CC BY
81
of metastatic melanoma by dendritic cell' vaccine: the results of clinical trial of I/II phase. Rossiyskiy bioterapevticheskiy zhur-nal. 2007; 6(2): 39-45. (in Russian)
14. Nikitin K.D., Rubtsova M.A., Utyashev I.A., Baryshnikov A.Yu. Development of anticancer vaccine on the basis of dendridoms. Rossiyskiy bioterapevticheskiy zhurnal. 2010; 2: 48-53. (in Russian)
15. Nosov D.A., Borunova A.A., Chkadua G.Z. et al. The treatment of patients with clear cell renal cell carcinoma by dendritic cells vaccine. Onkourologiya. 2010; 2: 22-32. (in Russian)
16. Chkadua G.Z., Zabotina T.N., Burkova A.A. et al. The adoptation of assay of dendritic cells isolation from monocytes of peripheral blood for clinical application. Rossiyskiy bioterapevticheskiy zhurnal. 2002; 1(3): 55-61. (in Russian)
17. Mikhaylova T.V., Baryshnikova M.A., Klimenko O.V. et al. Development of liposomal vaccine for anticancer therapy. Rossiyskiy bioterapevticheskiy zhurnal . 2011; 10(4): 62-6. (in Russian)
18. Baryshnikov A.Yu. Nanostructured liposomal systems in the delivery of anticancer drugs. Vestnik RAMN. 2012; 3: 23-31. (in Russian)
19. Baryshnikov A.Yu., Baryshnikova M.A. Immunoliposomes and the targets of their action. Zhurnal Rossiyskogo klinicheskogo obshchestva im. D.I. Mendeleea. 2012; 56(3-4): 60-7. (in Russian)
20. Mikhaylova I.N., Lukashina M.I., Morozova L.F. et al. Melanoma cell lines as the basis for anticancer vaccines. Vestnik RAMN. 2005; 7: 37-40. (in Russian)
21. Mikhaylova I.N., Kovalevskiy D.A., Burova O.S. et al. Expression of cancer-testis antigens in melanoma cells. Sibirskiy onkolo-gicheskiy zhurnal. 2010; 37 (1): 29-39. (in Russian)
22. Mikhaylova I.N., Kovalevsky D.A., Morozova L.F. et al. Cancer-testis genes expression in human melanoma cell lines. Melanoma Res. 2008; 18(5): 303-13.
23. Ji B., Chen Q., Liu B. et al. Glioma stem cell-targeted dendritic cells as a tumor vaccine against malignant glioma. Yonsei Medical J. 2013; 54(1): 92-100.
24. Kandalaft L.E., Chiang C.L., Tanvi J. et al. A phase I vaccine trial using dentritic cells pulsed with autologous oxidized lysate for recurrent ovarian cancer. J. Transl. Med. 2013; 11: 149-74.
25. Kim D.S., Kim D.H., Goo B. et al. Immunotherapy of malignant melanoma with tumor lysate-pulsed autologous monocyte-derived dentritic cells. YoseiMed. J. 2011; 52(6): 990-8.
26. Kuwabara K., Nishishita T., Morishita M. et al. Results of a phase I clinical study using dendritic cell vaccinations for thyroid cancer. Thyroid. 2007; 17: 53-8.
27. Valle R.D., Cerio A.L.D., Inoges S. et al. Dendritic cell vaccination in glioblastoma after fluorescence-guided resection. World J. Clin. Oncol. 2012; 3: 142-9.
28. Vleeschouwer S.D., Arredouani M., Ade M. et al. Uptake and presentation of malignant glioma tumor cells by monocyte-de-rived dentritic cells. Cancer Immunol. Immunother. 2005; 54: 372-82.
29. Yu J.S., Liu G., Ying H. et al. Vaccination with tumor lysate-pulsed dentritic cells elicits antigen-specific, cytotoxic T-cells in patients with malignant glioma. Cancer Res. 2004; 64: 4973-9.
30. Mikhaylova T.V., Baryshnikova M.A., Bagirova N.S. et al. The sterilization of multilayer proteoliposomes. Rossiyskiy biotera-pevticheskiy zhurnal. 2012; 11(1): 13-8. (in Russian)
Received 25.03.14
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛЕТОЧНАЯ АЛЛЕРГОЛОГИЯ
© коллектив авторов, 2014
удк 616-056.43-092:612.017.1]-078.33-092.9
Чудаков Д.Б., Рязанцев Д.Ю., Каширина Е.И., Бержец В.М.1, Свирщевская Е.В.
роль дозы аллергена в индукции у мышей lGE-АнтитEл на белки из клещей домашней пыли
ФГБУН «Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН, 117997, г Москва; 1ФГБУ «Научно-исследовательский Институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, г Москва, Россия
Механизмы возникновения IgE-антител (АТ) до настоящего времени понятны плохо. Очевидно, что низкий уровень белков из аллергенов, попадающих в контакт с иммунной системой, является определяющим для возникновения аллергии. Целью данной работы стало изучение продукции IgG-, IgA- и IgE-АТ на рекомбинантные белки Der f 1 и Der f 2 из клещей домашней пыли Dermatophagoides farinae в зависимости от количества введенного аллергена. Иммунизацию мышей линии CD1 проводили 12 раз интраперитонеально смесью 1:1 белков Der f 1 и Der f 2 в фосфатном буфере без адъювантов в дозах 10 000, 1000, 100, 10 и 1 нг/инъекция на 1 мышь. Продукция специфических IgG и IgA возрастала с увеличением дозы иммунизации, в то время как продукция IgE возрастала с уменьшением дозы антигена и была наивысшей в группе 1 нг. Между дозами, вызывающими IgG- и IgE-продукцию, существует «пустое окно» доз, при которых отсутствует специфический гуморальный ответ. Ответ на белки Der f 1 и Der f 2 был независимым и подчинялся общей кинетике. Результаты анализа содержания субклассов IgG показали, что доминирующим являлось содержание IgG1-AT, титр которых был максимальным и синтез которых наблюдали при дозах более чем 100 нг/инъекция на 1 мышь, тогда как IgG2a-, IgG2b- и IgA-AT определяли только в группах 1 и 10 мкг. IgG3-AT регистрировали только в группе 10 мкг. С помощью синтетических пептидов показали, что антитела IgG1-, IgG2b- и IgA-AT распознают общий эпитоп Der f 1 90-101, тогда как IgG2a-AT имеют другую специфичность. IgE-AT имели низкую аффинность и не распознавали синтетические пептиды. Таким образом, показано, что селекция IgE-продуцирующих В-клеток в ответ на растворимый белок возможна только при отсутствии IgG- и IgA-продуцентов, конкурирующих за антиген.
