CC BY
63
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2010 Биология Вып. 1 (1)
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК 612-017.1.018
УЧАСТИЕ КАППА-ОПИАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В РЕГУЛЯЦИИ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ И СЕКРЕТОРНОЙ АКТИВНОСТИ МЫШИНЫХ СПЛЕНОЦИТОВ IN VIVO
С. В. Гейнa,b, Т. А. Баеваb, Е. Д. Маероваa, С. П. Тендряковаa,b
а Пермский государственный университет, 614090, Пермь, ул. Букирева, 15, e-mail: [email protected] b Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13, e-mail: [email protected]
Динорфин А оказывал модулирующее влияние in vivo на антителогенез в селезенке мышей, пролиферативную активность спленоцитов и секрецию ими IL-2 и IL-4. Направленность и выраженность обнаруженных эффектов зависела от вводимой дозы к-агониста, степени активации иммунокомпетентных клеток, а также характера действия активационного стимула.
Ключевые слова: каппа-опиатные рецепторы, динорфин А, иммуногенез, спленоциты, пролиферативная активность, цитокины IL-2 и IL-4
Введение
Стресс как типовой комплекс неспецифических защитно-приспособительных и патологических реакций организма на агенты, угрожающие жизни и благополучию организма, реализуется у высших животных и человека при обязательном участии нейроэндокринной системы, необходимым звеном которой являются эндогенные опиоидные пептиды. Актуальная проблема современной нейроиммунологии - регуляция опиоидными пептидами иммунологических реакций на уровне целостного организма и их роль в регуляции иммуногенеза при стрессе. В настоящее время выделяют три типа опиатных рецепторов, экспрессирующихся на клетках нервной и иммунной систем (5-, д-, к-), к каждому из которых в организме имеются свои высо-коафинные лиганды. Наиболее полно охарактеризованы эффекты и механизм действия эндорфинов и энкефалинов, обладающих высоким сродством к 5- и д-опиатным рецепторам, экспрессирующимся с высокой плотностью на зрелых, активированных клетках иммунной системы. Основной задачей к-рецепторов, по-видимому, является регуляция функциональной активности незрелых Т-клеток, так как максимальная их плотность зарегистрирована на мембранах тимоцитов, а в процессе созревания клеток уровень экспрессии к-рецепторов на поверхности Т-лимфоцитов значительно снижается (Ignatowski, Bidlack, 1999). В этой связи значительный интерес представляет анализ иммунорегуля-
торной активности сигналов, поступающих с к-опиатных рецепторов, экспрессированных на зрелых клетках иммунной системы. В современной литературе имеются немногочисленные данные об участии эндогенных (динорфины А и В) и экзогенных (U50,488H и U69,593) к-агонистов в модуляции пролиферации, продукции антител, поглотительной и секреторной активности клеток естественного и адаптивного иммунитета (Bidlack, 2000). Однако совершенно не освещены вопросы регуляции ди-норфинами продукции цитокинов, ответственных за процессы переключения доминирующего типа иммунного ответа с клеточно-опосредованного на гуморальный (IL-4) и наоборот (IFN-y, IL-2). Цель работы - изучение эффектов эндогенного высоко-афинного к-агониста динорфина А (1-17) в системе in vivo на пролиферативную активность спленоци-тов мыши и секрецию ими цитокинов IL-2 и IL-4, играющих важную роль в регуляции развития иммунного ответа по гуморальному или клеточноопосредованному типу.
