезновения в поле зрения.
В связи с тем, что процесс кристаллизации в 0,2% растворе танацетана развивался в более равновесных термодинамически условиях, данная концентрация была использована в дальнейших исследованиях.
С помощью метода световой микроскопии установлено, что данный пектин статистически значимо (р<0,05) активирует у нейтрофилов процесс образования фагосом с латексом: без танацетана фагоцитарная активность отмечалась у 55±5,0% клеток (п=10), в присутствии танацетана - у 72±5,0% нейтрофилов. Ранее нами выявлено [3], что 0,2% раствор пектина в присутствии чужеродного объекта - частиц латекса - также усиливает кислородзависимую микроби-цидность (интенсивность респираторного взрыва) у нейтрофилов. Таким образом, танацетан в 0,2% концентрации в отношении нейтрофилов крови человека проявляет иммуностимулирующее действие. Ранее показано [13], что противовоспалительным действием при пероральном введении обладают галактурона-ны с молекулярной массой свыше 300 кДа, у используемого в работе танацетана она составляет 580 кД.
Ранее нами показано [22], что присутствие в клеточной суспензии глицерина (7%) вызывает снижение устойчивости мембран лейкоцитов к перекисному окислению, но при этом активирует их антиоксидант-ные системы. Согласно данным хемилюминесцентно-го метода танацетан (0,2%) не оказывает влияния на интенсивность перекисного окисления липидов ней-трофилов и активность их антиоксидантных систем, регулирующих содержание гидроперекисей. Комбинирование глицерина с танацетаном способствует стабилизации состояния системы перекисного окисления ли-пидов и активности антиоксидантных систем мембран лейкоцитов, что, возможно, также способствует сохранности функций клеток при замораживании.
При определении эффективности применения танацетана для сохранности клеток крови человека при -20°С установлено (табл. 1), что пектин усиливает криозащитный эффект глицерина. Возможно, это связано с тем, что разветвленная молекула танацета-на имеет большое количество гидроксильных (-0Н) и карбоксильных (-СООН) групп. Эти группы образуют водородные и сложноэфирные связи с гидрок-сильными группами глицерина, формируя желе, в котором пектин образует трехмерную сеть статически равномерно распределенную по массе этого желе, включающей большое количество воды. Вероятно, это приводит к повышению осмолярности раствора и способствует снижению температуры кристаллизации. Такая стабилизация молекул воды, вероятно, способствует ровному линейному фронту кристаллизации и снижает риск криоповреждения.
Это подтверждают показатели сохранности лейкоцитов, замороженных с глицерином и танацетаном. Необходимо отметить, что молекула танацетана не спо-
Таблица 1
Влияние пектина танацетана (0,1%) на криозащитный эффект глицерина (3,5%) по показателям сохранности лейкоцитов, перенесших воздействие различных температур в течение 1 суток
Серия п=10 Показатели сохранности, М±с
общее количество лейкоцитов количество эозинорезистентных клеток количество гранулоцитов количество фагоцитарно-активных нейтрофилов
-20°С
Лейкоциты без консерванта 81±9,6 28±4,8 * 5±0,2 * Н
Лейкоциты с глицерином 3,5% 86±13,4 76±8,3 51±11,9 Н
Лейкоциты с глицерином 3,5% и танацетаном 0,1% 87±10,0 87±6,5 * 60±5,9 * 67±8,5
-40°С
Лейкоциты без консерванта 68±1,1 * 15±3,2 * 16±1,1 * Н
Лейкоциты с глицерином 3,5% 87±8,5 60±7,8 50±5,2 Н
Лейкоциты с глицерином 3,5% и танацетаном 0,1% 90±13,1 74±14,0 * 32±1,7 * # 61±1,4 #
-80°С
Лейкоциты без консерванта 29±7,1 * Н
Лейкоциты с глицерином 3,5% 84±12,7 70±14,5 52±12,8 Н
Лейкоциты с глицерином 3,5% и танацетаном 0,1% 84±12,3 83±3,4 * 47±10,1 # 69±10,6
Примечание: данные представлены в процентах по отношению к уровню до замораживания, принятому за 100; Н - подсчет невозможен, в связи с разрушением отогретых клеток; * - различие с величиной показателя «лейкоциты с глицерином» при соответствующей температуре статистически значимо (р<0,05); # - различие с величиной показателя «лейкоциты с глицерином и танацетаном» при -20°С
статистически значимо (р<0,05).