Ключевые слова: IgE; IgG; доза антигена; мыши; клещи домашней пыли Dermatophagoides farina.
Для цитирования: Иммунология. 2014; 35 (6): 321-328.
Для корреспонденции: Свирщевская Елена Викторовна, [email protected] For correspondence: Svirshchevskaya Elena Viktorovna, [email protected]
ChudakovD.B., RyasantsevD.Yu, KashirinaE.I., Berzhets V.M., SvirshchevskayaE.V.
THE ROLE OF ALLERGEN DOSE ON THE INDUCTION IN MICE OF IGE TO HOUSE DUST MITE PROTEINS
Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the RAS, 117997, Moscow, Russia; 'Mechnikov's Scientific Research Institute of Vaccines and Sera, RAMS, Maly Kazenny per. 5A, Moscow, 105064, Russia
Mechanisms of IgE formation are still poorly understood. Evidently that low levels of allergen proteins contacting immune system predetermines allergy formation. The aim of this work was to study IgG, IgA, and IgE antibody production against recombinant proteins Der f 1 and Der f 2 from house dust mites Dermatophagoides farinae induced by different quantity of allergens injected. Mice CD1 were injected 12 times by intraperitoneal rout with 1:1 mixture of Der f 1 and Der f 2 dissolved in saline without adjuvants with 10000, 1000, 100, 10 and 1 ng/injection/mouse. Production of specific IgG and IgA increased with the increase in the immunizing dose while the production of IgE increased with the antigen dose decrease and was the highest in 1 ng group. Between the doses inducing IgG and IgE production there was an "empty window" of doses where specific humoral response was not found. The responses to Der f 1 and Der f 2 were independent and regulated in the same manner. The analysis of IgG subclasses demonstrated that IgG1 antibodies dominated as their titers were the highest and they were found at doses >100 ng/injection/mouse while IgG2a, IgG2b, and IgA antibodies were formed only in 1 and 10 ug groups. IgG3 antibodies were found only in 10 ug group. IgG1, IgG2b, and IgA antibodies recognized a common epitope Der f 1 90-101 while IgG2a were of different fine specificity as it was shown using synthetic peptides. IgE antibodies were of low affinity and did not recognize linear peptides. Taken collectively we concluded that the selection of IgE-producing B-cells recognizing soluble proteins is possible only in the absence of IgG and IgA producers competing for the antigen.
Key words: IgE; IgG; antigen dose; mice; house dust mites Dermatophagoides farina.
citation: Immunologiya. 2014; 35(6): 321-328. (in Russian)
введение. Различными формами аллергии I типа, возникающей в результате формирования IgE к безвредным веществам, страдают до 30% населения развитых стран [1]. Несмотря на значительные успехи в понимании эффекторной фазы аллергических заболеваний, механизмы возникновения аллергии остаются малопонятными. Аллергены от патогенов отличаются четырьмя особенностями: не реплицируются в организме хозяина; не несут на своей поверхности лиган-дов Toll-подобных рецепторов клеток врожденной системы иммунитета; попадают в организм длительно; вызывают реакцию преимущественно у определенной популяции млекопитающих, имеющих генетическую предрасположенность
[2-5].
Для изучения механизмов возникновения аллергии необходимо использовать модель, максимально приближенную к естественному пути сенсибилизации организма. Изучение роли концентрации аллергенов в индукции IgE изучали несколько групп, из которых наиболее интересные результаты получены в работах S. Sudowe и Е. Kölsch, выполненные в 1995-2010 гг. [6-13]. Показано, что иммунизация 1 раз в 2 нед внутрибрюшинно мышей линии СВА/J дозой 100 нг/мышь гемоцианина улитки или фосфолипазы А2, смешанных с 2 мг гидроокиси алюминия, привела к формированию высокого уровня IgE уже к 5-й неделе [6], а иммунизация 10 мкг/мышь приводила к продукции IgG. Ответ не зависел от продукции интерлейкина-4 (ИЛ-4) и поляризации Т-хелперных (Тх) клеток в сторону Тх2 [7, 8], усиливался в мышах, дефицитных по ИЛ-10 [9]; не зависел от введения ИЛ-10 или ИЛ-12 [10, 11] и не был связан с активацией регуляторных [12]. При этом для индукции IgE требовался физический контакт между Ти В-клетками [7].
Оценка влияния длительности контакта иммунной системы с аллергенами проведена также группой S. Grunewald в 2001-2003 гг. [14, 15]. На мышах линии BALB/c показано, что при интраперитонеальной иммунизации овальбумином IgE-ответ формировался при многократной (n = 20) иммунизации низкой дозой аллергена [14]. Однократное введение суммарной дозы (100 мкг/мышь) приводило к формированию IgG-ответа. При этом возникновение IgE-продуцирующих клеток также происходило по независимому от ИЛ-4 и ИЛ-13 пути [15].
