CC BY
2
Для корреспонденции
Шестакова Светлана Игоревна - научный сотрудник лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» Адрес: 109240, Российская Федерация, г. Москва, Устьинский пр., д. 2/14 Телефон: (495) 698-53-97 E-mail: [email protected]
https://orcid.org/0000-0003-0279-4134
Шестакова С.И., Станкевич А.А., Котова Д.С., Требух М.Д., Никитин Н.С., Садыкова Э.О., Тышко Н.В.
Репродуктивная функция крыс в условиях токсической нагрузки на фоне белковой недостаточности
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи, 109240, г. Москва, Российская Федерация
Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, 109240, Moscow, Russian Federation
Подходы к оценке безопасности пищевой продукции нового вида, принятые в настоящее время в Российской Федерации, предполагают обязательное проведение репротоксикологических исследований с изучением репродуктивной функции и развития потомства подопытных животных, с целью получения исчерпывающих доказательств отсутствия отдаленных негативных последствий, которые могут проявиться только в следующем поколении. Комплексное изучение репродуктивной функции, пре- и постнатального развития потомства, как правило, включает исследование большого числа параметров, каждый из которых имеет широкий диапазон физиологических колебаний, при этом неоднородное распределение значений некоторых показателей усложняет интерпретацию результатов.
Финансирование. Научно-исследовательская работа по подготовке рукописи проведена при финансировании Российского научного фонда (проект № 20-16-00083-П; https://rscf.ru/project/23-16-45007/). Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Шестакова С.И., Тышко Н.В., сбор данных - Станкевич А.А., Котова Д.С., Требух М.Д., Никитин Н.С., Садыкова Э.О.; статистическая обработка данных - Шестакова С.И., Станкевич А.А.; написание текста - Тышко Н.В., Шестакова С.И.; редактирование, утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи - все авторы.
Для цитирования: Шестакова СИ., Станкевич А.А., Котова Д.С., Требух М.Д., Никитин Н.С., Садыкова Э.О., Тышко Н.В. Репродуктивная функция крыс в условиях токсической нагрузки на фоне белковой недостаточности // Вопросы питания. 2024. Т. 93, № 5. С. 85-93. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2024-93-5-85-93 Статья поступила в редакцию 23.07.2024. Принята в печать 16.09.2024.
Funding. The research was funded by the Russian Science Foundation (Project No. 20-16-00083-П; https://rscf.ru/project/23-16-45007/). Conflict of interest. The authors have no conflict of interest to declare.
Contribution. Concept and design of the study - Shestakova S.I., Tyshko N.V.; collecting the material - Stankevich A.A., Kotova D.S., Trebukh M.D., Nikitin N.S., Sadykova E.O.; processing the material - Shestakova S.I., Stankevich A.A.; text writing - Tyshko N.V., Shestakova S.I.; editing, approval of the final version of the article, responsibility for the integrity of all parts of the article - all authours.
For citation: Shestakova S.I., Stankevich A.A., Kotova D.S., Trebukh M.D., Nikitin N.S., Sadykova E.O., Tyshko N.V. Rats' reproductive function under toxic load against the background of protein deficiency. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2024; 93 (5): 85-93. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2024-93-5-85-93 (in Russian) Received 23.07.2024. Accepted 16.09.2024.
Rats' reproductive function under toxic load against the background of protein deficiency
Shestakova S.I., Stankevich A.A., Kotova D.S., Trebukh M.D., Nikitin N.S., Sadykova E.O., Tyshko N.V.
Цель исследования - изучение эффективности модели снижения адаптационного потенциала у крыс, основанной на сокращении поступления белка с рационом, для применения в экспериментах по изучению репродуктивной токсичности.
