CC BY
103
Научный журнал КубГАУ, №115(01), 2016 года
1
УДК 632.937: 579.64:663.15
03.00.00 Биологические науки
ВЛИЯНИЕ ДАВЛЕНИЯ ПРИ ОПРЫСКИВАНИИ РАСТЕНИЙ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМИ ПРЕПАРАТАМИ НА СОХРАНЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ
МИКРООРГАНИЗМОВ И ИХ ЧИСЛЕННОСТЬ
Котляров Владимир Владиславович д. c-х. н., профессор РИНЦ БРГЫ-код=5905-0474 Кубанский государственный аграрный университет, Краснодар, Россия
Сединина Наталья Викторовна старший научный сотрудник-микробиолог РИНЦ БРГЫ-код=4792-1196
НИИ Биотехнологии и сертификации пищевой продукции, Кубанский государственный аграрный университет, Краснодар, Россия
Донченко Дмитрий Юрьевич
к. б. н., старший научный сотрудник
РИНЦ БРШ-код=4352-6610
Кубанский государственный аграрный университет, Краснодар, Россия
Котляров Денис Владимирович
к. б. н., докторант кафедры физиологии и биохимии
растений
РИНЦ БРШ-код=2928-5639 Кубанский государственный аграрный университет, Краснодар, Россия
Вопросы микробиологической защиты растений становятся более актуальными. Применение микроорганизмов позволяет решить следующие задачи: биологизация сельского хозяйства и оздоровление почв. Однако применение различных физических факторов воздействия на микроорганизмы, приводит к снижению числа жизнеспособных микроорганизмов или их гибели, что сказывается на эффективности их использования. В статье приведены примеры применения давления в биотехнологическом процессе производства микробиологических препаратов, а также в процессе их использования при опрыскивании. Приведены конкретные примеры влияния давления на неспорообразующие бактерии - Azotobacter chroococcum, спорообразующие бактерии - Bacillus megatherium и грибы - Tricho-derma viride. Эти микроорганизмы используются в баковой смеси для защиты растений от болезней и насекомых-вредителей, разработанной ООО МИП «Кубанские агротехнологии» при ФГБОУ ВПО КубГ АУ. Целесообразным является одновременное применение обработок растений баковой смесью микроорганизмов вместе с гербицидом. Уста-
UDC 632.937:579.64:663.15 Biological sciences
THE EFFECT OF PRESSURE SPRAYING PLANTS WITH MICROBIOLOGICAL PREPARATIONS TO MAINTAIN THE VIABILITY OF MICROORGANISMS AND THEIR AMOUNT
Kotlyarov Vladimir Vladislavovich Dr.Sci.Agr., professor
Kuban State Agrarian University, Krasnodar, Russia
Sedinina Natalya Viktorovna Main research worker-microbiologist
SRI Biotechnology and food manufacturing certification of Kuban State Agrarian University, Krasnodar, Russia
Donchenko Dmitriy Yrievich Cand.Biol.Sci., Main research worker
Kuban State Agrarian University, Krasnodar, Russia
Kotlyarov Denis Vladimirovich Cand.Biol.Sci.
Kuban State Agrarian University, Krasnodar, Russia
Questions of microbial plant protection become more relevant. The use of microorganisms can solve the following problems: biologization of agriculture and sanitation of soil. Application of various physical factors affecting the microorganisms reduces their number.
