CC BY
94
2017, Т. 159, кн. 1 С. 72-84
УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. СЕРИЯ ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ
ISSN 2542-064X (Print) ISSN 2500-218X (Online)
УДК 577.15
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРИРОДНЫХ ИЗОЛЯТОВ МИКРОМИЦЕТОВ Fusarium spp. - ПРОДУЦЕНТОВ ЛИГНОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ
И.В. Дармов, Е.И. Горшунова, Т.С. Тарасова
Вятский государственный университет, г. Киров, 610000, Россия
Аннотация
Из объектов окружающей среды в Кировской области выделены и идентифицированы природные изоляты микромицетов: F. culmorum, штамм 3, F. sporotrichioides, штамм 12, и F. solani, штамм 52, способные к деградации лигнина древесины и несущие генетические детерминанты одновременно всех трех основных лигнолитических ферментов - лакказы, марганецпероксидазы и лигнинпероксидазы. Исследовали динамику активности указанных ферментов в супернатантах культуральной жидкости при глубинном выращивании микромицетов. По продукции лакказы и марганецпероксидазы два штамма микромицетов - F. culmorum 3 и F. sporotrichioides 12 - практически не уступали базидиомицету T. versicolor, а по среднему уровню активности лигнинпероксидазы в одинаковых условиях культивирования штамм F. sporotrichioides 12 в 2.7 раза превосходил T. versicolor. По способности к накоплению биомассы при глубинном выращивании на богатой и синтетических средах разные штаммы фузариев превосходили базидиомицет T. versicolor в среднем в 1.5-1.7 раза либо достоверно не отличались от него. Все микромицеты секретировали лакказу, марганецпероксидазу и лигнинперок-сидазу в среду выращивания; выход ферментов в культуральную жидкость достигал в среднем 75.5-91.9%. Таким образом, показана перспективность использования мик-ромицетов - представителей рода Fusarium в качестве продуцентов лигнолитических ферментов, а также необходимость дальнейших исследований их биотехнологического потенциала.
Ключевые слова: микромицеты, Fusarium spp., глубинное выращивание, секреция лигнолитических ферментов, лакказа, марганецпероксидаза, лигнинпероксидаза
Введение
Наиболее эффективными деструкторами лигнина считаются базидиомицеты, вызывающие белую гниль древесины [1]. Их способность разрушать лигноцел-люлозные субстраты обусловлена наличием лигнолитического комплекса, в состав которого входят гидролитические и окислительно-восстановительные ферменты, в том числе лакказы, марганецпероксидазы и лигнинпероксидазы [2].
Лакказа (КФ1.10.3.2) - медьсодержащий гликопротеин, катализирующий окисление полифенолов и полиаминов, некоторых неорганических ионов в реакции восстановления молекулярного кислорода до воды [3].
Марганецпероксидаза (КФ .1.11.1.13) - гликопротеин, содержащий гем в качестве кофактора. Фермент осуществляет окисление ионов Мп2+ до Мп3+
в присутствии пероксида водорода, которые, в свою очередь, окисляют производные фенола, гидроксилируют ароматические соединения [4].
Лигнинпероксидаза (КФ1.11.1.14) - гемсодержащий гликопротеин, катализирующий расщепление С-С-связей в полимерных молекулах лигнина, окисление бензиловых спиртов и метильных групп в бензиловых соединениях, раскрытие ароматического кольца [5].
Наличие у лигнолитических ферментов базидиомицетов высокого окислительно-восстановительного потенциала явилось основанием для разработки на их основе перспективных способов утилизации отходов лесозаготовки и растениеводства, делигнификации бумажной пульпы, биоотбеливания тканей, получения древесноволокнистых плит и др. [6-8], однако в промышленных масштабах соответствующие технологии практически не используются. Это связано с тем, что базидиомицеты требовательны к источникам питания, медленно растут при глубинном культивировании, их мицелий чувствителен к механическим воздействиям [9], а твердофазное выращивание с трудом поддается масштабированию.
Многих из перечисленных выше проблем можно избежать, применяя для деградации лигнина ферменты микромицетов, менее требовательных к условиям культивирования и составу питательных сред. В целом макромицеты уступают микромицетам по таким показателям, как скорость роста и содержание белка, поэтому использование последних для биоконверсии может оказаться экономически более выгодным даже при меньшей способности к деградации лигнина по сравнению с базидиомицетами.
Известно, что деструкцию лигнина древесины могут осуществлять различные представители несовершенных и сумчатых грибов, в частности Trichoderma, Fusarium, Aspergillus, Pénicillium и др. [10-12], однако спектр продуцируемых ими ферментов лигнолитического комплекса, уровень их активности, локализация в клетке и т. д. изучены недостаточно, что не позволяет в полной мере оценить лигнолитический потенциал микромицетов.
Методом накопительных культур нами были выделены из объектов окружающей среды в Кировской области природные изоляты микромицетов, представители рода Fusarium, способные к деградации лигнина древесины; необходимо было оценить возможность их использования в качестве продуцентов лигнолитических ферментов.
