CC BY
40
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2007 Биология Вып. 5 (10)
Медико-биологические науки
УДК 612-017.1.018
РОЛЬ ^-10 И ПРОСТАГЛАНДИНОВ В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ В ПРИСУТСТВИИ ОПИОИДНЫХ ПЕПТИДОВ
С. В. Гейна ь, К. Г. Горшковаь, О. Н. Гейнь, С. П. Тендряковаа ь
а Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15 ь Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13
Установлено, что в нефракционированной клеточной культуре р-эндорфин активировал продукцию интерлейкина-1р (ГЬ-1Р) и угнетал продукцию интерлейкина-8 (ГЬ-8) в присутствии липополисахарида (ЛПС), не влияя на продукцию а-фактора некроза опухолей (Т№-а) и интерлейкина-6 (ГЬ-6). Лёгкий стимулирующий эффект в культуре лейкоцитов пептид оказывал на спонтанную продукцию ГЬ-1р. Показано, что р-эндорфин способен оказывать как опосредованный, так и прямой эффект на функциональную активность лимфоидных клеток.
Введение
Опиоидный пептид Р-эндорфин является производным гипофизарного пептида проопиомеланокор-тина и обладает широким спектром иммунорегуля-торной активности (Panerai, Sacerdote, 1997). Показано, что Р-эндорфин в зависимости от влияния различных факторов, таких как тип иммунного ответа (клеточный или гуморальный), доминирование Т-хелперов I или II типов (Th1/Th2), состав клеточного микроокружения, способен оказывать как иммуно-супрессивные, так иммуностимулирующие эффекты, выраженность которых может сильно варьировать.
В настоящее время выявлена способность Р-эндорфина модулировать функции лимфоцитов, натуральных киллеров (NK-клеток) и макрофагов (Plotnikoff et al., 1999). Роль p-эндорфина в регуляции секреторной функции моноцитов, в частности продукции цитокинов провоспалительной группы (IL-1Р, TNF-a, IL-6), выполняющих ключевую роль в запуске и формировании иммунного ответа, остаётся достаточно противоречивой (Plotnikoff et al., 1999). Малоизученной является роль отдельных продуктов, секретируемых моноцитами, в регуляции и формировании направленности эффекта опиоидных пептидов на пролиферативную активность лимфоцитов.
Цель работы - оценка роли IL-ip, IL-6 и про-стагландинов в p-эндорфин-опосредованной регуляции пролиферативного ответа лимфоцитов.
Методы исследования
Объектом исследования служили моноциты периферической венозной крови здоровых муж-чин-добровольцев в возрасте от 22 до 30 лет. Ге-паринизированную венозную кровь отстаивали в течение 2 ч при 37°С. Затем верхний слой плазмы с лейкоцитами снимали и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 20 мин и ресуспендировали в RPMI 1640 (ICN, США) с добавлением HEPES 10 mM (Sigma, США), L-глутамина 2 mM (Sigma, США), 100 мкг/мл гентамицина и 10% ЭТС (ICN, США). Культивирование осуществляли в 24-луночных планшетах Costar (США) 1*106 клеток в 1 мл питательной среды во влажной атмосфере с 5% СО2 при 37°С в течение 24 ч в присутствии субоптимальной концентрации фитогемагглюти-нина (ФГА) (Sigma, США) 2.5 мкг/мл и липополи-сахарид Escherichia coli O26:B6 (ЛПС) (Sigma, США) 0.1 мкг/мл. Р-эндорфин (Sigma, США) вносили в культуры одновременно с ФГА и ЛПС в концентрациях 10-7-10-11М, налоксона гидрохлорид и налтриндола гидрохлорид (ICN, США) - 106М. Супернатанты собирали в пробирки Эппен-дорф и хранили в замороженном состоянии при -20°С.
Оценку выраженности пролиферации производили по стандартной методике с использованием Н3-тимидина в культурах лейкоцитов, активированных ФГА 2.5 мкг/мл, в 96-луночных круглодонных планшетах в течение 72 ч. Каждая культура содержала 2*105 клеток в 0.2 мл среды 199 с
© С. В. Гейн, К. Г. Горшкова, О. Н. Гейн, С. П. Тендрякова, 2007
186
добавлением HEPES 10 mM (Sigma), L-глутамина 2 mM (Sigma), 100 мкг/мл гентамицина и 10% ЭТС (ICN). За 18 ч до окончания культивирования в культуры вносили по 2 мкКи Н3-тимидина. Радиоактивность проб определяли на сцинтилляционном счетчике "Guardian" (Wallac, Финляндия). Анти-IL-1P-антитела (Протеиновый контур, Россия) вносили в культуры в концентрации 2 мкг/мл, ингибитор циклооксигеназы - диклофенак натрия -25 мкг/мл (Ширшев, 1996).
Определение концентрации IL-1P, TNF-a, IL-6, IL-8 в супернатантах клеточных культур производили с использованием наборов ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург) в соответствии с методикой, предложенной производителем.