собна проникать через клеточную мембрану в связи с большой массой. Поэтому криопротекторное действие данный пектин оказывает экзоцеллюлярно.
К положительным эффектам используемого в работе глицерина относят его эндоцеллюлярную способность [18], обусловленную его малой молекулярной массой (92 Да). При обычных температурах (22 ^ 37°С) глицерин легко проникает в клетки и защищает мембрану и внутриклеточные структуры, действуя как противосолевой буфер. Защитные свойства глицерина связаны также с его способностью поддерживать переохлажденное состояние клетки, поскольку его молекулы образуют стабильные водородные связи с водой. При фазовом переходе из переохлажденного состояния он способен уменьшать размер внутриклеточных кристаллов льда, обусловленный возникновением многочисленных центров кристаллизации. Однако, как известно, в клинической практике перед трансфузией требуется удаление глицерина из клеток в связи с его токсичностью. Используемые разнообразные методы удаления глицерина из клеток неизбежно приводят к их дополнительным повреждениям, снижая эффективность трансфузионной суспензии. Как свидетельствуют экспериментальные данные, полученные в данной работе, концентрация глицерина в клеточной среде 3,5% является малотоксичной. Таким образом, комбинирование глицерина
и танацетана позволяет снизить токсичность консерванта и сохранить криозащитный эффект.
Необходимо отметить, что танацетан способен усиливать не только криозащитный эффект криопро-тектора глицерина, но также и диметилацетамида, что в свою очередь положительно влияет на сохранность тромбоцитов при их хранении в условиях -196°С [4].
Сохранность клеток при замораживании во многом зависит от глубины их анабиоза и степени активности метаболизма. При охлаждении происходит последовательное включение в кристаллическую структуру льда сначала внеклеточной воды, затем внутриклеточной свободной (объемной), далее слабо связанной и прочно связанной с биомакромолекулами фиксированной воды [7]. Это в свою очередь отражается на степени замедления метаболизма в клетках.
Согласно классификации диапазонов отрицательных температур в присутствии широко применяемых в криобиологической практике крио-протекторов в 5-20% конечной концентрации при температуре -20°С внеклеточная вода и, как правило, находящаяся на отдаленном расстоянии от поверхности компонентов мембран и высоко подвижная свободная внутриклеточная вода замерзают [19]. Слабо связанная, но менее подвижная фракция внутриклеточной воды, которая расположена ближе к поверхности биополимеров, а также прочно связанная
фракция, которая взаимодействует с поверхностью биополимеров и входит в координационные сферы сил притяжения их полярных и неполярных участков, остаются в клетках в незамерзшем состоянии. В этом случае метаболизм в клетках несколько замедлен. В этих условиях танацетан совместно с глицерином оказывают выраженный криозащитный эффект.
При температуре -40°С в незамерзшем состоянии остается лишь фракция прочно связанной воды, кристаллизация слабо связанной воды весьма неустойчивая, и любой провоцирующий фактор может вызвать ее кристаллизацию, приводящую к гибели клеток. Метаболизм при данной температуре замедлен. В этих условиях применение танацетана с глицерином оказалось менее эффективным (табл.).
При -80°С в незамерзшем состоянии остается лишь прочно связанная вода, кристаллизация же всех других фракций воды стабильна. Наблюдается выраженное замедление метаболизма [19]. В этих условиях танацетан совместно с глицерином способны оказать криозащитный эффект, однако он статистически значимо слабее, чем при -20°С (табл. 1).
Таким образом, танацетан совместно с глицерином даже в столь низких концентрациях (0,1% и 3,5% соответственно) оказывают эффективное криозащит-ное действие в отношении лейкоцитов крови человека в условиях субумеренно-низкой температуры -20°С.
Заключение
Выделенный из соцветий пижмы обыкновенной Tanacetum vulgare L. экстракцией водой и оксалатом аммония пектин танацетан (с выходом 64% галактуроновой кислоты и 25% нейтральных моносахаридов) даже в столь низкой концентрации 0,2%-0,4% вес/объем может выступать в роли модификатора морфологической структуры льда. За счет функциональных гидроксильных и карбоксильных групп молекула танацетана способна образовывать многочисленные водородные и сложноэфирные связи с гидроксильными группами глицерина, формируя сеть для захвата большого количества молекул воды, что приводит к повышению осмолярности раствора и способствует снижению температуры его кристаллизации. Вероятно, данная особенность обеспечивает сохранность ядерных клеток крови, замораживаемых в присутствии танацетана и глицерина в условиях субумеренно-низкой температуры -20°С.