Материалы и методы
Эксперимент выполнен на беспородных мы-шах-самцах массой 17-22 г. Динорфин А (1-17) (Sigma, США) вводили внутрибрюшинно в разовой дозе 100, 1, 0.01, 0.0001 мкг/кг массы тела; контрольным животным вводилось эквиобъемное количество 0.9% NaCl. В дальнейшем экспериментальные животные были поделены на две группы. Первую группу мышей через 1 ч после введения
© С. В. Гейн, Т. А. Баева, Е. Д. Маерова, С. П. Тендрякова, 2010
73
пептида иммунизировали внутрибрюшинно эритроцитами барана (ЭБ) в разовой дозе 108 кл/0.2 мл
0.9% NaCl. На 5-е сут животных декапитировали под эфирным наркозом, определяли титр анти-эритроцитарных антител в плазме периферической крови методом прямой гемагглютинации и количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке методом локального гемолиза в геле агарозы. Вторую группу экспериментальных животных через 1 ч после введения пептида выводили из эксперимента, выделяли спленоциты и культивировали их в пластиковых круглодонных 96-луночных планшетах ("Медполимер", Санкт-Петербург) в течение 72 ч. Каждая культура содержала 5^105 кл/0.2 мл полной культуральной среды, которую готовили ex tempore на основе среды RPMI 1640 («Биолот», Санкт-Петербург) с добавлением 10 mM HEPES (Sigma), 2 mM L-глутамина (Sigma), 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 10% ЭТС («Биолот», Санкт-Петербург). В качестве митогенов использовали липополисахарид (ЛПС из E. coli В55:О5, Sigma; 10 мкг/мл) и конконовалин А (КонА, Sigma; 20 мкг/мл). За 18 ч до окончания культивирования в лунки вносили по 2 мкКи 3H-метилтимидина в объеме 10 мкл. Радиоактивность проб определяли на жидкостном сцинтилляцион-ном счетчике "Guardian" (Wallac, Финляндия).
Для оценки секреторной активности спленоци-тов супернатанты 24-часовых (IL-2) и 48-часовых (IL-4) культур собирали в пробирки Эппендорфа, замораживали и хранили при -20оС. Количественное определение цитокинов проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью наборов Bender Medsystems (Австрия) по методике, предложенной производителем.
Статистический анализ проводили с использованием непарного двухфакторного дисперсионного анализа и LSD-критерия Фишера (post-hoc). Все данные на рисунках представлены в виде средней величины и её стандартной ошибки (M±m).
Результаты и их обсуждение
Установлено (рис. 1А), что динорфин А (1-17) оказывает статистически значимый стимулирующий эффект на количество АОК в селезенке экспериментальных животных только при введении самой низкой (0.0001 мкг/кг) исследуемой дозы. При этом анализ титра антиэритроцитарных антител в плазме крови не выявил значимых количественных изменений в опытных группах по сравнению с контрольными животными (рис. 1Б). При анализе пролиферативной активности спленоцитов под воздействием динорфина зарегистрирован угнетающий эффект пептида, используемого в дозах
1, 0.01 и 0.0001 мкг/кг, на пролиферацию сплено-цитов, индуцированную ЛПС (рис. 2А), который является активатором В-лимфоцитарного звена иммунитета. Стимуляция клеток КонА - поликлональным активатором Т-лимфоцитов, а также оценка влияния динорфина на спонтанный пролиферативный ответ спленоцитов не выявили статистически значимых эффектов пептида (рис. 2А). Неоднозначные результаты получены в отношении продукции IL-2 - цитокина, необходимого, с одной стороны, для поддержания пролиферативных процессов, а с другой стороны - для развития ТЫ-хелперов, протектирующих клеточно-
опосредованный тип иммунного ответа. Так, в группе животных, которым вводился динорфин в дозе 1 мкг/мл, продукция IL-2 спленоцитами снижалась в присутствии КонА, но стимулировалась в спонтанных и ЛПС-индуцированных культурах (рис. 2Б). Кроме того, у мышей, предобработанных динорфином А в дозе 0.01 мкг/кг, в условиях дополнительной стимуляции клеток ЛПС, статистически значимо усиливалась продукция IL-4, ответственного за пролиферацию и дифференцировку В-клеток - одного из ключевых звеньев гуморального иммунного ответа (рис. 2В).
