CC BY
119
биотехнологии
роль ферментов в оптимизации питательной ценности кормов: некоторые ориентиры и перспективы
Ферментные добавки к кормам для животных оказали огромное влияние на животноводческую отрасль. Они не только улучшили утилизацию кормов, содержащих ячмень, пшеницу, рожь и овес, особенно птицей, но и позитивно воздействовали на окружающую среду, уменьшив выделение таких загрязнителей, как фосфор и соединения азота.
Анатолий Лобанок,
завлабораторией ферментов Института микробиологии НАН Беларуси, академик
Ферменты - это белковые катализаторы, которые присутствуют во всех живых клетках и осуществляют или регулируют множество химических реакций. В зависимости от типа они могут разрушать специфические связи сложного субстрата (по названию которого, как правило, и именуются), высвобождая его молекулы. Все ферменты построены из одной или многих цепочек аминокислот, имеющих трехмерную структуру, и проявляют свою активность при оптимальных значениях температуры и кислотности среды: одни работают в желудке в кислой среде, другие - в тонком кишечнике в нейтральной среде. Повышенные температуры вызывают нарушение структуры белков и потерю их ферментативной функции. Поэтому в зависимости от температурной стабильности специфические коммерческие ферменты могут добавляться до или после обработки корма.
получение кормовых ферментов
Кормовые ферменты производят главным образом на основе микробного синтеза. Полученные из различных источников, они,
хотя и действуют на один субстрат, могут отличаться по своим физическим свойствам и эффективности. Начиная с конца 1980-х и до середины 1990-х гг. ферментные препараты и их производство были значительно усовершенствованы, и их стали получать целенаправленно в огромных количествах. Одновременно повысилась их надежность, в частности термостабильность и активность по отношению к антипитательным веществам корма. Большую роль в развитии этого направления сыграли исследования химии некрахмалистых полисахаридов. Кормовые ферменты сделали возможным использование новых видов кормов и энергии. Позднее возник интерес к ферментным препаратам для рубцовых животных и аквакультуры. Более эффективное потребление пищевых веществ кормов означает уменьшение их потерь с фекалиями и, соответственно, снижает загрязнение окружающей среды. Кроме того, кормовые ферменты рассматривают также как экологически разумную альтернативу применению гормонов (в частности, гормона роста) и антибиотиков.
Большинство углеводов, содержащихся в кормах, можно разделить на две группы в зависимости от способности животного переваривать их - крахмал и некрахмалистые полисахариды, которые плохо усваиваются в процессе пищеварения. Последние включают целлюлозу, гемицел-люлозу, камедь, бета-глюканы, пектины и другие соединения, которые ассоциированы с растительной клеточной стенкой и
выполняют структурные функции. Некрахмалистые полисахариды, кроме того, могут препятствовать перевариванию усвояемых углеводов, блокируя доступ к ним пищеварительных ферментов. Из всех имеющихся коммерческих кормовых ферментов только карбогидразы позволяют реально увеличить использование энергетического потенциала корма. Это достигается путем снижения вязкости среды, создаваемой некрахмалистыми полисахаридами, за счет чего в целом увеличивается переваримость питательных компонентов.
эффекты!, вызываемые кормовыми ферментами
С одной стороны, кормовые ферменты улучшают доступ к пищевым веществам, находящимся внутри клетки или связанным с ней, расщепляя большие макромолекулы клеточной стенки; в комбинации с эндогенными ферментами, секретируемыми животным организмом, расщепляют полимерные компоненты клетки до усваиваемых животными размеров. Поэтому необходимо использовать препараты, комплементарные по отношению к эндогенным ферментам, продуцируемым животными.
С другой стороны, кормовые ферменты должны препятствовать увеличению вязкости пищеварительной среды, что может нарушать всасывание питательных компонентов. Если рацион содержит много образующих гели некрахмалистых полисахаридов, низкий уровень вязкости среды может поддерживаться с помощью ферментов, которые в основном укорачивают длину полисахаридной цепочки и в меньшей степени действуют на боковые ответвления.