This influences the efficiency of their use. This article gives examples of the application of pressure in the biotechnological process of microbial preparations and their use in the process of spraying. The effect of pressure on nonspore bacteria - Azotobacter chroococcum, spore-forming bacteria - Bacillus megatherium and fungi - Trichoderma viride has been presented in this article. These microorganisms are used in the tank medium for protecting plants against diseases and pests developed by Ltd. "Kuban agrotehnoloogy" of Kuban State Agrarian University. Efficiency is the simultaneous application of tank medium of microorganisms with herbicide. It was found that the application of the tank medium of microorganisms for spraying is necessary to limit the pressure of 4.5 atm. ^e use of higher spraying modes effects on reducing the number of viable bacteria. This fact has not been checked against fungi
http://ej.kubagro.ru/2016/01/pdf/78.pdf
Научный журнал КубГАУ, №115(01), 2016 года
2
новлено, что при применении баковой смеси микроорганизмов для опрыскивания необходимо ограничится давлением 4,5 атм. Применение более высоких режимов опрыскивания сказывается на снижении числа жизнеспособных бактерий. В отношении грибов данный факт установлении не был
Ключевые слова: ЗАЩИТА РАСТЕНИЙ, Keywords: PLANT PROTECTION,
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ, ПОЧВА, MICROBIOLOGICAL PREPARATION, SOIL, ИССЛЕДОВАНИЕ, БАКОВОЕ СРЕДСТВО, ГРИБ, RESEARCH INVESTIGATION, TANK MEDIUM, БАКТЕРИЯ FUNGI, BACTERIUM
Использование микроорганизмов в защите растений от болезней и насекомых вредителей - один из способов биологизации сельского хозяйства, формирования супрессивности почв. Тот факт, что любые физические методы воздействия на живую микробную клетку могут иметь как положительное, так и отрицательное значение остаётся неизменным. Физиологические особенности клеток, средства и способы их защиты самих себя весьма разнообразны. Однако, физические факторы воздействия в виде температуры, давления, света, радиактивных веществ при превышении определенных значений могут приводить к необратимым изменениям в клетках микроорганизмов. Давно известно, что бактерии малочувствительны к высокому давлению. Они переносят гидростатическое давление до 900 атм и живут на дне рек и морей. Известны барофильные микроорганизмы которые могут размножаться только при высоком давлении. Баротолерантные растут и размножаются при атмосферном давлении, но переносят и высокое давление. Барочувствительные не размножаются и не растут при высоком давлении. Возможность выдерживать определенное осмотическое давление определяется чувствительностью микроорганизмов (осмофилов, галлофилов, умеренных галлофилов) к концентрации солей, питательных веществ, сахара. Данные свойства используются в питании микроорганизмов, которое осуществляется за счет активной и пассивной диффузии при поступлении питательных веществ в микробные клетки при нахождении их в питательной среде определенного состава [3].
http://ej.kubagro.ru/2016/01/pdf/78.pdf
Научный журнал КубГАУ, №115(01), 2016 года
3
Свойство физической инактивации микроорганизмов за счет создания давления используются в процессах стерилизации. Так, например, процессы автоклавирования (стерилизации) питательных сред чаще всего протекают при давлении от 0,5 до 1,2 kgf/cm , а процессы уничтожения микроорганизмов при 2,2 kgf/cm2. Этим значениям всегда соответствует определенная температура, достигаемая в автоклаве, и существуют временные режимы экспозиции при этих величинах давления соответственно.
В сельскохозяйственной биотехнологии и защите растений давление используется на следующих этапах и стадиях:
- автоклавирование питательной среды;
- аэрация процесса в случае культивирования аэробных микроорганизмов;
- фильтрация культуральных жидкостей;
- опрыскивание посевов.
Наибольший интерес для биотехнологов и агрономов представляет процесс опрыскивания. Современная техника, применяемая для опрыскивания, представлена машинами и установками роторного и форсуночного типа. При совмещении в баковой смеси микробиологических препаратов и химических, например гербицидов, необходимо обеспечить соблюдение давления в пределах 3,5-5 атм с тем, чтобы достичь равномерное распределение компонентов баковой смеси на гектар. Кроме того от применяемого давления зависит экономия или перерасход средств защиты растений.
Известно, что дрожжи сохраняют свою жизнеспособность при давлении 500 атм. Грибы и бактерии выдерживают давление до 3000 атм [3]. Однако, эти данные очень обширны и не дают конкретной оценки по влиянию давления при опрыскивании о сохранении жизнеспособности определенных микроорганизмов на выходе из отверстий форсукок опрысвателя. Получение данных о количественных изменениях микроорганизмов в результате воздействия давления стало целью нашего исследования.
http://ej.kubagro.ru/2016/01/pdf/78.pdf
Научный журнал КубГАУ, №115(01), 2016 года
4
Материал и методики исследования:
В качестве объектов исследования нами были выбраны три культуры микроорганизмов: 1 грибная форма и 2 бактериальные - спорообразу-ющаяая и неспорообразующая. Выбор нижеперечисленных культур обусловлен тем, они используются для защиты растений в баковой смеси в препарате, разработанном на базе ООО МИП «Кубанские агротехнологии» Кубанского госагроуниверситета [1, 2].