Данные, полученные группами Е. Kölsch и S.Grunewald, значительно отличаются по дозам аллергена, самим аллергенам, наличию или отсутствию адъюванта, а также по линиям использованных мышей. Более современных данных о роли дозы и частоты введения аллергенов на продукцию IgE нет, что говорит не столько о понимании механизмов возникновения аллергии, сколько о трудностях в воспро-
изводстве экспериментальных результатов. Имеющиеся на настоящий момент данные по механизмам возникновения аллергических реакций не позволяют выявить ключевое звено, ведущее к активации IgE-продуцирующих В-клеток. В связи с этим требуется вернуться к анализу роли дозы и длительности поступления нативного аллергена в организм млекопитающих, а также эффекта адъювантов на продукцию IgE. С этой целью мы выбрали белки из клещей домашней пыли (КДП) Dermatophagoides farinae в качестве модельных аллергенов. Для приближения к реальной ситуации сенсибилизации использовали смесь двух белков Der f 1 и Der f 2, которые вводили мышам аутбредной линии CD1 многократно, внутрибрюшинно, без адъювантов и в широком диапазоне доз. Результаты анализа продукции IgG-, IgA- и IgE-антител (АТ) показали наличие выраженных неперекрывающихся зон распознавания аллергенов IgG- и IgE-продуцирующими В-клетками, а также различие в тонкой специфичности данных АТ.
Материалы и методы. Животные. Самки линии мышей CD1 возраста 6 нед были получены из питомника «Андреев-ка» (Московская область, Россия). Все эксперименты проводили в соответствии с правилами работы с мышами по протоколу, одобренному комиссией по работе с животными.
Антигены. В работе использовали рекомбинантные белки Der f 1 и Der f 2L, полученные нами в бактериях E. coli, как описано ранее [16]. Пептиды Der f 1 90-101 и Der f 2 59-72 выбраны на основе профилей гидрофильности и поверхностной доступности и синтезированы коммерческой фирмой (Peptide 2.0, США).
Иммунизация. Общая схема иммунизации представлена на рис. 1. Всех животных разделили на шесть групп (n = 3), которых иммунизировали вначале без использования адъюван-тов интраперитонеально растворами белковой смеси Der f 1 и Der f 2L в соотношении 1:1 в 100 мкл фосфатного буфера (ФБ) с различной дозой иммунизации на мышь: 10, 1, 100, 10, 1 и 0 нг на однократную иммунизацию соответственно. По окончании иммунизации и после появления IgE-АТ провели дополнительную иммунизацию с адъювантами (рис. 1). При иммунизации с использованием адъювантов - полного адъюванта Фрейнда (CFA) и коммерческого адъюванта Im-ject с гидроксидом алюминия (Alum) - готовили аналогичные смеси белков с суммарной концентрацией 200; 20; 2; 0,2; 0,02 и 0 мкг/мл и смешивали перед введением аллергены в дозе 50 мкл с 50 мкл соответствующего адъюванта. Всего провели 12 иммунизаций без адъюванта с периодичностью 3 раза в неделю, затем 1 иммунизацию с CFA и 4 иммунизации с Alum.
Кровь забирали под наркозом из глазного синуса на 0, 6,
< t t t ¡j- ana
о < < <
I I I I I I I I I I I I I I lAl I I I I lÁl I I I I I I I I I Al I I I I I
0-e 5-e 10-e 15-e 20-e 25-e 30-e 35-e 40-e 45-e 50-e 55-e 60-e 65-e 70-e 75-e 80-e
LÛLÛ LÛLÛ LÛ ¡SSÜS 2Í3Í 3i2i Si
И Я i iPiPiPi Я IPI 111 И Pi 111 Я11111
Рис. 1. Схема иммунизации.
Дни (с начала эксперимента) иммунизации мышей линии CD1 интраперитонеально белковой смесью Der f 1 : Der f 2 в соотношении 1:1 в фосфатном буфере (ФБ) без использования адьювантов (БА), с использованием полного адьюванта Фрейнда (CFA) и коммерческого адьюванта Imject (Alum).
23, 29-е сутки (иммунизация без адьюванта), и на 39, 57, 64 и 82-е сутки (иммунизация с адъювантами) (см. рис.1). Полученную кровь оставляли на 15 мин при 37°С, центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин, отбирали сыворотку крови и хранили при -20°С до момента использования.
Иммуноферментный анализ. Титры специфических IgG-, IgE- и IgA-AT определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) на 96-луночных планшетах с высокой сорбирующей способностью (Costar, США). Рекомбинантные антигены наносили в 50 мкл ФБ на ночь при 4°С. Для определения уровня IgG наносили антигены в концентрации 5 мкг/ мл, для определения содержания IgE и IgA - 150 мкг/мл. Результаты предварительных экспериментов показали, что при высокой концентрации подложки специфичность выявления IgE значительно выше. Между инкубациями планшеты отмывали 3 раза раствором ФБ с 0,05% Твином-20 (ФБТ). Не-
специфическое связывание блокировали в течение 1 ч 1% раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) в ФБ (ФБА). Сыворотки в различных разведениях инкубировали 2 ч при комнатной температуре. Конъюгаты АТ с перокси-дазой хрена (ПХ) или биотином к мышиным IgGj-ПХ (Southern Biothechnologies, США), IgA-биотин; IgG2-ПХ (Beckman Coulter), IgG-ПХ, IgGj-ПХ (Serotec);
_ IgE-биотин (Biolegend), стрептавидин-
ПХ (Biolegend) наносили в рабочей концентрации на 1 ч. Цветную реакцию оценивали с помощью 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ) (Иммунотех, Москва) на спектрофотометре MultiScan FC (Thermo scientific, США). Данные считывали как величину оптической плотности (ОП) при 450 нм (ОП450)за вычетом ОП при 620 нм. За титр специфических АТ принимали разведение сыворотки, при котором ОП была больше, чем среднее фона плюс три стандартных отклонения.
Пептидный ИФА. Для постановки пептидного ИФА использовали аналогичный протокол со следующим отличием: блокирование неспецифических мест связывания проводили ФБТ, а не ФБА. Концентрация пептидов составляла 5 мкг/мл.
Сыворотки больных с аллергией на КДП. Для анализа использовали индивидуальные сыворотки 3 детей с аллергией на КДП, что было подтверждено методом кожных проб и блотом (RIDA-Allergy Screen, Германия), а также пул 10
о
ю
с О
о
1Л
■ч-с О
1000
1000
10 000 1000 -i-100 -п-10 -0-1
Рис. 2. Продукция специфических антител после 12 иммунизаций без адъюванта.