Таким образом, чтобы кормовые ферментные препараты были эффективны, они должны обладать способностью расщеплять целый ряд соединений. Так, иногда достаточно одной бета-1-3-глюканазы для
i в мире науки |
разрушения стенки эндосперма, но обычно требуются еще целлюлазы и гемицеллю-лазы для более полного высвобождения белков. Следовательно, мультиэнзимные препараты более предпочтительны, чем моноэнзимные. Не все моносахара хорошо усваиваются различными видами животных или всеми частями их желудочно-кишечного тракта. Например, ксилоза хорошо усваивается свиньями и птицей, в отличие от ара-бинозы, которая переваривается плохо, а у свиней - только в определенных отделах кишечника. Поэтому кормовые ферментные препараты не должны содержать гликози-даз, кроме тех, которые необходимы для оптимальной утилизации энергии пентоз-ных сахаров. Взаимодействие между эндогенными животными ферментами и добавленными экзогенными весьма сложное. Так, в случае рисовой диеты добавление в корм гемицеллюлаз оказывает отрицательный эффект на кислотность, вязкость и переваримость корма у поросят.
Фитаза способствует высвобождению фосфора, связанного в растениях и обычно недоступного для усвоения животными. Она может также мобилизовать другие минералы и белки, связанные в фитатном комплексе. Введение ее в корма снижает потребность в добавлении неорганического фосфора и его потерю с экскрементами. Липазы улучшают переваримость жиров и усвоение энергии молодыми животными. Экзогенные протеазы также увеличивают усвоение белков корма.
улучшение и расширение диапазона применения кормовых ферментов
Добавление ферментов к кормам с использованием злаков увеличивает их метаболический потенциал, уменьшает размеры желудочно-кишечного тракта, воздействует на микробную ферментацию, что может влиять на усвоение питательных компонентов и в итоге улучшает здоровье животного. Появление на рынке рекомбинантных ферментов должно ускорить адаптацию новых микробных ферментов кормопроизводством. Несмотря на то что их высокая эффективность была уже показана, реализация их потенциала в животноводстве находится в начальной стадии. Для этого предстоит решение ряда вопросов и проведение дальнейших исследований: требуется улучшение качества и эффективности ферментных препаратов, уже имеющихся на рынке, с точки зрения их стоимости, тер-
мостабильности, устойчивости к перевариванию и повышенной активности в целевых отделах ЖКТ; расширение диапазона использования ферментов в рационах птицы и домашних животных; увеличение доступности липазы, протеазы, амилазы и других катализаторов произведенными методами промышленной биотехнологии; получение и конструирование рекомбинантных ферментов из различных источников с учетом определенных субстратов и животных, включая микроорганизмы, растительные и животные ткани; расширение числа кормов, пригодных для обработки ферментами; усовершенствование и стандартизация определения продуктов, образующихся под действием различных ферментов; дальнейшее исследование механизмов, лежащих в основе эффективности ферментов, и создание моделей предсказывающих результат их применения у разных классов животных и с различными рационами; акцентировать положительное влияние ферментов на снижение загрязнения окружающей среды и изменение эндокринного статуса здорового животного.
усовершенствование методов оценки активности ферментов
В настоящее время отсутствуют стандартные методы оценки качества коммерческих ферментных препаратов, удовлетворительный мониторинг количества фермента, присутствующего в рационе. Частично проблема обусловлена тем, что при интерпретации экспериментов с кормовыми ферментами уровень активности последних обычно не указывается, а если и указывается, то единицы и методики ее измерения варьируют от одного препарата к другому и часто отличаются друг от друга. Кроме того, активность ферментов, добавленных к рациону в низких концентрациях и частично плотно связанных с кормом, труднее замерить. Точные результаты можно получить после экстракции фермента, при использовании стандартного метода определения активности по истечении продленного времени инкубации.