В качестве представителя грибной микрофлоры использовали Trichoderma viride (рис. 1). Этот гриб улучшает структуру почвы, формирует её супрессивную микрофлору. Являясь антагонистом, в процессе развития выделяет в окружающую среду антибиотики виридин, триходермин, способные подавлять развитие почвенных фитопатогенов - Fusarium, Phy-tophthora, Alternaria, Phythium, Botrytis, Phoma [5]. Так же T. viride препятствует развитию возбудителей ржавчины, мучнистой росы. В отношении питательных субстратов, представленных целлюлозосодержащими остатками, T. viride быстро осваивает их, выделяя фермент целлюлазу, разлагающую высокомолекулярные полисахариды. Гриб способен активно размножаться. Конидиеносцы гриба септированные, разветвленные, образуют концентрические кольца и обычно находятся на боковых ветвях (рис. 2). T. viride формирует споры.
http://ej.kubagro.ru/2016/01/pdf/78.pdf
Научный журнал КубГАУ, №115(01), 2016 года
5
Рисунок 1. Trichoderma viride трёхсуточный рост на среде Чапека (фото Н. В. Седининой, 2014)
Рисунок 2. Trichoderma viride 1000х (фото Н.В. Седининой,, 2013)
http://ej.kubagro.ru/2016/01/pdf/78.pdf
Научный журнал КубГАУ, №115(01), 2016 года
6
Температурный оптимум развития гриба находится в интервале 22-30оС. рН оптимум составляет 5,0-6,8 [5].
В работе была использована трехсуточная культура, выращенная на среде Чапека.
В качестве представителя бактериальной неспоровой микрофлоры в исследовании применяли Azotobacter chroococcum - микроорганизмы, фиксирующие атмосферный азот и применяемые в защите растений в качестве антагониста возбудителей болезней [4, 6, 7]. Грамотрицательные короткие палочки, при культивировании их на азотсодержащих средах, способные к плеоморфизму (рис. 3). Колонии слизистые, при старении приобретают бурую окраску (рис. 4). В работе использовали суточную культуру A. chroococcum, выращенную на среде Эшби.
Рисунок 3. Микроскопия Azotobacter chroococcum 1000х (фото Н.В. Седининой, 2013)
http://ej.kubagro.ru/2016/01/pdf/78.pdf
Научный журнал КубГАУ, №115(01), 2016 года
7
Рисунок 4. Azotobacter chroococcum; рост на среде Эшби (слева) и ГРМ-агаре (справа)
(фото Н.В. Седининой, 2013, 2014)
В качестве представителя бактериальной спорообразующей микрофлоры была использована фосформобилизирующая бактерия - Bacillus megatherium. Эти бактерии при выделении фосфатазы, отщепляют фосфорную кислоту, переводят трудноусвояемые фосфаты в форму, доступную для питания растений. B. megatherium продуцент биологически активных веществ - витамина В12, тиамина, пиридоксина, никотиновой и панто-теновой кислот [4, 6, 7]. Отличительной особенностью B. megatherium является то, что, клетки 14-20 суточной культуры приобретают дрожжеподобную, выпуклую, фасолеобразную форму [8] (рис. 5). В работе использовали суточную культуру, выращенную на среде ГРМ-агар .
http://ej.kubagro.ru/2016/01/pdf/78.pdf
Научный журнал КубГАУ, №115(01), 2016 года
8
Рисунок 5. Bacillus megatherium микроскопия 20-суточная культура 1000х
(фото Н.В. Седининой, 2013)
Из перечисленных культур, выращенных на средах, установленных нормативной документацией, были приготовлены смывы с косяков, а затем из них получены микробные взвеси по стандартам мутности на 5 и 10 ЕМ с соответствующей нагрузкой микроорганизмов, приняв, что 10 ЕМ соответствует n х109 КОЕ/мл. После чего, каждую приготовленную взвесь культур микроорганизмов в количестве 1 мл перенесли в 100 мл стерильного физиологического раствора (0,85% NaCl) , разлитого в стерильные пластмассовые ёмкости. Эти образцы культур микроорганизмов - считаются контрольными. Из них были сделаны микробиологические посевы для установления числа КОЕ (колониеобразующих) единиц в 1 мл взвеси. Пластмассовые ёмкости закрывались завинчивающимися крышками, на которых имелся герметично закрепленный штуцер для присоединения шланга компрессора. Для создания давления внутри этих ёмкостей приме-
http://ej.kubagro.ru/2016/01/pdf/78.pdf
Научный журнал КубГАУ, №115(01), 2016 года
9
няли безмасляный компрессор OF 302-4B. Интервал давления, применяемого к культурам в ёмкостях, выбран от 2 до 5 атм. Шаг -1 атм. После достижения в ёмкостях давления в пределах выбранного интервала, культуры выдерживались при каждом режиме давления в течение 10 минут с тем, чтобы это максимально соответствовало времени пребывания микроорганизмов в опрыскивателе. Затем стерильной пипеткой из ёмкостей отбирали по 1 мл взвеси в 3-х повторностях и переносили в 9 мл стерильного физиологического раствора. Из приготовленного исходного разведения готовили ряд последующих разведений для посевов, так, чтобы в дальнейшем можно было подсчитать среднее число выросших КОЕ/мл каждой культуры. Применялся глубинный посев. T. viride выращивали на агаризованной среде Чапека при температуре 22±1оС в течение 5 суток. A. chroococcum и B. megatherium выращивали на среде ГРМ-агар при температуре 30 ±1оС в течение 3 суток.