В свете современных исследований, посвященных поиску новых эффективных средств криозащиты клеток, полученные в работе результаты свидетельствуют о перспективе способов криоконсервирования биологических объектов в условиях температур электрических морозильников с использованием пектинов.
Авторы выражают благодарность д.б.н., ст.н.с. отдела низкотемпературного консервирования Института проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины Л.Г. Кулешовой (г. Харьков) за проведение термографического и криомикроскопического анализов.
Список литературы
1. Caillet S., Yu H., Lessard S., Lamourex G., Ajdukovic D., Lacroix M. Fenton reaction applied for screening natural antioxidants // Food Chemistry. 2007. V 100. P. 542-552.
2. Gang Xie, Igor A. Schepetkin, Mark T., Quinn G. Immunomodulatory activity of acidic
polysaccharides isolated from Tanacetum vulgare L. // Int. Immunopharmacol. 2007. V. 7. P. 1639-1650.
3. Khudyakov A.N., Polezhaeva T.V., Zaitseva О.О., Gunter Е.А., Solomina O.N., Popeyko O.V., Shubakov A.A., Vetoshkin K.A. The cryoprotectant effect of polysaccharides from plants and microalgae on human white blood cells // Biopreserv. Biobanking. 2015. Vol. 13, № 4. P. 240-246.
4. Polezhaeva T.V, Zaitseva О.О., Khudyakov A.N., Laptev D.S., Golovchenko V.V., Gordiyenko Е.А., Kuleshova L.G. Use of pectin polysaccharides for cryopreservation of biological objects // Arch. Biol. Sci. 2014. Vol. 66, № 3. Р. 1025-1033.
5. Williams C.A., Harborne J.B., Eagles J. Variations in lipophilic and polar flavonoids in the genus Tanacetum // Phytochemistry. 1999. V. 52. P. 1301-1306.
6. Wojdylo A., Oszmialski J., Czemerys R. Antioxidant activity and phenolic compounds in 32 selected herbs // Food Chemistry. 2007. V 105, № 3. P. 940-949.
7. Белоус A.M., Грищенко В.И. Криобиология. Киев: Наукова Думка, 1994. 430 с.
8. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1998. 459 с.
9. Енгалычева Е.Е., Якушева Е.Н., Сычев И.А., Щулькин А.В. Изучение гепатопротекторной активности полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2015. № 2. С. 52-57. Doi: 10.17816/pavlovj2015250-55.
10. Ермакова С.А., КисилеваА.Н., Коган Е.Г. Фи-тохимический анализ и исследование антиоксидант-ной активности настоек на основе Aronia melanocarpa fructus и Tanacetum vulgare L. flores // Смоленский медицинский альманах. 2016. № 1. С. 84-87.
11. Кириченко Е.Е., Сычев И.А., Чекулаева Г.Ю. Исследование противовоспалительной активности полисахарида цветков пижмы обыкновенной // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2012. № 3. С. 53-57. Doi: 10.17816/pavlovj2012353-57.
12. Кулешова Л.Г. Криомикроскопический комплекс для криобиологических исследований // Цитология. 2004. Т. 46, № 9. С. 809-810.
13. Оводов Ю.С., Головченко В.В., Гюнтер Е.А., Попов С.В. Пектиновые вещества растений европейского Севера России. Екатеринбург: УрО РАН, 2009. 112 с.
14. Полле А.Я., Оводова Р.Г., Попов С.В. Выделение и общая характеристика полисахаридов из пижмы обыкновенной, мать-и-мачехи и лопуха войлочного // Химия растительного сырья. 1999. № 1. С. 33-39.
15. Полле А.Я., Оводова Р.Г., Шашков А. С., Оводов Ю.С. Выделение и общая характеристика полисахаридов из пижмы обыкновенной // Биоорганическая химия. 2001. Т. 27, № 1. С. 52-56.