Цель настоящего исследования - оценка способности природных изолятов Fusarium продуцировать лакказу, марганецпероксидазу и лигнинпероксидазу, определение уровня активности указанных ферментов в культуральной жидкости и клеточной массе продуцентов.
1. Материалы и методы
Объект исследования. Природные изоляты микромицетов - активных деструкторов лигнина древесины - были выделены нами из образцов лесных почв в окрестностях г. Кирова. Для углубленного изучения были отобраны три изоля-та, у которых с использованием полимеразной цепной реакции и праймеров, охарактеризованных в статье [13], были выявлены генетические детерминанты
всех основных лигнолитических ферментов: лакказы, марганецпероксидазы и лигнинпероксидазы.
Оценку способности микромицетов к деградации лигнина проводили весовым методом при твердофазном выращивании на еловых опилках, как описано в [11]. Убыль лигнина древесины после выращивания выбранных микроорганизмов в течение 8 сут на данной среде при температуре 27 °С составляла 910%.
Видовую идентификацию микромицетов проводили с использованием соответствующих определителей [14, 15]. Для исследования морфологии микроорганизмов использовали микроскоп Primo Star фирмы Carl Zeiss (Германия). На основании изучения морфологии колоний, выращенных на плотных питательных средах, микроскопического строения мицелия и конидий определили видовую принадлежность изолятов: Fusarium culmorum (Wm.G.Sm.) Sacc., штамм 3; Fusarium sporotrichioides Sherb., штамм 12 и Fusarium solani (Mart.) Sacc., штамм 52. Все штаммы хранятся в коллекции микробных культур Вятского государственного университета.
В качестве положительного контроля в работе использовали базидиомицет Trametes versicolor, штамм Tv, который продуцирует все три основных лигнолитических фермента [14].
Условия выращивания микромицетов. Использовались следующие жидкие питательные среды: среда Чапека - Докса (%): (NaNO3 - 0.3; K2HPO4 -0.1; MgSO4-7H2O - 0.05; KCl - 0.025; FeSO4-7H2O - 0.001; сахароза - 3.0); среда Чапека - Докса c добавлением лигнина или танина в конечной концентрации 0.5%; среда на основе овсяного отвара [16]. Исходное значение рН питательных сред - 5.8.
Для приготовления посевной культуры грибы выращивали на агаризован-ной среде Чапека - Докса в чашках Петри в течение 8-10 сут при температуре 27 °С. Агаровыми блоками (диаметр 8 мм), вырезанными из зоны роста колонии соответствующего штамма, осуществляли засев жидких сред в конических колбах объемом 200 мл, объем среды - 50 мл. Культивирование проводили при температуре 27 °С на шуттель-аппарате (200 качаний/мин) в течение 15 сут. В процессе выращивания оценивали активность исследуемых ферментов в су-пернатанте культуральной жидкости.
Содержание биомассы в культуральной жидкости определяли весовым способом, в пробах объёмом 5 мл, по абсолютно сухой массе.
Определение активности лигнолитических ферментов в среде культивирования. В процессе выращивания штаммов в жидкой среде через определенные промежутки времени отбирали пробы нативной культуры, осаждали мицелий центрифугированием (12 тыс. g, 10 мин) и в супернатанте оценивали спектрофотометрически скорость образования продуктов ферментативных реакций.
Определение лакказной активности осуществляли по методу [17] с использованием в качестве хромогенного субстрата 10 мМ раствора пирокатехина (^ 410 нм, в 740 М-1 см-1) в 0,1 М Na-ацетатном буфере (рН 4.5). Марганецпе-роксидазную активность измеряли, используя в качестве субстрата Мп2+ в виде 0.1 М раствора MnS04 в 0.1 М Na-тартратном буфере (рН 5.0) в присутствии
0.1 мМ раствора перекиси водорода (X 238 нм, s 6500 М-1см-1) [18]. Активность лигнинпероксидазы определяли в присутствии 8 мМ раствора 2,2'-аминобис-3-этилбензотиазолин-6-сульфоната (ABTS) (X 436 нм, s 36000 М-1 см1) и 1 мМ раствора перекиси водорода в 0.1 М Na-ацетатном буфере (рН 4.5) в анаэробных условиях [19].
Растворы готовили с использованием деионизированной воды, полученной на установке Arium 611 UV (Sartorius, Германия). Регистрацию оптической плотности реакционных смесей осуществляли на спектрофотометре SmartSpec Plus, (Bio-Rad Laboratories, США). За единицу активности (А) принимали количество соответствующего фермента, катализирующее окисление 1 мкМ субстрата за 1 мин, в пересчете на 1 мл культуральной жидкости.
Для сравнения уровней внеклеточной и общей активностей лигнолитиче-ских ферментов на 5-е, 7-е, 9-е и 11-е сутки выращивания отбирали по 3 мл на-тивной культуры, центрифугировали в течение 10 мин с ускорением 12 тыс. g. Надосадочную жидкость декантировали; осадок (мицелий) ресуспендировали в 1 мл дистиллированной воды, замораживали жидким азотом и растирали в фарфоровой ступке с кварцевым песком; объём гомогената доводили до исходного объема дистиллированной водой.