Результаты исследования (контроль и образец, к которому применялось максимальное давление) представлены на рисунках 6-11 и объединены в таблице 1.
Результаты исследования:
Рисунок 6. Рост T. viride на среде Чапека контрольный вариант без применения
http://ej.kubagro.ru/2016/01/pdf/78.pdf
Научный журнал КубГАУ, №115(01), 2016 года
10
давления (фото Н. В. Седининой, 2014)
Рисунок 7. Рост T. viride на среде Чапека вариант с применением давления 5 атм
(фото Н. В. Седининой, 2014)
Рисунок 8. Рост A. chroococcum на среде ГРМ-агар контрольный вариант без применения давления (фото Н. В. Седининой, 2014)
http://ej.kubagro.ru/2016/01/pdf/78.pdf
Научный журнал КубГАУ, №115(01), 2016 года
11
Рисунок 9. Рост A. chroococcum на среде ГРМ-агар вариант с применением давления 5 атм (фото Н. В. Седининой, 2014)
Рисунок 10. Рост B. megatherium на среде ГРМ-агар контрольный вариант без применения давления (фото Н. В. Седининой, 2014)
http://ej.kubagro.ru/2016/01/pdf/78.pdf
Научный журнал КубГАУ, №115(01), 2016 года
12
Рисунок 11. Рост B. megatherium на среде ГРМ-агар вариант с применением давления 5 атм (фото Н. В. Седининой, 2014)
Таблица 1- Количество микроорганизмов, КОЕ/мл до и после ____________________________применения давления_____________________
Название культуры мик- Вариант исследования
роорганизмов Контроль 2 атм 3 атм 4 атм 5 атм
T. viride, КОЕ/мл 1,8х104 2х104 3,2х104 4,2х104 6,7х104
A. chroococcum, КОЕ/мл 9х105 6х105 5,5х105 5х105 1,9х105
B. megatherium, КОЕ/мл 2х106 1х106 2,2х105 1х105 5х104
Обсуждение и выводы:
Как показывают результаты исследования, представленные в таблице 1, в варианте с T. viride с увеличением применяемого к культуре микроорганизмов давления от 2 до 5 атм, происходит увеличение числа их КОЕ/мл. Мы это связываем с тем, что T. viride является грибом, имеющим многоклеточный септированный мицелий. При воздействии на T. viride давления происходит разрыв в местах соединения мицелия, что и даёт новые точки роста будущих колоний гриба.
В образцах бактериальных культур A. chroococcum и B. megatherium при увеличении давления в пределе выбранного интервала от 2 до 5 атм происходит снижение числа КОЕ/мл, и в сравнении с контролем, и с 9х105
http://ej.kubagro.ru/2016/01/pdf/78.pdf
Научный журнал КубГАУ, №115(01), 2016 года
13
до 1,9х105 КОЕ/мл для A. chroococcum , и с 2х106 до 5х104 КОЕ/мл для B.megatherium . Задержки роста или отставания его по времени в сравнении с контролем ни в одном из образцов отмечено не было.
Полученные в ходе исследования результаты, позволяют рекомендовать режим применения давления для опрыскивания посевов с целью защиты растений - не более 4±0,5 атм. Данные исследования применены в процессе опрыскивания растений в хозяйствах, применяющих инновационную схему защиты растений, разработанную ООО МИП «Кубанские агротехнологии» при Кубанском госагроуниверситете. Кроме того представленные результаты исследования могут быть интересны биотехнологам, агрономам, применяющим микробиологические средства защиты растений.