16. Рыженков В.Е., Соловьева М.А., Ремезова О.В., Окуневич И.В. Гиполипидемическое действие сульфатированных полисахаридов // Вопросы медицинской химии. 1996. Т. 42, № 2. С. 115-119.
17. Сафонов Н.Н. Полный атлас лекарственных растений. М.: Эксмо, 2011. 312 с.
18. Сведенцов Е.П. Криоконсерванты для живых клеток. Сыктывкар: Коми научный центр УрО РАН, 2010. 80 с.
19. Сведенцов Е.П., Туманова Т.В. Функциональное состояние лейкоцитов после выхода из крио-анабиоза. Екатеринбург: УрО РАН, 2007. 81 с.
20. Соломина О.Н., Сведенцов Е.П., Зайцева О.О., Полежаева Т.В., Оводова Р.Г., Головчен-ко В.В., Лаптев Д.С., Худяков А.Н., Степанова Е.С., Оводов Ю.С. Криопротекторные свойства ряда пектинов // Доклады академии наук. 2010. Т. 430, № 4. С. 559-561. Doi: 10.1134/S0012496610010072.
21. Сысоева К.Н., Горин А.Г., Яковлев А.И. Динамика содержания водорастворимых полисахаридов в соцветиях пижмы обыкновенной // Растительные ресурсы. 1979. Т. 15, Вып. 1. С. 89-91.
22. Худяков А.Н., Полежаева Т.В., Зайцева О.О., Лаптев Д.С., Соломина О.Н., Костяев А.А. Влияние криозащитных растворов и их компонентов на интенсивность процессов перекисного окисления липи-дов и антиоксидантную активность лейкоцитов при криоконсервировании // Проблемы криобиологии и криомедицины. 2013. Т. 23, № 1. С. 49-57.
23. Шаламова Г.Г., Сысоева К.Н. Минеральный и белковый состав полисахаридного комплекса из соцветий Tanacetum vulgare L. // Химия природных соединений. 1985. № 2. С. 267-268.
24. Шраго М.И., ГучокМ.М., Калугин Ю.В., Ха-нина Л. А. О некоторых путях создания криопротекто-ров // Проблемы гематологии и переливания крови. 1981. Т. 16, № 6. С. 3-8.
25. Яковлева А.И., Семенова В.В. Биологически активные вещества Пижмы обыкновенной Tanacetum vulgare L., произрастающей в центральной Якутии // Химия растительного сырья. 2010. № 3. С. 147-152.
References
1. Caillet S., Yu H., Lessard S., Lamourex G., Ajdukovic D., Lacroix M. Fenton reaction applied for screening natural antioxidants. Food Chemistry. 2007;100:542-552.
2. Gang Xie, Igor A. Schepetkin, Mark T. QuinnG. Immunomodulatory activity of acidic polysaccharides isolated from Tanacetum vulgare L. Int. Immunopharmacol. 2007;7:1639-1650.
3. Khudyakov A.N., Polezhaeva TV., Zaitseva
0.0., Grnter Е.А., Solomina O.N., Popeyko O.V., Shubakov A.A., Vetoshkin K.A. The cryoprotectant effect of polysaccharides from plants and microalgae on human white blood cells. Biopreserv. Biobanking. 2015;13(4):240-246.
4. Polezhaeva TV., Zaitseva О.О., Khudyakov A.N., Laptev D.S., Golovchenko V.V., Gordiyenko Е.А., Kuleshova L.G. Use of pectin polysaccharides for cryopreservation of biological objects. Arch. Biol. Sci. 2014;66(3):1025-1033.
5. Williams C.A., Harborne J.B., Eagles J. Variations in lipophilic and polar flavonoids in the genus Tanacetum. Phytochemistry. 1999;52:1301-1306.
6. Wojdylo A., Oszmialski J., Czemerys R. Antioxidant activity and phenolic compounds in 32 selected herbs. Food Chemistry. 2007;105(3):940-949.
7. Belous A.M., Grishhenko VI. Kriobiologiya. Kiev: Naukova dumka. 1994. 430 p. (in Russ.).
8. Giants S. Mediko-biologicheskaya statistika. Moscow: Praktika, 1998. 459 p. (in Russ.).
9. Engalycheva E.E., Yakusheva E.N., Sychev
1.A., Shhul'kin A.VA. study of the hepatoprotective activity of the polysaccharide complex flowers of tansy. Rossiyskiy mediko-biologicheskiy vestnik imeni akademika I.P. Pavlova. 2015;(2):52-57 (in Russ.).