Некоторые наиболее широко распространенные методы включают измерение сахаров, использование окрашенных субстратов, иммунологический подход и изменение вязкости субстрата под действием фермента. Полагают, что среди прочих методов высвобождение красителя, связанного на субстрате, является наиболее
простым и чувствительным из них, но все же недостаточным для обнаружения ферментов в рационах. Делать это можно с помощью иммунологического метода, однако отрицательным моментом является отсутствие антисывороток для всех ферментов и слабая реакция в случае инактивированных катализаторов. Измерение образовавшихся редуцирующих сахаров под действием фермента не позволяет получить достаточно точных результатов из-за высокого базового уровня редуцирующих сахаров в субстрате относительно образовавшихся сахаров. Об удобных методах определения активности ферментов по изменению вязкости субстрата информации пока нет. Существует мнение, что единственным практичным способом является все же экстракция ферментов с последующим применением красителя. Полагают, что этот метод следует модифицировать за счет продления времени инкубации, для того чтобы смогла проявиться низкая активность фермента в рационах. Хотя вышеупомянутые способы недостаточно эффективны, они могут быть использованы для оценки коммерческих препаратов до их добавления к рационам. Невозможно, однако, оценить различные ферментные препараты на основе заявленной активности, так как каждый из упомянутых методов может показать различные активности для одной и той же добавки. Кроме того, для каждого конкретного метода полученные значения активности могут сильно отличаться в зависимости от чистоты субстрата, различий в использовании метода. Все это ясно указывает на необходимость стандартизации метода определения активности фермента - простого, точного и воспроизводимого в каждой лаборатории. Важно также, чтобы была связь между значениями активности фермента, полученными для кормов, и эффектом in vivo.
Стандартизация методов оценки активности ферментов для кормопроизводства позволит:
• изготовителю и потребителю ферментных препаратов сравнивать их на основе значений активности;
• производителю животноводческой продукции определять количество активного ферментного продукта, добавленного в рацион, или их число, сохранившееся в неблагоприятных условиях окружающей среды, включая термическую обработку;
биотехнологии
• оценить ферментативную активность в различных отделах ЖКТ, особенно в отделах, где ферменты наиболее эффективны.
Следует иметь в виду физиологические эффекты ферментов. Они могут быть значительно повышены, если использовать дешевую, быструю и точную технику определения антипитательных факторов в кормах. Справочные значения содержания некрахмалистых полисахаридов или фитата в рационах могут также значительно отличаться от фактического. В основном здесь могут иметь место сезонные колебания.
сайты действия ферментов
Фундаментальная информация об отделах ЖКТ, на которые ферменты оказывают наибольший эффект, отсутствует. Неизвестно, например, является ли главным местом их действия у птицы ЖКТ в целом или отдельные его участки. Эта информация особенно необходима для отбора и использования ферментов, соответствующих целевым субстратам в условиях, которые создаются в тех местах, где они наиболее результативны. Препараты ферментов, отобранные для птицы, могут сильно отличаться, если их главным сайтом действия является зоб, а не нижние отделы желудочно-кишечного тракта, особенно с учетом их устойчивости к протеолизу и низким значениям рН, а также оптимальным значениям рН. Кроме того, оптимальные свойства ферментов могут отличаться у разных видов животных: отобранные по эффективности у птицы, они могут быть неэффективны у свиней из-за различной чувствительности к инактивации в кислой среде.
получение новый форм ферментов
Нынешнее поколение ферментов показало себя весьма эффективным, но их полезность, без сомнения, возрастет, когда станут доступны их новые формы, прежде всего из альтернативных источников. Так, например, ожидается, что ферменты, продуцируемые микроорганизмами в рубце животных, или ферменты термофильных микроорганизмов, будут обладать более высокой удельной активностью в условиях их применения, высокой устойчивостью к инактивации под действием температуры, низкой кислотности и протеолитических ферментов, дешевых в производстве и стабильных при длительном хранении. Они могут быть получены с использованием рекомбинантных
микроорганизмов. Это включает клонирование и выделение специфической комплементарной ДНК, кодирующей интересующий нас специфический фермент, и перенос этой ДНК в микроорганизмы-продуценты, которые можно выращивать в больших объемах с малыми затратами. Рекомбинантная ДНК-технология в сочетании с направленным мутагенезом позволит получить ферменты с точно заданными свойствами и учетом специфических особенностей животных, для которых они предназначены.
Новым направлением является создание «скроенных под заказ» ферментов на основе антител с каталитической активностью и использование микроорганизмов типа Escherichia coli в качестве систем их экспрессии. Эти биотехнологии создают основу производства в ферментерах специфических биоинженерных антител, которые будут иметь энзимоподобные свойства и соответствовать особенностям каждого рациона и класса животных. Кроме того, эти антитела могут связываться со специфическими протеазами для концентрации фермента на целевом субстрате.
альтернативные формы ферментов
Ферменты могут быть получены не только в процессе ферментации с помощью грибов, улучшенных традиционными методами, но и экспрессированы в микроорганизмах, таких как бактерии, и в растениях. Так, например, доступность большого количества ферментов в семенах канолы может резко снизить их стоимость. Продукция фитазы у канолы или ксиланазы у риса позволит получить более ценные корма.