Материал и методы. Исследования продолжительностью 155 дней проведены на крысах поколений F0 (180 самок и 90 самцов) и F1 (773 крысенка, 456 плодов). Животные родительского поколения F0 были разделены на 3 группы - контрольная, 1-я и 2-я опытные, по 30 самцов и 60 самок в каждой. Исходный возраст крыс F0 составлял 28-35 дней. Животные всех групп в период роста и полового созревания (25-90-й дни жизни) получали рацион со сниженным содержанием белка (9,4 г на 100 г рациона, что составляет 9% по калорийности), после достижения ими возраста физиологической зрелости (100 дней) крысы были переведены на рационы с более низким содержанием белка (6,1 г на 100 г рациона, 6% по калорийности) и получали этот рацион на протяжении ссаживания, беременности и вскармливания потомства F1. Крысы опытных групп получали с кормом модельный гербицид глифосат (изопропиламинная соль, концентрация 360 г/л) в дозе 0,3 г/кг массы тела (6% от LD50): 1-я опытная группа - с 70-го дня жизни, 2-я опытная группа - с 30-го дня жизни на протяжении всего срока эксперимента. Репродуктивную функцию оценивали по фертильности животных F0 и по характеру пренатального и постнатального развития потомства F1. Результаты. Действие токсического фактора на фоне пониженной обеспеченности белком не приводило к комплексным изменениям репродуктивной функции крыс, опытные группы отличались от контрольной только по показателю постимплантационной гибели и среднему размеру пометов в постна-тальный период развития: постимплантационная гибель в 1-й и 2-й опытных группах была выше нормы, превышая величину данного показателя у крыс контрольной группы (4,7±1,6%) в 3,1 (p<0,05) и 2,2 (р>0,05) раза; средний размер пометов у крыс 1-й и 2-й опытных групп был на 15,8 и 21,3% (р<0,05) ниже, чем в контрольной группе (11,3±0,6). Выживаемость потомства в течение 1-го месяца жизни во всех группах составляла не менее 72%, что соответствует нижней границе нормы, характерной для крыс линии Вистар. Заключение. Использование в репротоксикологических исследованиях алиментарной модели снижения адаптационного потенциала лабораторных животных, основанной на дефиците белка в рационе, не представляется целесообразным, поскольку не повышает ни выраженность реакции на токсическое воздействие, ни достоверность получаемых результатов. Данная модель может быть рекомендована для подострых токсикологических исследований малотоксичных объектов, в частности при оценке безопасности пищевой продукции нового вида.
Ключевые слова: токсикологические исследования; репродуктивная функция;
развитие потомства; алиментарная модель снижения адаптационного потенциала; дефицит белка в рационе; пищевая продукция нового вида
Safety assessment approaches of novel food, currently adopted in the Russian Federation, imply mandatory in vivo reproductive toxicity tests with the study of reproductive function and offspring development in order to obtain comprehensive evidence of the absence of distant adverse effects that may manifest only in the next generation. Comprehensive study of reproductive function, pre- and postnatal offspring development, as a rule, includes the research of a large number of parameters, all of which has a wide range of physiological fluctuations, and the heterogeneous distribution of some parameters' values complicates the interpretation of the results.
The purpose of the study was to investigate the efficiency of a reduced adaptive potential model in rats, based on decreased diet protein intake, for the use in reproductive toxicity experiments.
Material and methods. The research lasting 155 days was carried out on rats of F0 (180 females and 90 males) and F1 (773 pups, 456 fetuses) generations. Animals of parental generation F0 were divided into 3 groups - control, the 1st and the 2nd test groups, 30 males and 60 females in each. The initial age of F0 rats was 28-35 days. Animals of all groups during growth and sexual maturation (25-90 days of life) received a diet with reduced protein content (9.4 g per 100 g of diet, which is 9% in calorie value). After reaching the age of physiological maturity (100 days) rats were transferred to a diet with lower protein content (6.1 g per 100 g of diet, 6% in calorie value), and received this diet during mating, pregnancy and feeding of F1 offspring. The rats of the test groups received with feed the model herbicide glyphosate (isopropylamine salt, concentration 360 g/l) at a dose of 0.3 g/kg body weight (6% of LD50): the 1st test group - from day 70 of life, the 2nd test group - from day 30 of life throughout the duration of the experiment. Reproductive
function was evaluated by the fertility of F0 animals and by the character of prenatal and postnatal development of F1 offspring.