Титровочные кривые специфических антител IgG (а, в) и IgE (б, г) к белкам Der f 1 (а-б) и Der f 2 (в—г) после 12 интраперитонеальных иммунизаций различными (в нг/однократная иммунизация) дозами белковой смеси Der f 1: Der f 2 в соотношении 1:1 без адъюванта.
сэ
О)
8 -i
7-
6-
5-
4-
35
т-1-1-1-1-1
0-е 5-е 10-е 15-е 20-е 25-е 30-е
îîî îîî îîî îîî m ттг
100-1
80-
ш 60 -
40
20-
ттт ttт ттт ttт ttт ttт
"1-1-1-1-1-1
0-е 5-е 10-е 15-е 20-е 25-е 30-е
ттт ттт ттт ттт ттт ттт
100
80
ш 60
О)
40
ттт ттт ттт ттт ттт ттт
10 000
1000
100
-10
Рис. 3. Зависимость продукции специфических антител от времени и количества иммунизаций.
Продукция специфических IgG (а и в) и IgE (б и г) к белкам Der f 1 (а—в) и Der f 2 (в—г) в зависимости от количества иммунизаций без адьюванта различными дозами (в нг/однократная иммунизация) белковой смесью Der f 1: Der f 2 в соотношении 1:1.
0
2
сывороток здоровых доноров. ИФА IgG4 (anti-human IgG SantaCruze, США) и IgE (biotin-anti-human IgE, Biolegend, Соединенное Королевство Великобритании и Северной Ир-ланндии), специфичных к КДП, проводили на подложке Der f 2. Ранее мы показали, что бактериальный Der f 1 не распознается сыворотками больных из-за неправильной конформации [16]. Для подложки использовали 5 и 150 мкг/мл. В отличие от мышиных сывороток IgE из сывороток больных одинаково распознавали антиген на подложке как 5 мкг/мл, так и 150 мкг/мл. Далее в статье приведены данные для 5 мкг/мл.
Статистическая обработка данных. Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Excel. При значении вероятности нулевой гипотезы р < 0,05 различия считали статистически значимыми.
результаты и обсуждение. Продукция специфических IgG и IgE при иммунизации мышей без использования адъ-ювантов. Для анализа роли дозы и длительности введения аллергенов КДП использовали смесь 1:1 рекомбинантных белков Dermatophagoides farina Der f 1 и Der f 2L [16]. Следует отметить, что полученные рекомбинантные белки были гидрофобными и растворялись только в 8 М мочевине. При переводе в водный буфер были получены псевдорастворы белков. Аллергены вводили внутрибрюшинно в 100 мкл в ФБ 3 раза в неделю в диапазоне концентраций от 10 мкг/мышь
до 1 нг/мышь на инъекцию. Всего было 12 иммунизаций, соответственно суммарная доза для каждой группы составила 120, 12, 1,2, 0,12 и 0,012 мкг каждого аллергена на мышь. Примеры титровочных IgG- и IgE-, кривых, специфичных к каждому из белков смеси, приведены на рис. 2. Характер IgG-кривых показал, что только при дозах аллергена 1 и 10 мкг/мышь на инъекцию значительно повышается аффинность IgG-АТ, что выражается в резком увеличении титров с 103 при иммунизации дозой < 100 нг до > 105 и > 106 при иммунизации дозами 1 и 10 мкг соответственно (рис. 3, а, б). Оба белка распознавались независимо друг от друга, а титры АТ зависели от введенной дозы. Совершенно иную концентрационную зависимость наблюдали для IgE-АТ. Продукцию IgE-АТ, специфичных к белкам Der f 1 и Der f 2, обнаружили при самых низких дозах: для белка Der f 1 максимальный ответ наблюдали для дозы 1 нг, в меньшей степени - для дозы 10 нг (рис. 3, в); для белка Der f 2 - только для дозы 1 нг (рис. 3, г). Формирование IgG- и IgE-АТ различалось по времени. Уже к первому моменту забора крови уровень IgG-АТ, специфичных к Der f 1, достигал максимума и далее не менялся во времени (см. рис. 3, а). Уровень IgG-АТ, специфичных к белку Der f 2, достигал аналогичного максимума после 10-й инъекции (см. рис. 3, б) и также далее сохранялся на одном уровне. Формирование IgE-ответа начиналось после 5 инъ-
100-1
ш
о
100-1
100 1000 10 000 -■- ФБ ♦ CFA -4- Alum
10 000
Рис. 4. Эффект иммунизации с адъювантами на текущий гуморальный ответ.
Зависимость продукции специфических IgG (правая ось Y) и IgE (левая ось Y) антител к белкам Der f 1 (а) и Der f 2 (б) от дозы антигена при иммунизации без адъювантов (ФБ) и с последующей иммунизацией в адъюванте Фрейнда (CFA) или гидроокиси алюминия (Alum) (схема представлена на рисунке 1) белковой смесью Der f 1: Der f 2 в соотношении 1:1 в ФБ. Двусторонними стрелками отмечено «пустое окно», в котором нет продукции высокоаффинных IgG-антител.
екций для белка Der f 1 и после 10 инъекций для белка Der f 2 (см. рис. 3, в, г). При этом титры IgE-АТ нарастали с количеством инъекций. Сравнивая ответы на белки Der f 1 и Der f 2, можно сказать, что белок Der f 1 более иммуногенен, так как продукция IgG-АТ достигала максимума раньше, а продукция IgE-АТ начиналась раньше и, кроме того, титры были более высокими. Однозначно показано отсутствие IgE-продукции при всех дозах выше 10 нг/мышь на инъекцию.
Аффинность IgE была низкой. Так, при анализе уровня IgE методом ИФА на подложке с 5 мкг/мл иммобилизованного антигена достоверное связывание определяли на уровне предела чувствительности метода. При повышении концентрации подложки до 150 мкг/мл сыворотки титровались достоверно (см. рис. 2, рис. 3, в, г), при этом также регистрировали более высокие титры АТ. Эффект повышения
концентрации подложки можно объяснить повышением количества посадочных групп для IgE.