Измерение ферментативной активности проводили параллельно в суперна-танте и гомогенате клеточного осадка, как описано выше. Полученные данные суммировали, определяли общую активность и рассчитывали процент внеклеточной активности.
В работе использовали пирокатехин и ABTS производства Fluka (Швеция); остальные реактивы - отечественные, квалификации «х.ч.» и «ч.д.а.».
Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами, рассчитывая средние арифметические и доверительные интервалы с уровнем вероятности 0.95 по трем независимым экспериментам. Все измерения осуществляли в трех аналитических повторностях.
2. Результаты и их обсуждение
Динамику активности лигнолитических ферментов в супернатантах куль-туральной жидкости исследовали при выращивании микромицетов в четырех жидких средах. В качестве основных сред использовали синтетическую среду Чапека - Докса и богатую среду на основе овсяного отвара. Кроме того, были взяты варианты среды Чапека - Докса с добавлением лигнина или танина в качестве возможных индукторов синтеза лигнолитических ферментов.
На рис. 1-3 представлены данные по активности лакказы, марганецперок-сидазы и лигнинпероксидазы в тех средах выращивания, где был зафиксирован максимальный уровень активности соответствующего фермента.
Как видно из рис.1-3, зависимость ферментативной активности от времени носила более или менее выраженный периодический характер. Так, при культивировании F. culmorum 3 и T. versicolor наблюдались два пика активности лакказы: на 7-е, 13-е и 7-е, 11-е сутки соответственно (рис. 1). Марганецпероксидаза в культуральной жидкости всех исследуемых штаммов грибов, за исключением F. solani 52, была наиболее активна на 5-е и 9-е сутки; у F. solani 52 выявлен один
А, ед./мл
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
11
13
15
сутки
Рис. 1. Динамика активности лакказы в супернатанте культуральной жидкости штаммов-продуцентов: 1 - F.culmorum 3; 2 - F.solani 52; 3 - F.sporotrichioides 12; 4 -T. versicolor (контроль). Среда Чапека - Докса с лигнином
А, ед./мл
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
11
13 15
сутки
Рис. 2. Динамика активности марганецпероксидазы в супернатанте культуральной жидкости штаммов-продуцентов: 1 - F. culmorum 3; 2 - F. solani 52; 3 -F. sporotrichioides 12; 4 - T. versicolor (контроль). Среда Чапека - Докса с танином
25
А, ед./мл
20
15
10
5
11
13
15
сутки
Рис. 3. Динамика активности лигнинпероксидазы в супернатанте культуральной жидкости штаммов-продуцентов: 1 - F. culmorum 3; 2 - F.solani 52; 3 - F. sporotrichioides 12; 4 - T. versicolor (контроль). Среда на основе овсяного отвара
0
3
5
7
9
0
9
5
7
5
0
0
3
7
9
Табл. 1
Максимальная активность лакказы в среде выращивания штаммов-продуцентов, ед./мл
Штамм-продуцент Среда
Чапека -Докса Чапека -Докса с лигнином Чапека -Докса с таннином на основе овсяного отвара
F. culmorum 3 7.0 ± 0.7 80.0 ± 7.6 15.0 ± 1.4 9.0 ± 0.8
F. solani 52 3.6 ± 0.3 8.4 ± 0.8 10.9 ± 0.9 0.8 ± 0.1
F. sporotrichioides 12 2.1 ± 0.2 8.3 ± 0.8 19.0 ± 1.7 12.1 ± 1.1
T. versicolor (контроль) 3.4 ± 0.4 92.0 ± 8.0 1.5 ± 0.2 4.8 ± 0.5
Табл. 2
Максимальная активность марганецпероксидазы в среде выращивания штаммов-продуцентов, ед./мл
Штамм-продуцент Среда
Чапека -Докса Чапека -Докса с лигнином Чапека -Докса с таннином на основе овсяного отвара
F. culmorum 3 57.2 ± 6.7 27.0 ± 3.6 34.1 ± 4.2 3.7 ± 0.3
F. solani 52 5.7 ± 0.7 30.0 ± 3.9 5.7 ± 0.8 17.0 ± 1.9
F. sporotrichioides 12 5.8 ± 0.8 8.9 ± 1.2 64.0 ± 6.5 6.7 ± 0.9
T. versicolor (контроль) 2.1 ± 0.2 3.4 ± 0.4 73.5 ± 7.6 8.3 ± 0.9
Табл. 3
Максимальная активность лигнинпероксидазы в среде выращивания штаммов-продуцентов, ед./мл
Штамм-продуцент Среда
Чапека -Докса Чапека -Докса с лигнином Чапека -Докса с таннином на основе овсяного отвара
F. culmorum 3 2.7 ± 0.42 4.8 ± 0.52 0.2 ± 0.02 5.1 ± 0.63
F. solani 52 0.1 ± 0.01 0.6 ± 0.07 0.2 ± 0.03 5.0 ± 0.61
F. sporotrichioides 12 0.1 ± 0.02 0.1 ± 0.01 0.1 ± 0.02 21.8 ± 2.41
T. versicolor (контроль) 0.1 ± 0.01 4.1 ± 0.53 0.1 ± 0.01 8.1 ± 0.92
пик активности, на 7-е сутки (рис. 2). У того же микромицета максимальная активность лигнинпероксидазы отмечалась на 5-е и 9-е сутки, у остальных штаммов удалось зарегистрировать только один пик - на 11-е или 13-е сутки (рис. 3). Подобный вид кривые активности лигнолитических ферментов в супернатантах культуральной жидкости имели и при выращивании грибов на остальных вариантах питательных сред (данные не представлены). Периодический характер активности лигнолитических ферментов грибов в среде выращивания, вероятнее всего, связан с их протеолитической деградацией в разные фазы роста [11].
