CC BY
68
УДК 621.039.75
Д.Г. Титова*, А.Г. Буланов, О.М. Филатова, Е.Н. Дмитриева, О.Б. Горюнова, Н. С. Марквичев, А. А. Белов
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20 корп. 1 * e-mail: [email protected]
РОЛЬ ЭКССУДАТОВ КОРНЕВОЙ СИСТЕМЫ ОГУРЦА В ФОРМИРОВАНИИ МИКРОБНОГО ЦЕНОЗА ПРИ ВЫРАЩИВАНИИ ПО МАЛООБЪЕМНОЙ ТЕХНОЛОГИИ.
В проведенном исследовании был изучен процесс метаболизма экссудатов огурца сорта Гавриш F1 Атлет различными микроорганизмами- фитопатогенный гриб Fusarium oxysporum и его антагонистами. Была определена исходная концентрация органических веществ в экссудатах методом титриметрического определения ХПК, скорость метаболизма экссудатов микроорганизмами и остаточная концентрация органических веществ в в экссудатах.
Ключевые слова ризосфера, экссудаты огурца, Fusarium oxysporum, скорость метаболизма экссудатов.
Корневые выделения - экссудаты -характерны растениям на протяжении всего периода их развития. Под экссудатами, как правило, понимают органические и неорганические соединения, выделяемые корневой системой в окружающую среду. Роль экссудатов в физиологических процессах, протекающих в растениях, различна. Различны и механизмы их образования. Состав экссудатов зависит от вида растения, фазы его развития, условий выращивания. Известно, что корневые выделения огурца, в основном, содержат такие органические соединения, как глюкоза, фруктоза, олиго и полисахариды, кислоты основных метаболических путей - лимонная, янтарная, щавелевоуксусная и др., а также аминокислоты и пептиды.[3]. Кроме того могут присутствовать и другие органические соединения и их соли.
Концентрация экссудатов в корневой и прикорневой зонах растения обусловлена двумя одновременными процессами -выделением экссудатов и их убылью. Убыль экссудатов из прикорневой зоны - процесс достаточно многообразный, особенно при выращивании растений в системе гидропоники. Можно выделить следующие составные части данного процесса : 1) вымывание экссудатов с поливной водой; 2) испарение экссудатов ; 3) связывание экссудатов в малорастворимые солевые соединения; 4) метаболизм экссудатов микробным сообществом в ризосфере растения.
Изучение выделения экссудатов растением в идеальных условиях крайне затруднительно , т.к. тяжело обеспечить стерильный рост растения, особенно отсутствие микроорганизмов в корневой зоне. Но именно экссудаты каждого конкретного растения и являются основным фактором, определяющим формирование микробного ценоза в его ризосфере. Особенно это актуально для систем выращивания растений на минераловатном
субстрате, когда исходный субстрат до момента посадки в него растения практически не содержит никакой микрофлоры, и у специалистов появляется уникальная возможность
формирования управляемого микробного ценоза с учетом особенностей развития тех или иных микроорганизмов на конкретных экссудатах, образующихся в данной системе.
Задачей данного этапа исследований являлось изучение метаболизма экссудатов огурца разными группами микроорганизмов, как входящих в состав биологических препаратов для защиты растений, так и обладающих фитопатогенными свойствами.
Материалы и методы
1 . Получение экссудатов.
Для получения экссудатов использовали семена огурца сорта Гавриш F1 Атлет. Семена выращивали в стерильных условиях в пробирках на 60 мл. Для этого в пробирку помещали фильтровальную бумагу, скрученную в спираль (1*100 см), вносили 30 мл рабочего раствора неорганического удобрения Кимер, (концентрация 1г/л), закрывали ватными пробками и автоклавировали при 1 ати в течении 30 минут. Семена огурца поверхностно стерилизовали, обрабатывая в течении 3 минут 70% этанолом, после чего 3 раза промывали стерильной дистиллированной водой и вносили в подготовленные, охлажденные до комнатной температуры пробирки на скрученную фильтровальную бумагу. Пробирки с семенами помещали в растительный бокс и выращивали в течении 14 суток при температуре 25о С и освещении 14 час/сутки.
2.Метод определения концентрации экссудатов
Для анализа концентрации экссудатов применяли метод титриметрического определения ХПК.
Титриметрический метод определения ХПК основан на окислении органических веществ избытком бихромата калия в растворе серной кислоты при нагревании в присутствии катализатора - сульфата серебра. Остаток бихромата калия находят титрованием раствором соли Мора, по разности определяют количество R2Cr2O7, израсходованное на окисление органических веществ в пробе и рассчитывают величину ХПК в мгО/л.
3. Метод культивирования микроорганизмов на экссудатах.