Результаты определяли с использованием многофакторного дисперсионного анализа для парных Влияние p-эндорфина на продукцию IL-ip, TNF-a,
данных и парного /-критерия для межгруппового сравнения. Все данные представлены в виде средней и её стандартной ошибки (М+т).
Результаты и их обсуждение
Как видно из таблицы, в нефракционированной клеточной культуре Р-эндорфин (10-7-10-11М) активировал ЛПС-индуцированную продукцию ГЬ-1Р, не влияя на синтез ГЬ-6 и ТОТ-а, одновременно в концентрациях 10-7 и 10-11 М угнетая продукцию ГЬ-8. Лёгкий стимулирующий эффект пептид оказывал на спонтанную продукцию ГЬ-1Р в концентрации 10-7-10-9М. На индуцированную субоп-тимальной дозой ФГА продукцию исследуемых цитокинов Р-эндорфин не влиял.
!Ъ-6 в нефракционированной клеточной суспензии
Цито- Эксперименталь- Концентрация ß-эндорфина, M
кин ное воздействие контроль 10-7 10-9 10-11
IL-1ß. Без индуктора 193.01+39.16 271.66+77.96* 266.57+49.18* 238.22+50.19
пг/мл ФГА 2.5 мкг/мл 228.59+48.19 220.56+51.70 294.13+92.04 246.51+68.065
(n=8) ЛПС 0.1 мкг/мл 190.87+54.43 305.76+49.50*** 300.95+76.95*** 279.41+62.40**
TNF-a. Без индуктора 253.72+52.60 286.79+61.43 277.46+67.08 290.90+62.32
пг/мл ФГА 2.5 мкг/мл 315.69+56.76 354.26+61.82 328.50+57.27 344.16+64.08
(n=8) ЛПС 0.1 мкг/мл 269.59+53.90 297.93+66.45 295.42+68.59 295.49+60.45
IL-6. Без индуктора 1115.41+30.54 1084.09+50.23 1101.83+56.55 1109.70+46.66
пг/мл ФГА 2.5 мкг/мл 1144.11+24.99 1156.29+32.12 1133.00+31.49 1119.24+39.01
(n=8) ЛПС 0.1 мкг/мл 1094.73+36.40 1082.85+28.72 1051.07+36.16 1115.41+33.88
IL-8. Без индуктора 1353.68+114.42 1340.28+104.42 1664.63+44.10 1313.30+156.25
пг/мл ФГА 2.5 мкг/мл 1443.08+86.30 1519.55+44.95 1578.30+58.88 1147.30+74.92
(n=4) ЛПС 0.1 мкг/мл 1699.20+68.25 1278.40+31.34** 1635.43+68.31 1364.28+59.85**
: - р < 0.05;
- р < 0.01;
- р < 0.001 к контролю.
В дальнейшем мы попытались оценить роль ГЬ-1Р, ГЬ-6 и продуктов циклооксигеназного цикла в Р-эндорфин-опосредованной регуляции пролиферативного ответа лимфоцитов в присутствии ФГА. Все обследованные здоровые доноры-добровольцы были разделены по индивидуальной чувствительности к р-эндорфину на две группы: у 1-й группы пептид стимулировал пролиферативный ответ, а у 2-й - угнетал его. Как видно из рисунка, А, в 1-й группе доноров на фоне моноклональных антител к ГЬ-1р наблюдалось резкое снижение пролиферативной активности, в то же время при внесении в культуры анти-ГЬ-1р-антител в присутствии р-эндорфина наблюдалось усиление пролиферативного ответа, статистически достоверно отличающееся от ответа культур с анти-ГЬ-1Р-антителами.
В то же время в условиях угнетения выраженности пролиферации р-эндорфином у 2-й группы доноров (рисунок, Б) на фоне анти-ГЬ-1р -антител интенсивность пролиферативного ответа в присутствии Р-эндорфина не изменялась.
При культивировании лейкоцитов в присутствии диклофенака натрия как стимулирующий, так и
угнетающий эффект Р-эндорфина на пролиферативный ответ нивелировался, что подтверждает возможное участии простагландинов, в частности простагландина Е2 (PGЕ2), в регуляции функциональной активности лимфоцитов под воздействием опиоидных пептидов (Ширшев, 2002).
Таким образом, Р-эндорфин оказывал стимулирующий эффект на уровень ГЬ-1 р. Оценка зависимости доза - эффект показала наиболее выраженное влияние Р-эндорфина на цитокиновую продукцию в концентрации 10-7М, аналогичное показанному нами ранее влиянию на пролиферативный ответ лимфоцитов (Гейн и др., 2006). Все эффекты Р-эндорфина проявлялись преимущественно в нефракционированных культурах, что указывает на необходимость кооперации различных клеточных популяций для реализации эффектов опиоид-ных пептидов. Другим немаловажным условием получения этих эффектов является активация клеток с рецепторного комплекса CD14/TLR4/MD2 (БщШагаа et а1., 2003), экспрессированного преимущественно на моноцитах. Известно, что активация клеток ведёт к увеличению плотности опи-
Роль IL-1ß и простагландинов в регуляции функциональной активности.