В табл. 1 -3 представлены усредненные максимальные значения ферментативной активности изучаемых штаммов фузариев, полученные на протяжении всего периода культивирования, в сравнении с максимумами активности изучаемых ферментов в супернатантах мицелиальной культуры T. versicolor. Как следует из табл. 1, максимальная среди штаммов фузариев лакказная активность
Табл. 4
Внеклеточная активность лигнолитических ферментов, секретируемых штаммами мик-ромицетов в культуральную жидкость, %
Штамм-продуцент Фермент
Лакказа Марганецпер-оксидаза Лигнинпер-оксидаза
F. culmorum 3 91.9 ± 10.2 84.9 ± 10.1 79.9 ± 9.8
F. solani 52 76.8 ± 9.9 75.5 ± 9.8 80.7 ± 10.9
F. sporotrichioides 12 79.6 ± 10.3 78.2 ± 10.2 83.1 ± 9.6
T. versicolor (контроль) 80.4 ± 11.7 83.7 ± 9.7 85.2 ± 9.8
Примечание. Представлены усредненные значения по трем видам питательных сред (Чапека - Докса с танином, Чапека-Докса с лигнином и на основе овсяного отвара) и по выбранным срокам исследования (на 5-е, 7-е, 9-е и 11-е сутки)
наблюдалась у F. culmorum 3 при культивировании в среде Чапека с лигнином, она была сопоставима с пиком лакказной активности базидиомицета T. versicolor на той же среде. Лигнин, добавленный в среду Чапека - Докса до конечной концентрации 0.5%, приводил к повышению более чем на порядок лакказной активности в среде выращивания F. culmorum 3 и контрольного штамма T. versicolor, но не оказывал такого выраженного действия на остальные штаммы фузариев. Танин в концентрации 0.5% был менее эффективен при использовании в качестве индуктора лакказы, чем лигнин, по отношению к F. culmorum 3 и T. versicolor.
Максимальная среди микромицетов марганецпероксидазная активность, рассчитанная по средним значениям, была выявлена у F. sporotrichioides 12 при культивировании в среде Чапека - Докса с танином (см. табл. 2). Она была близка к таковой контрольного штамма базидиомицета в той же среде. Наиболее сильным индуктором синтеза фермента по отношению к названным штаммам оказался танин. В то же время необходимо отметить, что согласно рассчитанным доверительным интервалам величины максимальной активности данного фермента у штамма F. sporotrichioides 12 при культивировании в среде Чапека - Докса с танином и у штамма F. culmorum 3 в среде Чапека - Докса без добавок статистически значимо не различались, причем танин, как и лигнин в выбранной концентрации обладали некоторым ингибирующим действием на продукцию марганецпероксидазы штаммом F. culmorum 3.
Максимальная лигнинпероксидазная активность наблюдалась при культивировании F. sporotrichioides 12 на богатой среде, приготовленной на основе овсяного отвара, средняя величина этой активности в 2.7 раза превышала таковую контрольного штамма базидиомицета при выращивании на той же среде (см. табл. 3). При выращивании культур на среде Чапека - Докса как в присутствии танина или лигнина, так и без них активность лигнинпероксидазы была низкой или не выявлялась.
В ходе исследования была также определена способность штаммов-продуцентов к секреции ферментов в культуральную жидкость. Как следует из данных табл. 4, средняя внеклеточная активность лигнолитических ферментов составляла от 75.5% до 91.9% их средней суммарной (вне- и внутриклеточной) активности.
Табл. 5
Накопление биомассы при глубинном культивировании штаммов-продуцентов в разных питательных средах (на 15-е сутки), мг/мл
Штамм-продуцент Среда
Чапека -Докса Чапека -Докса с лигнином Чапека -Докса с таннином на основе овсяного отвара
F. culmorum 3 19.1 ± 2.2 18.0 ± 2.0 18.9 ± 2.1 24.8 ± 2.4
F. solani 52 16.3 ± 1.8 17.5 ± 1.9 16.7 ± 1.8 18.5 ± 2.0
F. sporotrichioides 12 18.4 ± 1.8 20.8 ± 2.2 18.5 ± 1.9 20.3 ± 2.1
T. versicolor (контроль) 11.0 ± 1.2 13.1 ± 1.5 12.8 ± 1.5 16.7 ± 1.7
В табл. 5 представлены результаты определения средних значений содержания сухой биомассы штаммов-продуцентов в нативной культуре по окончании срока выращивания (на 15-е сутки). Из сравнения полученных средних величин следует, что по способности к накоплению биомассы на синтетических средах изучаемые фузарии превосходят контрольный штамм базидиомицета в 1.5-1.7 раза. При выращивании на богатой питательной среде на основе овсяного отвара один из штаммов фузариев - F. culmorum 3 - накапливал биомассу в среднем в 1.5 раза интенсивнее по сравнению с базидиомицетом, а два других достоверно не отличались по этому показателю от референс-штамма.