Альтернативой стратегии гидролиза антипитательных веществ в кормах для животных представляется создание моно-гастричных животных, способных переваривать целлюлозу, глюканы, ксиланы или фитиновую кислоту. Сообщают о возможности использования бактериальной ДНК для создания конструкций экспрессирую-щих и секретирующих гликаназы в клетках поджелудочной железы крыс. Большой проблемой будет получение достаточно высокого уровня экспрессии гена глюкана-зы и других генов в клетках поджелудочной железы для достаточного расщепления в кишечнике глюканов, ксиланов и т.д. Особый интерес представляет введение в домашних животных гена фитазы.
роль синергического взаимодействия ферментов
Почти все исследования ответа птицы на кормовые ферменты, за исключением фита-зы, были проведены с неочищенными грибными экстрактами с высокой активностью глюканазы или ксиланазы, а также включающих значительное количество других ферментов, в том числе протеазу. Следует провести изучение различных комбинаций чистых ферментов (чтобы избежать синер-гической ферментной активности) для выявления синергического, антагонистического или аддитивного эффекта основных ферментов. Например, их способность снижать вязкость водорастворимого арабиноксилана пшеницы или ржи может не только зависеть от количества эндоксиланазы в препарате, но также и от арабинофуранозидазы и, возможно, бета-глюканазы, ацетилксилан-эстеразы и ферулоил-эстеразы. Вероятно, что препараты с высокой протеазной активностью могут оказывать отрицательное действие, так как будут усиливать переваривание протеина, включая добавленные ферменты. Доступность в будущем клонированных ферментов, не содержащих примесей других белковых катализаторов, позволит исследователям оценить преимущества использования различных ферментных коктейлей для улучшения питательной ценности злаковых. Такие изыскания приобретут большую значимость со сдвигом внимания от применения неочищенных грибных ферментов в сторону произведенных с помощью ДНК-технологий.
природа взаимодействия ферментов с компонентами кормов
Присутствие насыщенных (сало)жиров по сравнению с ненасыщенными (соевое масло) в рационах, содержащих высокий уровень водорастворимых некрахмалистых полисахаридов, может существенно подавить развитие цыплят. Так, например, было показано, что ускоренный рост цыплят и переваримость жира в результате добавления фермента к соевой диете, хотя и значительный, был полностью превзойден огромным эффектом, полученным от диеты, базирующейся на насыщенном жире. Эти и другие наблюдения доказывают, что результативность добавления ферментов к диете зависит не только от вязкости водорастворимых некрахмалистых полисахаридов, но и от других ингредиентов, таких как насыщенный жир. В дальнейшем представляется
1 в мире науки 1
необходимым установить природу этих взаимодействий, что позволит получить фундаментальную информацию о способе действия ферментов и оптимизации рациона при различных условиях питания, что имеет большое экономическое значение.
моделирование применения
Недавние исследования показали, что можно предсказать ответ птицы на определенный кормовой фермент, используя простую линейную модель, а также - ответ на добавление фермента к диетам, которые содержат любое данное его количество и двух злаков в любом соотношении. Эта модель создает основу для оценки экономической эффективности добавления ферментов к рациону.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФЕРМЕНТОВ У ДРУГИХ ВИДОВ ЖИВОТНЫХ
Весьма небольшое количество животных было изучено с точки зрения их реакции на те или иные кормовые ферменты. Хотя исследования, проведенные на цыплятах, совершенно ясно показали эффективность данных добавок, количество работ, выполненных на других видах птицы, таких как индейки, утки, гуси и т.д., недостаточное. Несколько исследований проведено на рыбах, например угре, аллигаторах и других экзотических животных, на некоторых домашних животных - котах и собаках, пушных и других зверях, имеющих простой желудок. Применение ферментов показало особую эффективность у животных с тенденцией к плотоядности: у них меньший кишечник и, соответственно, меньше представлена популяция анаэробных микроорганизмов, способных расщеплять сложные углеводы. Необходимы также исследования эффективности применения ферментов у свиней различного возраста, особенно при скармливании им жиров. Наконец, использование в качестве добавки к рациону микроорганизмов со сверхэкспрессией рекомбинантных целлюлаз и гемицел-люлаз может улучшить результат применения кормов у рубцовых животных. Полагают также, что имеется еще много ферментов, помимо используемых, которые также могут быть применены в животноводстве.