Results. The toxic factor's influence on the background of reduced protein supply did not lead to complex changes in the reproductive function of rats, the test groups differed from the control group only by the post-implantation loss and the mean litter size in the postnatal period: post-implantation loss in the 1st and the 2nd test groups was higher than normal, exceeding the value of this indicator in the control group (4.7±1.6%) by 3.1 (p<0.05) u 2.2 (p>0.05) times; the mean litter size in the 1st and the 2nd test groups was by 15.8 and 21.3% (p<0.05) lower than in the control group. Survival rate of offspring during the 1st month of life in all groups was at least 72%, which corresponds to the lower limit of the norm characteristic for Wistar rats.
Conclusion. The use of the alimentary model of adaptation potential reduction based on diet protein deficiency does not consider appropriate in reproductive toxicity studies, since it does not increase either the severity of the reaction to toxic effects or the reliability of the results obtained. This model can be recommended for subacute toxicological studies of low-toxicity objects, in particular, when assessing the safety of novel food. Keywords: toxicological studies; reproductive function; offspring development;
alimentary model of adaptation potential reduction; diet's protein deficiency; novel food
Концепция зеленой экономики, в последнее десятилетие являющаяся одним из стратегических приоритетов большинства развитых стран, определила повышение интереса к альтернативным источникам пищевого белка, полученного из насекомых, микроорганизмов и других нетрадиционных объектов. В русле данного тренда утверждено Решение Высшего Евразийского экономического совета от 11 декабря 2020 г № 12, определяющее направления развития евразийской экономической интеграции до 2025 г., в том числе экономического сотрудничества в сфере зеленых технологий и защиты окружающей среды. Такая трансформация будет способствовать переходу Евразийского экономического союза (ЕАЭС) к новому технологическому укладу, выходу на траекторию устойчивого развития, сопровождающегося внедрением новых экологических и промышленных технологий.
В соответствии с законодательством ЕАЭС нетрадиционные пищевые продукты относятся к продукции нового вида, подлежащей государственной регистрации на основании данных о ее безопасности. Сложившаяся практика оценки безопасности такой продукции предполагает получение исчерпывающих доказательств отсутствия недопустимого риска, связанного с вредным воздействием нового продукта на потребителей и будущие поколения. Именно поэтому важнейшими этапами комплексной оценки безопасности пищевой продукции нового вида являются токсикологические исследования и изучение репродуктивной токсичности, проводимые в соответствии с отечественными и международными требованиями [1].
Комплексная оценка репродуктивной функции, пре- и постнатального развития потомства, как правило, включает изучение большого числа параметров, и каждый из них имеет широкий диапазон физиологических колебаний [1]. Перспективным инструментом повышения диагностической достоверности экспериментальных данных является моделирование дополнительной нагрузки, снижающей адаптационный потенциал подопытных животных. Поскольку одним из
наиболее простых и результативных способов снижения адаптационного потенциала является модификация состава рациона, в ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» были проведены исследования, результатом которых стало создание алиментарной модели, повышающей восприимчивость организма к действию токсических факторов за счет снижения обеспеченности витаминами группы В (В1, В2, В3, В6) и минеральными веществами (Рв3+ и Мд2+). Преимущества использования модели, позволяющей отличить физиологическую адаптацию от компенсированного скрытого патологического процесса и выявить влияние малотоксичных объектов, были подтверждены в нескольких сериях экспериментов, результаты которых опубликованы ранее [1-3].
Цель данной работы - изучение эффективности модели снижения адаптационного потенциала у крыс, основанной на сокращении поступления белка с рационом, для применения в экспериментах по изучению репродуктивной токсичности.