Заключение
В работе выделены природные изоляты микромицетов, имеющие генетические детерминанты лакказы, марганецпероксидазы и лигнинпероксидазы и способные к деструкции лигнина древесины, которые по культурально-морфо-логическим особенностям и микроскопическому строению идентифицированы как F. culmorum, штамм 3, F. sporotrichioides, штамм 12 и F. solani, штамм 52.
По продукции лакказы и марганецпероксидазы при глубинном выращивании два штамма микромицетов - F. culmorum 3 и F. sporotrichioides 12 - практически не уступали базидиомицету T. versicolor, а по среднему уровню активности лигнинпероксидазы в одинаковых условиях культивирования штамм F. sporotrichioides 12 в 2.7 раза превосходил T. versicolor. При этом по способности к накоплению биомассы на богатой и синтетических средах фузарии превосходили базидиомицет T. versicolor в среднем в 1.5-1.7 раза либо достоверно не отличались от него.
Все изученные штаммы-продуценты секретировали лакказу, марганецпе-роксидазу и лигнинпероксидазу в среду выращивания при глубинном культивировании; выход ферментов в культуральную среду составлял в среднем от 75.5% до 91.9%, что облегчает их выделение и очистку.
Полученные нами результаты согласуются с данными работы [20], в которой показано, что при выращивании на богатых питательных средах с багассой и опилками в качестве источников углерода неидентифицированный базидио-мицет и ряд почвенных микромицетов, включая Fusarium spp., проявляли одинаково высокие уровни лигнолитической активности.
В другой работе [21] сообщается, что при глубинном культивировании штамма F. solani F-552 максимальные уровни активности лакказы, марганецпе-роксидазы и лигнинпероксидазы в культуральной жидкости достигали 12.04, 21.67 и 77.42 ед./мл соответственно. Выделенный нами штамм F. solani 52 по уровню продукции лакказы и марганецпероксидазы сопоставим с F. solani F-552, хотя и существенно уступает ему по продукции лигнинпероксидазы. В то же время изученные нами штаммы F. culmorum 3 и F. sporotrichioides 12 превосходят F. solani F-552 по среднему уровню активности лакказы и марганецпероксидазы в 6.7 и 2.9 раза соответственно и приближаются к нему по активности лигнинпероксидазы.
В этой же работе впервые сообщается о штамме F. solani, который способен продуцировать одновременно все три основных лигнолитических фермента. Результаты наших исследований подтверждают эти сведения в отношении F. solani и позволяют дополнить перечень перспективных продуцентов ещё двумя видами фузариев.
Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования микромицетов - представителей рода Fusarium в качестве продуцентов лигнолитических ферментов и указывают на необходимость дальнейших исследований их биотехнологического потенциала.
Литература
1. Рабинович М.Л., Болобова А.В., Кондращенко В.И. Теоретические основы биотехнологии древесных композитов. Т. 1: Древесина и разрушающие её грибы. - М.: Наука, 2001. - 264 с.
2. Федорова Т.В., Шахова Н.В., Кляйн О.И., Глазунова О.А., Малошенок Л.Г., Куликова Н.А., Псурцева Н.В., Королева О.В. Сравнительный анализ лигнолитического потенциала базидиальных грибов, принадлежащих к различным таксономическим и экологическим группам // Прикл. биохимия и микробиология. - 2013. - Т. 49, № 6. - С. 570-579. - doi: 10.7868/0555109913060081.
3. Yaropolov A.I., Skorobogat'ko O.V., Vartanov S.S., Varfolomeyev S.D. Laccase: Properties, catalytic mechanism and applicability // Appl. Biochem. Biotechnol. - 1994. - V. 49, No 3. -P. 257-280. - doi: 10.1007/BF02783061.
4. Karhunen E., Kantelinen A., Niku-Paavola M.-L. Mn-dependent peroxidase from the lig-nin-degrading white rot fungus Phlebia radiata // Arch. Biochem. Biophys. - 1990. -V. 279, No 1. - P. 25 -31. - doi: 10.1016/0003-9861(90)90458-B.
5. Sarkanen S., Razal R.A., Piccariello T., Yamamoto E., Lewis N.G. Lignin peroxidase: Toward a clarification of its role in vivo // J. Biol. Chem. - 1991. - V. 266, No 6. -P. 3636-3643.