10. Ermakova S.A., Kisilyova A.N., Kogan E.G. Phytochemical analysis and study of antioxidant activity
of tinctures on the basis of Aronia melanocarpa fructus and Tanacetum vulgare L. flores. Smolenskiy meditsinskiy al'manah. 2016;(1):84-87 (in Russ.).
11. Kirichenko E.E., Sychev I.A., Chekulaeva G. Yu. The Study of anti-inflammatory activity of the polysaccharide of the flowers of tansy. Rossiyskiy mediko-biologicheskiy vestnik imeni akademika I.P. Pavlova. 2012;(3):53-57 (in Russ.). Doi: 10.17816/ pavlovj2012353-57.
12. Kuleshova L.G. Cryomicroscopic complex for cryobiological studies. Citologiya. 2004;46(9):809-810 (in Russ.).
13. Ovodov Yu.S., Golovchenko V.V., Günter E.A., Popov S.V. Pektinovye veshhestva rasteniy evropeyskogo Severa Rossii. [Pectin substances of the European North of Russia] Ekaterinburg: UrO RAN, 2009. 112 p. (in Russ.).
14. Polle A.Ya., Ovodova R.G., Popov S.V Isolation and General characteristics of polysaccharides from ordinary tansy, mother and stepmother and burdock felt. Khimiya rastitel'nogo syr'ya. 1999;(1):33—39 (in Russ.).
15. Polle A.Ya., Ovodova R.G., Shashkov A.S., Ovodov Yu.S. Isolation and General characterization of polysaccharides from tansy. Bioorganicheskaya khimiya. 2001;27(1):52-56 (in Russ.).
16. Ryzhenkov V.E., Solov'eva M.A., Remezova O.V., Okunevich I.V. Hypolipidemic action of sulfated polysaccharides. Voprosy meditsinskoy khimii. 1996;42(2):115-119 (in Russ.).
17. Safonov N.N. Polnyy atlas lekarstvennyh rasteniy. Moscow: Eksmo, 2011. 312 p. (in Russ.).
18. Svedentsov E.P. Kriokonservanty dlya zhivyh kletok. [Cryoprotectants for living cells] Syktyvkar: Komi nauchnyy tsentr UrO RAN, 2010. 80 p. (in Russ.).
19. Svedentsov E.P., Tumanova T.V Functional state of leukocytes after exiting cryoanabiosis. Ekaterinburg: UrO RAN, 2007. 81 p. (in Russ.).
20. Solomina O.N., Svedentsov E.P., Zajtseva O.O., Polezhaeva T.V., Ovodova R.G., Golovchenko V.V., Laptev D.S., Khudyakov A.N., Stepanova E.S., Ovodov Yu.S. Cryoprotectant series properties of pectins. Doklady akademii nauk. 2010;430(4):559-561 (in Russ.).
21. Sysoeva K.N., Gorin A.G., Yakovlev A.I. Dynamics of the content of water-soluble polysaccharides in the inflorescences of tansy. Rastitel'nye resursy. 1979;15(1):89-91 (in Russ.).
22. Khudyakov A.N., Polezhaeva T.V., Zajtseva O.O., Laptev D.S., Solomina O.N., Kostyaev A.A. Effect of cryoprotective solutions and their components on the intensity of processes of lipid peroxidation and antioxidant activity of white blood cells in the cryopreservation. Problemy kriobiologii i kriomeditsiny. 2013;23(1):49-57 (in Russ.).
23. Shalamova G.G., Sysoeva K.N. Mineral and protein composition of the polysaccharide complex from the inflorescences of Tanacetum vulgare L. Khimiya prirodnyh soedineniy. 1985;(2):267-268 (in Russ.).
24. Shrago M.I., Guchok M.M., Kalugin Yu.V., Hanina L.A. On some ways to create cryoprotectants. Problemy gematologii i perelivaniya krovi. 1981;16(6):3-8 (in Russ.).
25. Yakovleva A.I., Semenova V.V. Biologically active components of Tansy Tanacetum vulgare L. growing in the Central Yakutia. Khimiya rastitel'nogo syr'ya. 2010;(3):147-152 (in Russ.).