При сравнении титров антител IgE- и IgG-АТ в зависимости от дозы аллергенов выявляли «пустое окно» в диапазоне от >10 до <1000 нг/мышь на инъекцию, в котором вообще не определяли АТ, специфичные к белкам КДП (рис. 4, двусторонняя стрелка). Эффект «пустого окна» и его размер были одинаковы для обоих аллергенов - Der f 1 и Der f 2. С большой вероятностью наличие и размер окна будут зависеть от генетических факторов. Так, известно, что большая часть людей не страдают аллергией. Можно предположить, что у людей с резистентностью к аллергенам IgE эффект низких доз не появляется. У людей, предрасположенных к аллергии, размер «пустого окна» может быть значительно уже или даже перекрываться с продукцией IgG. Для ответа
га о. I-
igGl
10 100 1000 10 000 Доза иммунизации, мкг\мышь
lgG2a -à- lgG2b -о- lgG3 -Д- IgA
10 000-
80 000 -
О 60 000
о
40 000 H 20 000 0
УЯШ V////X
lgG1 lgG2a I р 90-101 Derf 1
lgG2b IgA Д p 59-72 Derf 2
Рис. 5. Продукция различных субклассов IgG и класса IgA.
Зависимость продукции различных субклассов IgG и класса IgA к белку Der f 2 от дозы интраперитонеальной иммунизации (в нг/однократная иммунизация) для мышей линии CD1 после 12 иммунизаций белковой смесью Der f 1: Der f 2 в соотношении1:1 в ФБ без адъюванта (а) и эпитопная специфичность данных антител (б).
Рис. 6. Сравнение продукции IgG и IgE в мышиной модели и у больных с аллергией на КДП.
Продукция низкоаффинных IgG1 и IgG2a (а) и IgE (в) для мышей CD1, иммунизируемых интраперитонеально низкими (1-100 нг) дозами белковой смеси Der f 1: Der f 2 без адъюванта в сравнении с уровнем IgG4 (б) и IgE (г) в сыворотке детей с аллергией на КДП (Б1-Б3) и пула сывороток здоровых доноров (Д).
на этот вопрос требуется провести аналогичные эксперименты на других линиях мышей.
Продукция специфических IgG и IgE при иммунизации с использованием адъювантов. Известно, что адъюванты усиливают иммунный ответ за счет дополнительной стимуляции антигенпредставляющих клеток. При этом считается, что CFA стимулирует смешанный Тх1- и Тх2-ответы, а гидроокись алюминия Alum способствует формированию преимущественно Тх2 [17, 18]. С целью проверки влияния адъюван-тов на уже сформировавшийся иммунный ответ в протокол иммунизации ввели CFA и Alum, которые предположительно могут модифицировать IgE-ответ за счет стимуляции IgG-ответа.
Полученные результаты приведены на рис. 4. Дополнительная иммунизация с адъювантами мышей дозой 10 мкг никак не влияла на титры IgG-АТ, что показывает функционирование механизмов обратной регуляции В-клеток, ограничивающих максимально возможную по численности популяцию В-клеток, которые продуцируют IgG-АТ одной специфичности. Иммунизация дозами 1 мкг и 100 нг/мышь с CFA и Alum привела к суммарному увеличению в 10 раз титров IgG, специфичных как к Der f 1 (см. рис. 4, а), так и к Der f 2 (см. рис. 4, б), но не вызвала появления IgG-АТ в группах 10 и 1 нг. Достаточно неожиданными были результаты по продукции IgE. Введение адъювантов в протокол иммунизации мышей групп 10 и 1 нг не отменяло продукции IgE (см. рис. 4). IgE-ответ на белок Der f 1 снижался в 4 раза, но достоверно сохранялся (см. рис. 4, а), а ответ на Der f 2 сохранялся на прежнем уровне. Каких-либо отличий по действию между CFA и Alum на гуморальный иммунный ответ не выявили.
Продукция IgA и отдельных субклассов IgG. Для понимания механизмов переключения В-клеток на синтез IgE-АТ может быть полезной информация о формировании IgA- и субклассов IgG-АТ при различных дозах иммунизации. Из-
вестно, что гены тяжелых цепей иммуноглобулинов в наивных В-клетках располагаются в линейной последовательности в ряду С^-С5-Су3-Су1-Су2Ь-Су2а-Се-Са [2]. При созревании в терминальных центрах наивные В-клетки, экспрессирующие на своей поверхности IgD и 1§М и способные продуцировать только ^М-АТ, выбрасывают часть зародышевых генов, что приводит к переключению В-клеток на синтез других классов и субклассов иммуноглобулинов [2]. Механизм переключения может быть прямым, когда выбрасывается несколько генов и клетка начинает продуцировать ^Е-АТ, минуя IgG; или последовательным, когда В-клетка сначала переключается на синтез одного или последовательно нескольких субклассов IgG, а затем на синтез 1§Е [7, 13]. Механизм переключения В-клеток на синтез 1§Е активно дискутируется в литературе [1-5]. Результаты исследований, начатых в 1994 г [4] и продолжающихся по настоящее время, показывают, что с большей вероятностью В-клетки осуществляют прямое переключение на продукцию IgE с возможностью в ряде случаев транзита через промежуточные субклассы IgG [7, 13].
При анализе субклассов и классов иммуноглобулинов, специфичных к белкам КДП, оказалось, что наиболее высокие титры АТ относились к субклассу IgG1, которые достоверно определялись при иммунизации дозой > 100 нг/мышь на инъекцию (рис. 5, а). IgG2a-, IgG2b- и IgA-АТ сравнимы по титрам между собой и возникали при иммунизации дозой > 1 мкг/мышь. IgG3-АТ регистрировали только у мышей, иммунизированных дозой 10 мкг/мышь. Ни один из субклассов IgG не выявили при дозе 10 и 1 нг/мышь, вызывающей продукцию 1§Е, что однозначно показывает наличие прямого переключения В-клеток на синтез 1§Е при распознавании сверхнизких доз аллергенов. В различных протоколах исследователи находят как прямое, так и последовательное переключение В-клеток на синтез IgE-АТ [7, 13], что показывает возможность двух независимых процессов для переключения В-клеток.