6. Степанова Е.В., Королева О.В., Васильченко Л.Г., Карапетян К.Н., Ландесман Е.О., Явметдинов И.С., Козлов Ю.П., Рабинович М.Л. Разложение овсяной соломы грибами при жидкофазном и твердофазном культивировании // Прикл. биохимия и микробиология. - 2003. - Т. 39, № 1. - С. 74-84.
7. Addleman K., Archibald F. Kraft pulp bleaching and delignification by dikaryons and monokaryons of Trametes versicolor // Appl. Environ. Microbiol. - 1993. - V. 59, No 1. -P. 266-273.
8. Пат. 2017770 РФ. Пресс-масса для изготовления древесных плит / Соломатов В.И., Черкасов В.Д., Селяев В.П., Русаков В.А., Прыткова Т.Н., Трохин В.И. -№ 5049524/05; заявл. 24.06.1992; опубл. 15.08.1994, Бюл. № 15. - 5 с.
9. Русинова Т.В. Разработка технологии биосинтеза фермента лакказы базидиальны-ми грибами рода Trametes: Автореф. дис. ... канд. техн. наук. - М., 2007. - 20 с.
10. Рабинович М.Л., Болобова А.В., Васильченко Л.Г. Разложение природных ароматических структур и ксенобиотиков грибами (обзор) // Прикл. биохимия и микробиология. - 2004. - Т. 40, № 1. - С. 5-23.
11. Мокрушина Н.С., Тарасова Т.С., Дармов И.В. Биоконверсия древесных отходов методом компостирования с получением органического удобрения // Изв. Сам. научн. центра РАН. - 2009. - Т. 11, № 1. - С. 228-232.
12. Пат. 2355753 РФ. Штамм Penicillium sizovae - деструктор лигнина древесины / Мокрушина Н.С., Дармов И.В.. - № 2007126013/13; заявл. 09.07.2007; опубл. 20.05.2009, Бюл. № 14. - 7 с.
13. Шевченко Е.А., Бессолицына Е.А., Дармов И.В. Выявление генов, кодирующих лигно-литические ферменты, у природных изолятов базидиомицетов // Прикл. биохимия и микробиология. - 2013. - Т. 49, № 3. - С. 285-291. - doi: 10.7868/S055510991303015X.
14. Литвинов М.А. Определитель микроскопических почвенных грибов. - Л.: Наука, 1967. - 303 с.
15. Саттон Д., Фотергилл А., Ринальди М. Определитель патогенных и условно патогенных грибов. - М.: Мир, 2001. - 468 с.
16. Методы экспериментальной микологии / Ред. В.И. Билай. - Киев: Наукова думка, 1973. - 242 с.
17. Королева О.В., Явметдинов И.С., Шлеев С.В., Степанова Е.В., Гаврилова В.П. Выделение и изучение некоторых свойств лакказы из базидиального гриба Cerrena maxima // Биохимия. - 2001. - Т. 66, Вып. 6. - С. 762-767.
18. Paszczynski A., Crawford R.L., Huynh V.-B. Manganese peroxidase of Phanerochaete chrysosporium: Purification // Methods Enzymol. - 1988. - V. 161. - P. 264-270. - doi: 10.1016/0076-6879(88)61028-7.
19. Никитина О.В., Шлеев С.В., Горшина Е.С., Русинова Т.В., Сереженков В.А., Бурба-ев Д.Ш., Беловолова Л.В., Ярополов А.И. Выделение и очистка ферментов лигноли-тического комплекса базидиального гриба Trametes риЬе^'сет (Schumach.) Pilat и исследование их свойств // Биохимия. - 2005. - Т. 70, Вып. 11. - С. 1548-1555.
20. Pavarina E.C., Durrant L.R. Growth of lignocellulosic-fermenting fungi on different substrates under low oxygenation conditions // Appl. Biochem. Biotechnol. - 2002. -V. 98-100. - P. 663-677.
21. Obruca S., Marova I., Matouskova P., Haronikova A., Lichnova A. Production of ligno-cellulose-degrading enzymes employing Fusarium solani F-552 // Folia Microbiol. (Prague). - 2012. - V. 57, No 3. - Р. 221-227. - doi: 10.1007/s12223-012-0098-5.