СУБСТРАТЫ-МИШЕНИ ДЛЯ ФЕРМЕНТОВ У ЗЛАКОВЫ1Х
Многие исследователи считают, что основной способ действия большинства кормовых ферментов - это разрушение образующих
гель полисахаридов, выделяющихся из клеточной стенки злаковых в количествах, подавляющих усвоение. Альтернативное объяснение предполагает, что бета-глюканы и арабиноглюканы, которые образуют стенку эндосперма злаковых, ограничивают доступ ферментов к питательным веществам, высвобождение которых путем разрушения клеточной стенки - главный фактор, ответственный за улучшение питательной ценности корма в результате действия экзогенных ферментов. Высказывается мнение, что даже один фермент может быть результативным, если его благоприятный эффект связан исключительно со снижением вязкости. Дело в том, что, так как вязкость частично обусловлена длиной цепи полимера, достаточно только разрушить цепь в нескольких местах, чтобы существенно уменьшить гельобразующую способность полисахаридов. Однако если разрушение клеточной стенки и высвобождение заключенных в клетке питательных компонентов дает больший эффект, чем можно объяснить уменьшением вязкости, то может потребоваться больше ферментов. Необходимо установить, какой из двух эффектов наиболее важен, так как это существенным образом влияет на экономику использования ферментов. Применение различных комбинаций очищенных ферментов позволит выяснить, отвечает ли вязкость рациона или удержание питательных веществ клеточной стенкой за антипитательный эффект некрахмальных полисахаридов.
высвобождение сахаров из ГЕмиЦЕЛЛЮЛоЗ
Большинство исследований применения ферментов в кормлении животных было направлено на уменьшение вязкости бета-глюканов или арабиноксиланов у злаковых и высвобождение крахмала из гемицел-люлозного матрикса. Частичный гидролиз гемицеллюлоз уменьшит вязкость различных углеводов и произведет желаемый эффект. Дальнейшие исследования должны быть направлены на решение проблемы полного переваривания гемицеллюлозы. Глюкоза из целлюлозы и галактоза из галактозидов хорошо усваиваются всеми животными, тогда как пентозы усваиваются плохо, особенно птицей. Поэтому изыскания по полному гидролизу гемицеллюлозной фракции злаков и соломы, а также усвоению пентоз будут иметь большое экономическое значение, так как создадут базу использования продуктов,
которые имеются в больших количествах, но в рацион моногастричных животных в основном не входят.
физиологические и эндокринные эффекты ферментов
Примечательно, что до сих пор еще не изучено влияние вязких водорастворимых некрахмальных полисахаридов на панкреатическую и другие кишечные секреции, включая ферменты и желчные соли, на иммунные реакции, уровень гормонов, в том числе гормон роста, на тироидин и инсулин, на толерантность к глюкозе и способность экзогенных ферментов противодействовать этим эффектам. Включение вязких водорастворимых некрахмалистых полисахаридов в рацион в присутствии и в отсутствие ферментов позволит интерпретировать эффекты вязких полисахаридов на физиологические реакции животных. Эти данные имеют практическую ценность и могут быть экстраполированы на человека, так как способность грубых пищевых продуктов изменять усвоение пищевых веществ вызывает большой интерес.
завтра кормовых ферментов
Будущее кормовых ферментов связано с развитием техники и усовершенствованием методов измерения их активности и содержания антипитательных веществ, что, несомненно, повысит роль этих добавок в кормлении животных. Предстоит также уточнить наиболее важные для животноводства каталитические свойства препаратов, их влияние на физиологические и эндокринные реакции организма, природу взаимодействия с другими компонентами рациона, роль про-теаз в разрушении антипитательных веществ у бобовых, таких как ингибиторы трипсина, лектины и т.д., организовать производство и применение ферментов для рубцовых животных и различных аквакультур. Развитие ферментных ДНК-технологий будет происходить во взаимодействии с углубленным изучением характеристик структуры субстратов, микрофлоры желудочно-кишечного тракта и иммунной системы животных.
Учитывая важность рассматриваемой проблемы, в Институте микробиологии НАН Беларуси была аккредитована соответствующая испытательная лаборатория, которая будет содействовать обеспечению отечественных потребителей ферментов качественными препаратами для кормопроизводства, птицеводства и животноводства.