При переключении с одного класса/субкласса на другой В-клетки не меняют своей специфичности. При анализе эпи-топной специфичности АТ разных классов/субклассов можно показать наличие транзита В-клеток одной специфичности. Для анализа тонкой специфичности АТ мы выбрали два пептида из белков Der f 1 и Der f 2 по профилям гидрофильности и поверхностной доступности [19, 20]. Данные о пептидах как В-клеточных эпитопах белков КДП ранее опубликованы не были. Для анализа использовали сыворотки мышей, иммунизированных дозой 10 мкг/мышь на инъекцию. Показали, что пептид Der f 1 90-101 оказался эпитопом, хорошо распознаваемым IgGj-АТ (рис. 5, б, титр 8000). Меньшее количество В-клеток, синтезирующих IgG2b- и IgA-АТ, также распознавали данный пептид (см. рис. 5, б, титр 2000). В-клетки, продуцирующие IgG не распознавали данный эпитоп. АТ к пептиду Der f 2 59-72 практически не обнаружили. IgE-АТ не связывались с пептидом Der f 1 90-101 (данные не приводятся), что показывает различие в эпитопной специфичности В-клеток, продуцирующих IgE- и IgGj-АТ. Таким образом, можно сделать вывод о том, что тонкая специфичность АТ различных классов различается, и соответственно В-клетки могут переключаться на синтез IgE-АТ прямо, минуя синтез субклассов IgG. Преимущественное распознавание IgE-АТ конформационных эпитопов показано как в довольно ранних работах [21, 22], так и в более поздних [23]. Природа этого явления не совсем понятна особенно с учетом того, что в ряде случаев наблюдают последовательное (через IgG) переключение классов изотипов на IgE, вследствие чего эпитопная специфичность этих классов АТ должна была бы совпадать [24]. Показано, что IgG4-АТ распознают больше эпитопов, чем IgE-АТ [25], при этом IgG чаще распознают гидрофильные участки белка, а IgE - гидрофобные пептиды [23]. В то же время, по другим данным, эпитопная специфичность IgG4- и IgE-АТ в основном совпадает [26]. Так или иначе преимущественно конформационный характер IgE эпитопов показан многими авторами [21-23].
В случае иммунизации мышей сверхнизкими дозами эпитопы, распознаваемые IgGj и IgE-продуцирующими В-клетками, не перекрывались. Использованные нами пептиды являлись случайно отобранными и были представлены всего двумя пептидами, что не позволяет экстраполировать эти данные на общий случай.
Особенностью проведения ИФА является использование детергента твина-20 в отмывочном буфере для удаления АТ с низкой аффинностью. С определенной вероятностью при сверхнизких дозах аллергена могут появляться В-клетки, продуцирующие IgG-АТ с низкой аффинностью, предшествующие переключению на синтез IgE, что прямо связано с отсутствием конкуренции между В-клетками при их селекции в герминальных центрах. Для проверки данной гипотезы мы использовали тот же подход, что и при анализе уровня низкоаффинных IgE-АТ, а именно повысили концентрацию подложки в 30 раз (150 мкг/мл) для увеличения количества посадочных мест для низкоаффинных IgG. Результаты показали отсутствие низкоаффинных АТ в зоне пустого «окна» (рис. 6, б). Соответственно можно с определенной вероятностью заключить, что в случае иммунизации сверхнизкими дозами белков наблюдается прямое переключение В-клеток на синтез IgE-АТ.
Для сопоставления данных, полученных в мышиной модели, с данными больных с аллергией сравнивали уровень IgG- и IgE-АТ в сыворотках мышей, иммунизированных низкими (< 100 нг) дозами антигена, и в сыворотках пациентов с аллергией на КДП. Известно, что у человека при специфической иммунотерапии повышается уровень IgG^j-АТ, что частично объясняет эффект терапии [27]. Более того, IgG4 выявляют преимущественно в сыворотках больных аллергией [28, 29], тогда как основным субклассом АТ к КДП у здоровых людей является IgGj [28, 29]. Соответственно, в сыворотках больных анализировали уровень IgG4- и IgE-АТ к белку Der f 2. Уровень АТ к Der f 1 в сыворотках больных не оценивали, так как ранее мы показали, что бактериальный белок Der f 1 не связывает IgE человека из-за неправиль-
ной конформации [16]. Как и ранее, полученные результаты продемонстрировали, что у мышей синтез IgE- и IgG-АТ не коррелировал (рис. 6, в, г). Для сывороток больных с аллергией на КДП в рамках малой выборки (n = 3) мы выявили два варианта ответа: у 2 из 3 больных (Б2 и Б3) достоверно выявлялся IgE, но отсутствовал IgG4; у больного Б1 выявили IgG4 и IgE (см. рис. 6). При этом титр IgG4 был низким и достигал 1200, что только в 6 раз отличалось от контрольного пула сывороток доноров.
Имеются работы по анализу содержания IgG4- и IgE-АТ у больных аллергией на КДП [28, 29], в которых с очевидностью показано, что у части из них не обнаруживают IgG4. При этом коэффициент корреляции между уровнем аллер-генспецифических IgG4 и IgE у аллергиков к Der p 1 и Der p 2 составляет 0,4 [28], что показывает отсутствие IgG4 у 60% больных. Таким образом, клинические результаты большой выборке больных, подтверждают полученные нами ограниченные данные и свидетельствуют о том, что у части больных, имеющих специфические IgE, нет продукции специфического IgG4, и наоборот. В модельной ситуации у мышей при иммунизации сверхнизкими дозами аллергенов реализуется только прямой путь переключения В-клеток на синтез IgE. Полученные нами данные совпадют с данными группы E. Kolsch, согласно которым при иммунизации мышей малыми дозами происходит переключение на синтез IgE по прямому пути [13]. Что касается клинических случаев, в работе также показан преимущественно прямой путь переключения на IgE [30]. Таким образом, в нашей модели наблюдался механизм, близкий к имеющему место в клинической ситуации.