Поступила в редакцию 28.12.16
Дармов Илья Владимирович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии
Вятский государственный университет
ул. Московская, д. 36, г. Киров, 610000, Россия E-mail: [email protected]
Горшунова Екатерина Игоревна, аспирант кафедры микробиологии Вятский государственный университет
ул. Московская, д. 36, г. Киров, 610000, Россия E-mail: [email protected]
Тарасова Татьяна Сергеевна, заведующий лабораторией кафедры микробиологии
Вятский государственный университет
ул. Московская, д. 36, г. Киров, 610000, Россия E-mail: [email protected]
ISSN 2542-064X (Print) ISSN 2500-218X (Online)
UCHENYE ZAPISKI KAZANSKOGO UNIVERSITETA. SERIYA ESTESTVENNYE NAUKI (Proceedings of Kazan University. Natural Sciences Series)
2017, vol. 159, no. 1, pp. 72-84
The Study of Natural Isolates of Fusarium spp. Micromycetes - Ligninolytic Enzymes Producers
I.V. Darmov , E.I. Gorshunova , T.S. Tarasovа Vyatka State University, Kirov, 610000 Russia E-mail: [email protected], [email protected], [email protected]
Received December 28, 2016 Abstract
It is known that many basidiomycetes, white rot agents of wood in particular, produce ligninolytic complex enzymes, the most important of which are laccase, manganese peroxidase, and lignin peroxidase. Using these basidiomycete enzymes, promising methods have been developed for disposal of logging and plant farming wastes, paper stock delignification, cloth bio-bleaching, and production of wooden fibreboards; however, these techniques are not commonly applied on an industrial scale. It should be noted that wood lignin can be also destructed by various micromycetes, such as Fusarium, Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, etc. Nevertheless, the range of ligninolytic complex enzymes produced by them, as well as the level of their activity and localization in a cell, have been studied insufficiently. Thus, it is not possible to fully appreciate the ligninolytic potential of micromycetes. The purpose of this research is to evaluate the ability of natural isolates of Fusarium spp. to produce laccase, manganese peroxidase, and lignin peroxidase. Furthermore, the level of activity of these enzymes in the culture liquid and cell mass of producers has been determined.
The following natural isolates of micromycetes have been isolated and identified from natural environments of the Kirov region: F. culmorum, strain 3, F. sporotrichioides, strain 12, and F. solani, strain 52, all capable of degradation of wood lignin and carrying simultaneously genetic determinants of all the three major ligninolytic enzymes - laccase, manganese peroxidase, and lignin peroxidase. We have studied the dynamics of the activity of these enzymes in the culture liquid supernatants at deep micromycete cultivation. The enzyme activity has been determined by the spectrophotometric method. In terms of laccase and manganese peroxidase production, two micromycete strains - F. culmorum 3 and F. sporotrichioides 12 -have been almost as good as the basidiomycete T. versicolor. According to lignin peroxidase production under the same conditions of cultivation, F. sporotrichioides 12 has been 2.7 times better than T. versicolor. Regarding the ability to accumulate biomass in case of deep cultivation on rich and synthetical media, Fusarium has turned out to be 1.5-1.7 times better than T. versicolor. All micromycetes have been shown to secrete laccase, manganese peroxidase, and lignin peroxidase into the culture medium; the enzyme output in culture liquid has been up to 75.5-91.9%. Therefore, it has been demonstrated that Fusarium micromycetes are promising producers of ligninolytic enzymes, further investigation of their biotechnological potential is needed.
Keywords: micromycetes, Fusarium spp., deep cultivation, secretion of ligninolytic enzymes, laccase, manganese peroxidase, lignin peroxidase
Figure Captions
Fig. 1. Dynamics of laccase activity in the culture liquid supernatant of producing strains: 1 - F. culmorum 3; 2 - F. solani 52; 3 - F. sporotrichioides 12; 4 - T. versicolor (control). The Czapek-Dox culture medium with lignin.
Fig. 2. Dynamics of manganese peroxidase activity in the culture liquid supernatant of producing strains: 1 - F. culmorum 3; 2 - F. solani 52; 3 - F. sporotrichioides 12; 4 - T. versicolor (control). The Czapek-Dox culture medium with tannin.
Fig. 3. Dynamics of lignin peroxidase activity in the culture liquid supernatant of producing strains: 1 -F. culmorum 3; 2 - F. solani 52; 3 - F. sporotrichioides 12; 4 - T. versicolor (control). The oat decoction culture medium.
References
1. Rabinovich M.L., Bolobova A.V., Kondrashchenko V.I. Theoretical Foundations of the Biotechnology of Woody Composites. Vol. 1. Wood and Wood-Destroying Fungi. Moscow, Nauka, 2001. 264 p. (In Russian)
2. Fedorova T.V., Shakhova N.V., Klein O.I., Glazunova O.A., Maloshenok L.G., Kulikova N.A., Psurtseva N.V., Koroleva O.V. Comparative analysis of the ligninolytic potential of basidiomy-cetes belonging to different taxonomic and ecological groups. Appl. Biochem. Microbiol., 2013, vol. 49, no. 6, pp. 570-580. doi: 10.1134/S0003683813060082.
3. Yaropolov A.I., Skorobogat'ko O.V., Vartanov S.S., Varfolomeyev S.D. Laccase: Properties, catalytic mechanism, and applicability. Appl. Biochem. Biotechnol., 1994, vol. 49, no. 3, pp. 257-280. doi: 10.1007/BF02783061.
4. Karhunen E., Kantelinen A., Niku-Paavola M.-L. Mn-dependent peroxidase from the lignin-degrading white rot fungus Phlebia radiata. Arch. Biochem. Biophys., 1990, vol. 279, no. 1, pp. 25-31. doi: 10.1016/0003-9861(90)90458-B.
5. Sarkanen S., Razal R.A., Piccariello T., Yamamoto E., Lewis N.G. Lignin peroxidase: Toward a clarification of its role in vivo. J. Biol. Chem., 1991, vol. 266, no. 6, pp. 3636-3643.