Глубинное культивирование проводили в колбах Эрленмейера объемом 100 мл. В качестве питательной среды использовали экссудаты огурца. Жидкость из всех пробирок сливали в стерильную колбу и делали рассев на твердые питательные среды для контроля стерильности. Независимо от результата, экссудаты дополнительно стерилизовали через мембранные фильтры (Millex GP 0.22 um) и вносили в стерильные колбы объемом 100 мл. Перед иннокуляцией определяли значение ХПК. Засев микроорганизмов производили фламбированной бактериологической петлей с косяка в концентрациях, не изменяющих концентрацию углерода в питательной среде. Микроорганизмы культивировали в течении 80 часов при 25о С . Данные параметры приближены к естественным условиям выращивания растений в защищенном грунте на минераловатном субстрате. Во время культивирования стерильно отбирали пробы для измерения ХПК.
4. Описание микроорганизмов
Для эксперимента были выбраны следующие микроорганизмы, входящие в состав биологических препаратов для защиты растений и обладающие антагонистическими свойствами по отношению к фитопатогенам:
Pseudomonas fluorescens (царство Bacteria, отдел Proteobacteria, класс Gamma Proteobacteria, порядок Pseudomonadales, семейство
Pseudomonadaceae, род Pseudomonas). Этот вид бактерий используются для производства таких препаратов биологической защиты растений, как Планриз, Ризоплан, Витаплан, и др. Штамм Pseudomonas fluorescens B-1001 был взят из коллекции РХТУ им. Д.И. Менделеева, кафедры Биотехнологии.
Trichoderma viride (царство Fungi, отдел Ascomycota, класс Sordariomycetes, подкласс Hypocreomycetidae, порядок Hypocreales, род Trichoderma). Данный гриб входит в состав биопрепаратов Триходермин, Трихозан, и пр. Штамм Trichoderma viride F-2001 был взят из коллекции РХТУ им. Д.И. Менделеева, кафедры Биотехнологии.
Bacillus subtilis (царство Bacteria, отдел Firmicutes, класс Bacilli, порядок Bacillales,
семейство Bacillaceae, род Bacillus). Бактерии этого вида являются действующий веществом таких биопрепаратов для защиты растений, как Фитоспорин, Пралин, и др. Штамм Bacillus subtilis B-1018 был взят из коллекции РХТУ им. Д.И. Менделеева, кафедры Биотехнологии
Azotobacter chroococcum (царство Bacteria, отдел Proteobacteria, класс Gamma Proteobacteria, порядок Pseudomonadales, семейство
Pseudomonadaceae, род Pseudomonas). Бактерии используются для производства препарата биологической защиты растений Азотобактерин . Штамм Azotobacter chroococcum B-1085 был взят из коллекции РХТУ им. Д.И. Менделеева, кафедры Биотехнологии.
В качестве тест-объекта для исследования был выбран фитопатогенный гриб Fusarium oxysporum (царство Fungi, отдел Ascomycota, класс Ascomycetes, подкласс Sordariomycetidae, порядок Hypocreales), вызывающий болезни увядания многих растений, в том числе огурца. Штамм Fusarium oxysporum F-2016 взят из коллекции РХТУ им. Д.И. Менделеева, кафедры Биотехнологии.
Результаты и их обсуждения
Основной задачей нашего исследования являлось изучение метаболизма экссудатов огурца различными микроорганизмами. Для этого получали экссудаты огурца, стерильно выращивая семена как указано выше, при этом на 14 сутки у растения наблюдалось образование 2-3 листов, а корневая система достигала 15 см (рис.2). Стерильные экссудаты использовали в качестве субстрата при глубинном культивировании микроорганизмов.
На первом этапе эксперимента было проведено культивирование фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum. Каждые 25 часов проводили отбор проб для измерения концентрации экссудатов (ХПК). При этом концентрацию микроорганизмов принимали за константу, т. к. рост культуры был незначительным и порядок КОЕ/мл не менялся. На основе полученных данных построили график зависимости изменения ХПК от времени (график 1).
Как видно из графика, метаболизм экссудатов происходит по обратной S-образной кривой, что характерно для периодических условий культивирования. На основе полученных данных, были определены остаточная концентрация экссудатов на 80-й час культивирования и скорость их метаболизма. Скорость метаболизма экссудатов вычисляли по разнице концентрации экссудатов отнесенной ко времени культивирования . Результаты представлены в таблице № 1.
Аналогичным образом проводили культивирование микроорганизмов,
используемых в производстве препаратов биологической защиты растений- Azotobacter
chroococcum, Pseudomonas fluorescens, концентрации экссудатов (ХПК). Полученные Trichoderma viride, Bacillus subtilis. Во время результаты представлены на рис.4 культивирования также определяли изменение
2500
2000
1000
■ Fusarium oxysporum
Рис.1. Рост огурцов в стерильных условиях.
10 20 30 40 50 60 70 80
Время, час
Рис.3. График кинетики метаболизма экссудатов Fusarium oxysporum
w
i;
К1 I
2500
2000
1500
g юоо
500
■ Pseudomonas fluorescens
Trichoderma viride ¥ Bacillus subtilis * Azotobacter chroococcum
Рис.2. Росток огурца на 14-е сутки.
30 40 50 Время,час
Рис.4. График кинетики метаболизма экссудатов огурца различными микроорганизмами.