На основе наших данных можно предположить нижеследующую схему переключения В-клеток на синтез АТ различных классов. При встрече с большой концентрацией аллергенов (антигенов) в локальном лимфатическом узле и при отсутствии селективных цитокинов, определяемых взаимодействием лигандов с Toll-подобными рецепторами на антигенпредставляющих клетках, В-клетки перестраивают В-клеточный рецептор и меняют изотип АТ в первую очередь на IgG3, ген которого находится в ближайшем положении к генам IgM и IgD (С^-С5-Су3-Су1-Су2Ь-Су2а-Се-Са). По мере дифференцировки В-клеток и пролиферации, необходимой для отбора клонов с высокой аффинностью, В-клетки начинают переключать Fc-фрагмент на другие субклассы и классы АТ: Gp G2a, G2b и A. Переключение осуществляется, по всей видимости, произвольно, о чем свидетельствуют похожая картина времени возникновения, уровень АТ и отсутствие данных АТ при низких дозах аллергена. Отбор успешных клонов зависит от аффинности В-клеточного рецептора к тому или иному эпитопу. В данном конкретном случае IgGj-АТ имели наибольшую аффинность, что и позволило В-клеткам, продуцирующим эти АТ, получить преимущество и вытеснить все другие В-клетки при иммунизации низкими дозами. Наличие В-клеток той же тонкой специфичности, что и продуцирующие IgGj (специфичные к Der f 1 90-101) среди IgG2b- и IgA-продуцирующих В-клеток свидетельствует о существовании общего предшественника. В-клетки, продуцирующие IgG2а, отличались по специфичности, что говорит в пользу теории о поляризации антительного ответа: предпочтительной продукции IgG-АТ при гуморальном ответе, а IgG2a - при клеточном [2]. Формирование IgE-продуцирующих В-клеток не укладывается в общую картину при случайном характере переключения Fc-фрагментов. Соответственно В-клетки, синтезирующие IgE-АТ, должны возникать на стадии случайного переключения Fc-фрагментов и вытесняться высокоаффинными IgGj-продуцирующими клетками. Единственное отличие IgE-АТ от других классов и субклассов состоит в их способности распознавать конформационные эпитопы, тогда как все остальные АТ распознают линейные эпитопы белков.
Выводы. 1. Впервые разработана модель в мышах линии CD1 индукции IgE-АТ к смеси основных аллергенов из КДП D.farinae Der f 1 и Der f 2, основанная на длительном введении аллергенов без адъювантов.
2. Дозы аллергена, вызывающие формирование IgE-АТ, составили 1-10 нг/мышь на (инъекцию)10-15 инъекций, что в 10-100 раз ниже, чем дозы, вызывающие формирование IgG-ответа. В интервале между этими дозами гуморальный ответ не регистрировали, что позволило нам ввести термин «пустое окно».
3. Формирование IgG- и IgE-АТ к белкам Der f 1 и Der f 2 идет независимо и подчиняется единым правилам: титры IgG-АТ нарастали с увеличением дозы аллергенов; титры IgE-АТ появлялись и увеличивались при уменьшении дозы аллергенов.
4. При снижении дозы выявляли доминирующий субкласс IgG - IgGj. АТ класса IgA и субклассов G2a, G2b регулировались сходным образом; IgGj-АГ исчезали из циркуляции первыми при снижении дозы аллергенов.
5. В-клетки, секретирующие IgA, IgG1 и IgG2b, имели общего предшественника и распознавали общий эпитоп Der f 1 90-101. В-клетки, продуцирующие IgG-АТ имели другую специфичность.
Благодарности. Поисковая научно-исследовательская работа проведена в рамках реализации ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы», Госконтракт №16.512.11.2069.
литература
1. Масюк В.С., Хурцилава О.Г. Современные вопросы эпиди-миологиии патогенеза аллергии и атопии у детей и подростков. Педиатрия. 2008; 87 (4): 112-5.
4. Фрейдин М.Б., Брагина Е.Ю., Огородова Л.М., Пузырев В.П. Генетика атопии: современное состояние. Вестник ВОГиС. 2006; 10 (3): 492-503.
5. Гущин И.С. Патофизиология аллергии. Российская ринология. 2004; 1: 6-22.
16. Рязанцев Д.Ю., Дробязина П.Е., Хлгатян С.В., Завриев С.К., Свирщевская Е.В. Экспрессия аллергенов клещей домашней пыли Der f 1 и Der f 2 в листьях Nicotiana benthamiana. Биоорганическая химия. 2014; 40 (4).
Поступила 07.05.14
references
1. Masyuk V.S., Khurtsilava O.G. Modern problems of epidemiology and pathogenesis of allergy and atopy in children and adolescents. Pediatriya. 2008; 87 (4): 112-5 (in Russian).
2. Murphy K., ed. JaneWays Immunobiology. 8th ed. London: Garland Science; 2011.
3. Poulsen L.K., Hummelshoj L. Triggers of IgE class switching and allergy development. Ann. Med. 2007; 39 (6): 440-56.
4. Freydin M.B., Bragina E.Yu., Ogorodova L.M., Puzyrev V.P. Genetics of atopy: current state. Vestnik VOGiS. 2006; 10 (3): 492-503. (in Russian)
5. Gushchin I.S. Pathophysiology of allergy. Rossiyskaya rinologi-ya. 2004; 1: 6-22. (in Russian)
6. Kolbe L., Heusser C.H., Kolsch E. Isotype-associated recognition of allergen epitopes and its modulation by antigen dose. Immunology. 1995; 84: 285-9.
7. Sudowe S., Arps V., Vogel T., Kölsch E. The role of interleukin-4 in the regulation of sequential isotype switch from immunoglobulin G1 to immunoglobulin E antibody production. Scand. J. Immunol. 2000; 51 (5): 461-71.