6. Stepanova E.V., Koroleva O.V., Vasilchenko L.G., Karapetyan K.N., Landesman E.O., Yavmetdi-nov I.S., Kozlov Yu.P., Rabinovich M.L. Fungal decomposition of oat straw during liquid and solidstate fermentation. Appl. Biochem. Microbiol., 2003, vol. 39, no. 1, pp. 65-74. doi: 10.1023/A:1021702211169.
7. Addleman K., Archibald F. Kraft pulp bleaching and delignification by dikaryons and monokaryons of Trametes versicolor. Appl. Environ. Microbiol., 1993, vol. 59, no. 1, pp. 266-273.
8. Solomatov V.I., Cherkasov V.D., Selyaev V.P., Rusakov V.A., Prytkova T.N., Trokhin V.I. Pressed pulp for preparing woody plates. Patent RF no. 2017770. Byull. Izobret., 1994, no. 15. 5 p. (In Russian)
9. Rusinova T.V. Development of a technology for laccase enzyme biosynthesis by basidiomycetes from the genus Trametes. Extended Abstract of Cand. Eng. Sci. Diss. Moscow, Gos. Nauchno-Issled. Inst. Biosint. Belkovykh Veshchestv, 2007. 20 p. (In Russian)
10. Rabinovich M.L., Bolobova A.V., Vasil'chenko L.G. Fungal decomposition of natural aromatic structures and xenobiotics: A review. Appl. Biochem. Microbiol., 2004, vol. 40, no. 1, pp. 1-17. doi: 10.1023/B:ABIM.0000010343.73266.08.
11. Mokrushina N.S., Tarasova T.S., Darmov I.V. Bioconversion of wood wastes by the method of composting with receiving organic fertilizer. Izv. Samar. Nauchn. Tsentra Ross. Akad. Nauk., 2009, vol. 11, no. 1, pp. 228-232. (In Russian)
12. Mokrushina N.S., Darmov I.V. Penicillium sizovae strain - decomposer of wood lignin. Patent RF no. 2355753. Byull. Izobret., 2009, no. 14. 7 p. (In Russian)
13. Shevchenko E.A., Bessolitsyna E.A., Darmov I.V. Identification of genes encoding ligninolytic enzymes in naturally occurring basidiomycete isolates. Appl. Biochem. Microbiol., 2013, vol. 49, no. 3, pp. 280-286. doi: 10.1134/S0003683813030150.
14. Litvinov M.A. Guide to Microscopic Soil Fungi. Leningrad, Nauka, 1967. 303 p. (In Russian)
15. Sutton D.A., Fothergill A.W., Rinaldi M.G. Guide to Clinically Significant Fungi. Baltimore, Williams and Wilkins, 1998. 471 p.
16. Bilai V.I. (Ed.) Methods of Experimental Mycology. Kiev, Naukova Dumka, 1973. 242 p. (In Russian)
17. Koroleva O.V.., Yavmetdinov I.S., Shleev S.V., Stepanova E.V., Gavrilova V.P. Isolation and study of some properties of laccase from the basidiomycetes Cerrena maxima. Biochemistry, 2001, vol. 66, no. 6, pp. 618-622. doi: 10.1023/A:1010299012591.
18. Paszczynski A., Crawford R.L., Huynh V.-B. Manganese peroxidase of Phanerochaete chrysosporium: Purification. Methods Enzymol., 1988, vol. 161, pp. 264-270. doi: 10.1016/0076-6879(88)61028-7.
19. Nikitina O.V., Shleev S.V., Gorshina E.S., Rusinova T.V., Serezhenkov V.A., Burbaev D.Sh., Belovo-lova L.V., Yaropolov A.I. Isolation and purification of enzymes from ligninolytic complex of the basidial fungus Trametes pubescens (Schumach.) Pilât and study of their properties. Biochemistry, 2005, vol. 70, no. 11, pp. 1274-1279. doi: 10.1007/s10541-005-0259-0.
20. Pavarina E.C., Durrant L.R. Growth of lignocellulosic-fermenting fungi on different substrates under low oxygenation conditions. Appl. Biochem. Biotechnol., 2002, vols. 98-100, pp. 663-677.
21. Obruca S., Marova I., Matouskova P., Haronikova A., Lichnova A. Production of lignocellulose-degrading enzymes employing Fusarium solani F-552. Folia Microbiol. (Prague), 2012, vol. 57, no. 3, pp. 221-227. doi: 10.1007/s12223-012-0098-5.
<Для цитирования: Дармов И.В., Горшунова Е.И., Тарасова Т.С. Исследование природных изолятов микромицетов Fusarium spp. - продуцентов лигнолитических ферментов // Учен. зап. Казан. ун-та. Сер. Естеств. науки. - 2017. - Т. 159, кн. 1. - С. 72-84.
<For citation: Darmov I.V., Gorshunova E.I., Tarasovа T.S. The study of natural isolates of Fusarium spp. micromycetes - ligninolytic enzymes producers. Uchenye Zapiski Kazanskogo Universiteta. Seriya Estestvennye Nauki, 2017, vol. 159, no. 1, pp. 72-84. (In Russian)