188
атных рецепторов (Sharp, 2006). Необходимо отметить, что рецепторный комплекс к ЛПС экспрессируется и на гранулоцитах, в частности ней-трофилах (Симбирцев, 2005), которые в настоящем эксперименте присутствовали в смешанной клеточной фракции. Отсутствие влияния р-эндорфина на продукцию цитокинов в культурах с
таточно для запуска экспрессии опиатных рецепторов. Ранее нами была показана необходимость присутствия моноцитов в клеточной культуре для реализации стимулирующего воздействия р-эндорфина на пролиферативный ответ (Гейн и др., 2006). Анализ роли Ш-1р в регуляции пролиферации показал, что Р-эндорфин частично нивелирует
контроль ß-эндорфин Р-эндорфин+анти-IL-1 ß анти-IL-lß ß-эндорфин+ДН ДН
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000
имп/мин
А
контроль Р-эндорфин Р-эндорфин+анти-^-1Р анти-^-ір Р-эндорфин+ДН ДН
0 5000 10000 15000 20000 25000
имп/мин
Б
Влияние Р-эндорфина на ФГА-индуцированный пролиферативный ответ лимфоцитов в присутствии анти-1Ь-1Р антител и на фоне блокады синтеза простагландинов дик-лофенаком натрия (ДН) у доноров 1-й (А, п=9) и 2-й (Б, п=11) групп. * - р<0.05 к контролю; а - р< 0.05 к анти-1Ь-1Р
*
*
*
* а
*
*
ФГ А может объясняться тем, что основной мишенью для ФГА являются в первую очередь лимфоциты, которые в процессе пролиферации продуцируют факторы (гамма-интерферон, интерлейкин-2), способные активировать моноциты. Известно, что сайты связывания для p-эндорфина, к которым в первую очередь относятся ц- и 5-опитные рецепторы, экспрессируются на лимфоцитах только в процессе активации и преимущественно субопти-мальными дозами ФГА или Кон А (Sharp, 2006). Таким образом, моноциты при такой схеме активируются опосредовано, этого может быть недос-
угнетающий эффект анти-IL-ip на пролиферативный ответ. Таким образом, можно говорить о наличии у пептида как опосредованного, так и прямого, независимого от IL-ip (Van den Bergh et al., 1994), ответа на функциональную активность лимфоидных клеток, в то же время направленность этого влияния может напрямую зависеть от функционального состояния моноцитов и факторов, ими синтезируемых.
Работа поддержана грантом программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и грантом РФФИ № 06-04-49001.
Список литературы
Гейн С.В., Баева Т.А., Гейн О.Н., Черешнев В.А. Роль моноцитов в реализации эффектов ß-эндорфина и селективных агонистов ц- и 5-опиатных рецепторов на пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови // Физиология человека. 2006. Т. 32, № 3. С. 111— 116.
Симбирцев А.С. Толл-белки: специфические рецепторы неспецифического иммунитета // Иммунология. 2005. № 6. С. 368-377.
Ширшев С.В. Механизмы иммуномодулирующего действия гормонов репродукции: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. М., 1996.
Ширшев С.В. Механизмы иммуноэндокринного контроля процессов репродукции. Екатеринбург, 2002.
Fujiharaa M., Muroib M., Tanamotob K. et al. Mole-
cular mechanisms of macrophage activation and deactivation by lipopolysaccharide: roles of the receptor complex // Pharmacology & Therapeutics. 2003. Vol. 100. P. 171-194.
Panerai A.E., Sacerdote P. Beta-endorphin in the immune system: A role at last // Immunol Today. 1997. Vol. 18. P. 317-319.
Plotnikoff N.P., Faith R.E., Murgo A.J. et al. Cytokines: stress and immunity. Boca Raton: FL. CRC Press, 1999.
Sharp B.M. Multiple opioid receptors on immune cells modulate intracellular signaling // Brain, Behavior, and Immunity. 2006. Vol. 20. Р. 9-14.
Van den Bergh, Dobber R., Ramlal S. et al. Role of opioid peptides in the regulation of cytokine production by murine CD4+ cells // Cell Immu-nol.1994. Vol. 154. P. 109-122.
Поступила в редакцию 02.06.2006
Role of il-1p. Il-6 and prostaglandines in regulation of functional activity of lymphocytes under opioid peptides
S.V. Gein, K.G. Gorshkova, O.N. Gein, S.P. Tendryakova
It was determined that in non-fractionated cell culture beta-endorphin promoted the IL-ip production and inhibited IL-8 in LPS presence while not influencing the TNF-a and IL-6 production. Slight stimulating effect in leukocyte culture was exerted by peptide to IL-ip spontaneous production. It is shown that beta-endorphin is able to render both mediated and direct effect on lymphoid cell functional activity.