Таким образом, динорфин А в системе in vivo оказывал модулирующее влияние на антителоге-нез в селезенке, пролиферативную активность спленоцитов и секрецию ими IL-2 и IL-4. Направленность и выраженность наблюдаемых эффектов
(А)
мкг/кг
(Б) 10,8
10,4
4
н 10 -
! « я а
5 9,2 н
8,8 -
©
8,4
0,0001
0,01
мкг/кг
100
Рис. 1. Влияние динорфина А на количество АОК в селезенке (А; п=12) и титр антител к ЭБ (Б; п=12) в плазме крови мышей. Здесь и далее: *р<0.05 по непарному LSD-критерию Фишера
8
К
1
Участие каппа-опиатных рецепторов в регуляции активности
75
(А)
Без митогена
Лпс 10 мкг/мл
Кон А 20 мкг/мл
20000
15000
10000
5000
0
VN 4 V#N 4
мкг/кг
(Б)
Г
20
15
10
5
0
Без митогена
(В)
Без митогена
Лпс 10 мкг/мл
Кон А 20 мкг/мл
500
* Т .+ 400
- 300
- 200 f 100
0
Vs ^ 4 ^
мкг/кг
Лпс 10 мкг/мл
Кон А 20 мкг/мл
............................*.....................
..................... 50
мкг/кг
0
Рис. 2. Влияние динорфина А на пролиферативную активность спленоцитов мыши (А; n=12), продукцию ими IL-2 (Б; n=6) и IL-4 (B; n=6)
зависела от вводимой дозы к-агониста, степени активации иммунокомпетентных клеток, а также характера действия активационного стимула.
В современной литературе представлены весьма ограниченные сведения, иллюстрирующие эффекты динорфинов, а также других лигандов к-опиатных рецепторов природного или синтетического происхождения на функциональную активность В-лимфоцитов в системах in vitro и in vivo. В то же время, имеющиеся данные однозначно указывают на тоническое угнетение процессов анти-телообразования при эндогенной и экзогенной активации к-опиатных рецепторов. Так, показано (Vassou et al., 200S), что экзогенный лиганд к-опиатных рецепторов а^-казоморфин в высокой (10-6М) концентрации снижал секрецию Ig M, G, A в культурах СD 19+ B-лимфоцитов. Эксперименты, выполненные на мышах, нокаутированных по гену к-опиатного рецептора, показали, что после
иммунизации животных гемоцианином улитки продукция антиген-специфичных иммуноглобулинов значительно повышалась, в то время как мыши, у которых отсутствовал ген д- или 5-опиатных рецепторов, демонстрировали нормальные уровни продукции антител (Gavёriaux-Ruff et а1., 2003). Несоответствие литературных данных и выявленных нами эффектов динорфина А на антителогенез связано, главным образом с выбором экспериментальной модели. В частности, использование чистой популяции СБ 19+ лимфоцитов необходимо для изучения прямых эффектов к-агонистов на функции В-клеток, но не отображает истиной картины, развертывающейся в организме, так как огромную роль при формировании конечных интегральных эффектов играют процессы межклеточной кооперации и нейроэндокринной регуляции. В организме генетически-модифицированных животных большое значение приобретает развитие компенсаторных механизмов на месте выключен-
ного звена, поэтому не совсем корректно предполагать, что в нормальном здоровом организме физиологические процессы будут протекать аналогичным образом.
В научных базах практически отсутствуют данные о роли к-опиатных рецепторов и их лигандов в регуляции in vivo пролиферативной активности лимфоцитов и продукции Th1/Th2-ноляризyющих цитокинов. В то же время, аналогичные эффекты к-агонистов в системах in vitro в присутствии динор-финов, согласно литературным данным, могут сильно варьировать в зависимости от видовой принадлежности, состава выбранного объекта исследования, временного фактора. Ранее нами было выявлено разнонаправленное влияние динорфина А (113) на пролиферацию лимфоцитов в очищенной лимфоцитарной фракции и смешанной лейкоцитарной взвеси (Гейн и др., 2009). Показано (Ni et al., 1999) стимулирующее влияние динорфина А на пролиферативный ответ спленоцитов мыши и продукцию ими IL-2 и IL-1Р. В работе Barreca et al. (19S7) установлено, что стимулирующий эффект динорфина А на пролиферацию мононуклеаров зависит от срока внесения пептида в культуру. С другой стороны, имеются данные (Gorodinsky et al., 1994) об угнетающем эффекте динорфина В на пролиферацию клеток головного мозга эмбрионов крыс; данный эффект блокировался nor-BNI. Таким образом, наличие большого количества факторов, определяющих конечный эффект динорфинов, требует более масштабных и детальных исследований в системах in vivo.