Литература:
1. Котляров В.В., Сединина Н. В. Инновационная концепция микробиологической защиты растений // Материалы 3-го Всероссийского съезда по защите растений. Санкт-Петербург. 2013. С. 354-356.
2. Котляров В.В., Сединина Н. В., Котляров Д. В., Донченко Д. Ю. Экологизация и биологизация сельского хозяйства на примере технологии производства и применения бакового средства для защиты растений от болезней и насекомых-вредителей // Материалы 2-ой международной научно-практической конференции «Наука в современном информационном обществе» Москва. 2013. С. 142-144.
3. Микробиология: Учебник для агротехнологов / О. Д. Сидоренко, Е. Г. Борисенко, А. А. Ванькова, Л. И. Войно. - М., 2005. - 287 с.
4. Мосичев, С.М. Общая технология микробиологических производств / С. М. Мосичев, А. А. Складнев, В. Б. Котов М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1982. - 264с.
5. Биологическая защита растений / М. В. Штерншис, Ф. С. -У. Джалилов, И.В. Андреева, О.Г. Томилова; Под ред. М.В. Штерншис. - М.: КолосС, 2004. - 264с.
6. Применение физиологически активных веществ в агротехнологиях /В.В. Котляров, Ю.П. Федулов, К. А. Доценко, Д.В. Котляров, Е.К. Яблонская. - Краснодар:
КубГАУ, 2013 - 169с.
7. Котляров В.В. Физиология иммунитета растений: Учебное пособие. /В.В. Котляров - Краснодар, 2006.- 102 с.
8. Теппер, Е. З. Практикум по микробиологии: Учебное пособие для вузов / Е. З. Теппер, В. К. Шильникова, Г. И. Переверзева.- М.: Дрофа, 2004.- 256 с.
9. http ://www.fl oralworl d. ru/regulyators/yantarnaya. shtml
http://ej.kubagro.ru/2016/01/pdf/78.pdf
Научный журнал КубГАУ, №115(01), 2016 года
14
References:
1. Kotljarov V.V., Sedinina N. V. Innovacionnaja koncepcija mikrobiologicheskoj zashhity rastenij // Materialy 3-go Vserossijskogo sezda po zashhite rastenij. Sankt-Peterburg. 2013. S. 354-352. (In Russian)
2. Kotljarov V.V., Sedinina N. V., Kotljarov D. V., Donchenko D. Ju. Jekologizacija i biologizacija sel'skogo hozjajstva na primere tehnologii proizvodstva i primenenija bakovogo sredstva dlja zashhity rastenij ot boleznej i nasekomyh-vreditelej // Materialy 2-oj mezhdu-narodnoj nauchno-prakticheskoj konferencii «Nauka v sovremennom informacionnom ob-shhestve» Moskva. 2013. S. 142-144.
3. Mikrobiologija: Uchebnik dlja agrotehnologov / O. D. Sidorenko, E. G. Borisenko, A. A. Van'kova, L. I. Vojno. - M., 2005. - 287 s. (In Russian)
4. Mosichev, S.M. Obshhaja tehnologija mikrobiologicheskih proizvodstv / S. M. Mosichev, A. A. Skladnev, V. B. Kotov M.: Legkaja i pishhevaja prom-st', 1982. - 264s. (In Russian)
5. Biologicheskaja zashhita rastenij / M. V. Shternshis, F. S. -U. Dzhalilov, I.V. Andreeva, O.G. Tomilova; Pod red. M.V. Shternshis. - M.: KolosS, 2004. - 264s. (In Russian)
6. Primenenie fiziologicheski aktivnyh veshhestv v agrotehnologijah / (In Russian) V.V. Kotlyarov, Ju.P. Fedulov, K. A. Docenko, D.V. Kotlyarov, E.K. Jablonskaja. - Krasnodar: KubGAU, 2013 - 169s. (In Russian)
7. Kotlyarov V.V. Fiziologija immuniteta rastenij: Uchebnoe posobie./ V.V. Kotljarov -Krasnodar, 2006.- 102 s. (In Russian)
8. Tepper, E. Z. Praktikum po mikrobiologii: Uchebnoe posobie dlja vuzov / E. Z. Tep-per, V. K. Shil'nikova, G. I. Pereverzeva.- M.: Drofa, 2004.- 256 s.
9. http://www.floralworld.ru/regulyators/yantarnaya.shtml
http://ej.kubagro.ru/2016/01/pdf/78.pdf