На основе полученных данных, определяли остаточную концентрацию и скорость метаболизма экссудатов (см. таблицу №1) Полученные результаты свидетельствуют о том, что все исследуемые микроорганизмы способны к метаболизму корневых экссудатов огурца, различаясь между собой по скорости метаболизма и остаточной концентрацией экссудатов за одинаковый период времени.
Как показал анализ экспериментальных данных, наименьшей скоростью метаболизма экссудатов обладает штамм Pseudomonas fluorescens - всего 13,83 мгО/л*час, причем остаточная концентрация экссудатов на 80-й час культивирования по значению ХПК составила 824 мгО/л. а наибольшей - Azotobacter chroococcum, который метаболизирует экссудаты огурца со скоростью 20,28 мгО/л*час при остаточной концентрация экссудатов 308 мгО/л. Немного меньше, чем у Azotobacter chroococcum , скорость метаболизма экссудатов у Bacillus subtilis и Trichoderma viride, 19,69 и 18,23 мгО/л*час соответственно (конечная концентрация
экссудатов 355 и 472 мгО/л). Но принципиально важно, что все эти микроорганизмы (кроме Pseudomonas fluorescens) потребляют субстрат с большей скоростью, чем фитопатогенный штамм Fusarium oxysporum, скорость потребления экссудатов которым составляет 17,68 мгО/л*час.
Необходимо отметить, что все исследуемые микроорганизмы являются прямыми
конкурентами в одной трофической цепи, поскольку обитают в ризосфере растений, где основным источником их питания служат корневые экссудаты. Следовательно, при таком типе взаимоотношений преимущество имеют микроорганизмы с наибольшей скоростью метаболизма экссудатов, а именно Azotobacter chroococcum.
Выводы.
1. Все микроорганизмы, использованные в эксперименте, способны к метаболизму экссудатов огурца.
2. Наибольшей скоростью метаболизма среди изученных микроорганизмов, обладает штамм Azotobacter chrococcum B-1085.
Таблица №1
Метаболизм экссудатов огурцов различными микроорганизмами
Микроорганизмы ХПК начальное; мгО/л ХПК конечное; мгО/л скорость метаболизма % метаболизма экссудатов
Azotobacter chroococcum B-1085 1930 308 20,28 84,04
Pseudomonas fluorescens B-1001 1930 824 13,83 57,31
Trichoderma viride F-2001 1930 472 18,23 75,54
Bacillus subtilis B-1018 1930 355 19,69 81,61
Fusarium oxysporum F-2016 1930 516 17,68 73,26
Титова Дарья Германовна студент, кафедры биотехнологии и промышленной экологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Буланов Александр Геннадьевич студент, кафедры биотехнологии и промышленной экологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Филатова Ольга Михайловна студент, кафедры биотехнологии и промышленной экологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Дмитриева Евгения Николаевна ведущий инженер, кафедры биотехнологии и промышленной экологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Горюнова Ольга Борисовна к.т.н., ведущий инженер, кафедры биотехнологии и промышленной экологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Белов Алексей Алексеевич д.т.н., доцент кафедры биотехнологии и промышленной экологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Марквичев Николай Семенович к.т.н., доцент кафедры биотехнологии и промышленной экологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Литература.
1. Артамонова М.Н., Потатуркина-Нестерова Н.И. Характеристика микробного сообщества ризосферы и ризопланы cucurbita pepo. // Биологические науки- 2013. №10. С 3060-3070.
2. А.И. Шапошников, А.А. Белимов. Взаимодействие ризосферных бактерий с растениями: механизмы образования и факторы эффективности ассоциативных симбиозов. // Сельскохозяйственная биология- 2011. № 3. С. 16-22.
3. Алексеева А. С., Артамонова. Видовые особенности состава корневых выделений растений и его изменение в ризосфере под влиянием почвенной микрофлоры. // Фундаментальные исследования-2013.№11.С.929-932.
4. Л.В. Кравченко, А.И. Шапошников. Видовые особенности состава корневых выделений растений и его изменение в ризосфере под влиянием почвенной микрофлоры. // Сельскохозяйственная биология- 2011. № 3. С. 71-75.
Titova Daria Germanovna*, Bulanov Alexander Gennadievich, Filatova Olga Michailovna, Dmitrieva Eugene Nikolaevna, Goryunova Olga Borisovna, Belov Alexey Alexeevich, Markvmchev Nikolai Semenovich.
D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia. * E-mail: [email protected]
ROLE OF EXUDATES OF CUCUMBER ROOT SYSTEM IN FORMATION OF MICROBIAL COENOSIS WITHIN GROWING BY TECHNOLOGY SUCCINCT
Abstract
The study was used to study the metabolism of exudates of cucumber varieties Gavrish F1 Athlete various microorganisms, fungus Fusarium oxysporum and its antagonists. Was determined the initial concentration of organic matter in exudates by titrimetric determination of COD, metabolic rate exudates microorganisms and residual concentration of organic substances in the exudates.
Keywords: rhizosphere, exudates of cucumber, Fusarium oxysporum, the metabolic rate of exudates.