Работа поддержана грантами Президента РФ «Ведущие научные школы» НШ-64403.2010.4 и программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».
Библиографический список
Гейн, С.В. Эффект динорфина А (1-13) на пролиферативный ответ лимфоцитов и изменение ТЬ1/ТЬ2 цитокинового профиля / С.В. Гейн, А.А. Сятчихин, С.П. Тендрякова // Докл. Академии наук. 2009. Т. 424, № 4. С. 563-566.
Barreca, T. Effects of dynorphin on the pha-induced lymphocyte proliferation in vitro / T. Barreca, G. Di Benedetto, G. Corsini [et al.] // Immunophar-macol. Immunotoxicol. 1987. Vol. 9. P. 467-475.
Bidlack, J.M. Detection and function of opioid receptors on cells from the immune system // Clin. Di-agn. Lab. Immunol. 2000. Vol. 7. P. 719-723.
Gaveriaux-Ruff, C. Enhanced humoral response in kappa-opioid receptor knockout mice / C. Gaveriaux-Ruff, F. Simonin, D. Filliol, B.L. Kief-fer // J. Neuroimmunol. 2003. Vol.134. P. 72-81.
Gorodinsky, A. Dynorphin B inhibits thymidine incorporation into DNA in fetal rat and guinea pig brain cell aggregates / A. Gorodinsky, J. Barg, M.M. Belcheva [et al.] // Reg. Peptides. 1994. Vol. 54. P. 109-110.
Ignatowski, T.A. Differential к-opioid receptor expression on mouse lymphocytes at varying stages of maturation and on mouse macrophages after selective elicitation / T.A. Ignatowski, J.M. Bidlack // J. Pharmacol. Exp. Therapy. 1999. Vol. 290. P. 863-870.
Ni, X. Dynorphin A enhances mitogen-induced proliferative response and interleukin 2 production of rat splenocytes / X. Ni, B.C. Lin, C.Y. Song, C.H. Wang // Neuropeptides. 1999. Vol. 33. P. 137-143.
Vassou, D. Opioids modulate constitutive B-lympho-cyte secretion / D. Vassou, E. Bakogeorgou, M. Kampa [et al.] // Int. Immunopharmacol. 2008. Vol. 8. P. 634-644.
Поступила в редакцию 25.03.2010
The role of kappa-opiate receptors in the in vivo regulation of proliferative and secretory activities of mouse splenocytes
S. V. Gein, doctor of biology, professor
Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990; [email protected]; (342)2396489
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences, 614081,
Perm, Golev str, 13; [email protected]
T. A. Baeva, candidate of biology, research scientist
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences, 614081,
Perm, Golev str, 13; [email protected] E. D. Maerova, student
Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990; [email protected]
S. P. Tendryakova, candidate of chemistry, associate professor Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990; [email protected]
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences, 614081,
Perm, Golev str, 13; [email protected]
Dynorphin A demonstrated an in vivo modulating effect on the antibody-formation in mouse spleens, spleno-cyte proliferative activity and IL-2, IL-4 secretion. Targeting and intensity of dynorphin s effects depended on the doses used, degree of immune cell activation and the nature of activating stimulus.
Key words: kappa-opiate receptors; dynorphin A; immunogenesis; splenocytes; proliferative activity; cytokines IL-2 and IL-4.
Гейн Сергей Владимирович, доктор биологических наук, профессор ГОУВПО «Пермский государственный университет»
ГУ РАН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН»
Баева Татьяна Александровна, кандидат биологических наук, научный сотрудник ГУ РАН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН»
Маерова Евгения Давидовна, студент
ГОУВПО «Пермский государственный университет»
Тендрякова Светлана Петровна, кандидат биологических наук, старший преподаватель ГОУВПО «Пермский государственный университет»
ГУ РАН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН»