8. Arps V., Sudowe S., Kölsch E. Antigen dose-dependent differences in IgE antibody production are not due to polarization towards Th1 and Th2 cell subsets. Eur. J. Immunol. 1998. 28 (2): 681-6.
9. Arps V., Kölsch E. The role of interleukin-10 in the generation of CD4+ and CD8+ memory T cells (expressing a CD44+- CD62L-phenotype) and their contribution to the regulation of immuno-globulin E antibody formation. Int. Arch. Allergy Immunol. 2002; 127 (3): 198-207.
10. Bellighausen I., Sudowe S., Konig B., Reske-Kunz A.B., Knop J., Saloga J. Interleukin-10-treated dendritic cells do not inhibit th2 immune responses in ovalbumin/alum-sensitized mice. J. Int. Arch. Allergy Immunol. 2006; 114 (1): 61-9.
11. Germann T., Guckes S., Bongartz M., Dlugonska H., Schmitt E., Kolbe L. et al. Administration of IL-12 during ongoing immune responses fails to permanently suppress and can even enhance the synthesis of antigen-specific IgE. Int. Immunol. 1995; 7 (10): 1649-57.
12. Barwig C., Raker V., Montermann E., Grabbe S., Reske-Kunz A.B., Sudowe S. Antigen dose-dependent suppression of murine IgE responses is mediated by CD4(-)CD8(-) double-negative T cells. Clin. Exp. Allergy. 2010; 40 (6): 891-901.
13. Sudowe S., Rademaekers A., Kölsch E. Antigen dose-dependent predominance of either direct or sequential switch in IgE antibody responses. Immunology. 1997; 91 (3): 464-72.
14. Nelde A., Teufel M., Hahn C., Duschl A., Sebald W., Bröcker E.B. et al. The impact of the route and frequency of antigen exposure on the IgE response in allergy. Int. Arch. Allergy Immunol. 2001; 124 (4): 461-9.
15. Grunewald S.M., Teufel M., Erb K., Nelde A., Mohrs M., Brombacher M. et al. Upon prolonged allergen exposure IL-4 and IL-4Ralpha knockout mice produce specific IgE leading to ana-phylaxis. Int Arch Allergy Immunol. 2001; 125 (4): 322-8.
16. Ryazantsev D.Yu., Drobyazina P.E., Khlgatyan S.V., Zavriev S.K., Svirshchevskaya E.V. Expression of Der f 1 and Der f 2 house dust mite allergens in the leaves of Nicotiana benthamiana. Bioorganicheskaya khimiya. 2014; 40 (4). (in Russian)
17. Billiau A., Matthys P. Modes of action of Freund ' s adjuvants in experimental models of autoimmune diseases. J. Leucoc. Biol. 2001; 70 (12): 849-60.
18. Willart M., Hammad H. Alarming dendritic cells for allergic sensitization. Allergol. Int. 2010; 59 (2): 95-103.
19. Larsen J.E.P., Lund O., Nielsen M. Improved method for predicting linear B-cell epitopes. Immunome Res. 2006; 2 (2): 2-8.
20. Emini E.A., Hughes J.V., Perlow D.S., Boger J. Induction of hepatitis A virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide. J. Virol. 1985; 55 (3): 836-9.
21. Greene W.K., Cyster J.D., Chua K.Y., O'Brien R.M., Thomas W.R. IgE and IgG binding of peptides expressed from fragments of cDNA encoding the major house dust mite allergen Der p I. J. Immunol. 1991; 147 (11): 3768-73.
22. Chua K.Y., Greene W.K., Kehai P., Thomas W.R. IgE binding studies with large peptides expressed from Der p II cDNA constructs. Clin. Exp. Allergy. 1991; 21 (2): 161-6.
23. B0gh K.L., Nielsen H., Eiwegger T., Madsen C.B., Mills E.N.C., Rigby N.M. et al. IgE versus IgG4 epitopes of the peanut allergen Ara h 1 in patients with severe allergy. Mol. Immunol. 2014; 58 (2): 169-76.
24. Meno K.H. Allergen structures and epitopes. Allergy. 2011; 66: 19-21.
25. Kobayashi I., Sakiyama Y., Tame A., Kobayashi K., Matsumoto S. IgE and IgG4 antibodies from patients with mite allergy recognize different epitopes of Dermatophagoides pteronyssinus group II antigen (Der p2). J. Allergy Clin. Immunol. 1996; 97 (2): 638-45.
26. Hong C.-S., Park W. J., Nahm D.H. Measurement of IgE and IgG subclass antibodies to whole body antigen and two major allergens (Der f1 and Der f2) of Dermatophagoides farinae in normal subjects and asthmatics. YonseiMed. J. 1994; 35 (4): 453-63.
27. Wambre E., DeLong J.H., James E.A., Torres-Chinn N., Pfutzner W., Möbs C. et al. Specific immunotherapy modifies allergen-specific CD4(+) T-cell responses in an epitope-dependent manner. J. Allergy Clin. Immunol. 2014; 133 (3): 872-9.
28. Miranda D.O., Silva D.A.O., Fernandes J.F.C., Queiros M.G.J., Chiba H.F., Ynoue L.H. et al. Serum and salivary IgE, IgA, and IgG4 antibodies to Dermatophagoides pteronyssinus and its major allergens, Der p1 and Der p2, in allergic and nonallergic children. Clin. Dev. Immunol. 2011; 1155-66.
29. Tame A., Sakiyama Y., Kobayashi I., Terai I., Kobayashi K. Differences in titres of IgE, IgG4 and other IgG subclass anti-Der p 2 antibodies in allergic and non-allergic patients measured with recombinant allergen. Clin. Exp. Allergy. 1996; 26 (1): 43-9.
30. Stoep N. van Der, Korver W., Logtenberga T. In vivo and in vitro isotype switching in human B lymphocytes: evidence for a predominantly direct IgM to IgE switch program. Eur. J. Immunol. 1994; 24: 1307-11.
Received 07.05.14