Материал и методы
Исследования продолжительностью 155 дней проведены на крысах поколений Р0 (180 самок и 90 самцов) и Р1 (773 крысенка, 456 плодов). Животные родительского поколения Р0 были разделены на 3 группы -контрольная, 1-я и 2-я опытные, по 30 самцов и 60 самок в каждой. Исходный возраст крыс Р0 составлял 28-35 дней. Животные всех групп в период роста и полового созревания (25-90-й дни жизни) получали рацион [4] со сниженным содержанием белка (9,4 г на 100 г рациона, что составляет 9% по калорийности), после достижения ими возраста физиологической зрелости (100 дней) крысы были переведены на рационы с более низким содержанием белка (6,1 г на 100 г рациона, 6% по калорийности) и получали этот рацион на протяжении ссаживания, беременности и вскармливания потомства Р1. Крысы опытных групп получали с кормом модельный токсикант - гербицид глифосат (изопропи-
Схема эксперимента Design of the experiment
Токсическое воздействие Toxic exposure
Группа / Group
Нет / No
Глифосат с 70-го дня жизни Glyphosate from the 70th day of life
Глифосат с 30-го дня жизни Glyphosate from the 30th day of life
г- 1
ш
Дни жизни Days of the life
~30
70
100
Y
Обеспеченность белком, 9% по калорийности Protein content, 9% in calom value
JL
J
Y
Обеспеченность белком, 6% по калорийности Protein content, 6% in caloriе value
ламинная соль, концентрация 360 г/л), чье действие на репродуктивную функцию подробно охарактеризовано в [5, 6], в дозе 0,3 г на 1 кг массы тела (6% от LD50): 1-я опытная группа - с 70-го дня жизни, 2-я опытная группа -с 30-го дня жизни на протяжении всего срока эксперимента. Схема эксперимента представлена на рисунке.
Репродуктивную функцию оценивали по фертильно-сти самцов и самок Р0 и по характеру пре- и постнаталь-ного развития потомства Р1. Работу с животными проводили в соответствии с ГОСТ 33215-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур» и ГОСТ 33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами».
Фертильность (способность к оплодотворению) определяли по эффективности спаривания (% отношение забеременевших самок/оплодотворивших самцов к общему количеству ссаженных самок/самцов) и эндокринной функции яичников (содержание эстрадиола, прогестерона и тестостерона в сыворотке крови беременных самок).
Для изучения пренатального развития потомства беременных самок F0 из каждой группы подвергали эвтаназии на 20-й день беременности, подсчитывали количество желтых тел, количество мест резорбции и мест имплантации, определяли число живых и мертвых плодов, вычисляли пред- и постимплантационную гибель. Плоды извлекали, проводили макроскопический осмотр, определяли массу и краниокаудальный размер, исследовали по методам J.G. Wilson и A.B. Dawson [7].
Постнатальное развитие потомства F1 оценивали в течение 1-го месяца жизни по числу живых и мертвых новорожденных, динамике зоометрических показателей (массы тела и краниокаудального размера), общему физическому развитию [7]. Также определяли среднюю величину помета, вычисляли выживаемость потомства в 1-й месяц жизни [7].
Крыс содержали в пластиковых клетках с древесной подстилкой, в отапливаемом (температурный режим +21-23 °С) и вентилируемом помещении с естественным освещением, доступ к корму и воде - ad libitum. В течение эксперимента вели наблюдения за поедаемостью корма, массой тела и общим состоянием животных.
Таблица 1. Пренатальное развитие потомства F-, Table 1. Prenatal development of progeny F1
Показатель/ Indicator Группа / Group
контроль control опыт-1 test-1 опыт-2 test-2 референсные значения reference range
Количество беременных самок / Number of pregnant females 13 18 15 -
Количество желтых тел Number of ovarian corpora-lutea Всего / Total 174 266 192 5-23
M±m 13,4±0,5 14,8±0,7 12,8±0,4
min-max 11-16 11-22 10-17
Количество мест имплантации Number of implantation sites Всего / Total 145 212 156 3-18
M±m 11,1±0,6 11,8±0,5 10,4±0,5
min-max 6-14 6-16 5-13
Количество живых плодов Number of alive fetuses Всего / Total 138 178 140 2-18
M±m 10,6±0,6 9,9±0,5 9,3±0,5
min-max 6-14 6-13 4-12
Количество резорбций Number of resorptions Всего / Total 7 32 15 0-10
M±m 0,54±0,18 1,89±0,50 1,00±0,28
min-max 0-2 0-9 0-3
Количество мертвых плодов / Number of dead fetuses 0 0 0 -
Предимплантационная гибель / Pre-lmplantatlon loss
% M±m 16,3±4,0 18,7±3,5 17,6±4,4 0-80
min-max 0-57,1 0-57,1 0-58,0
Абс. / Abs. Всего / Total 29 54 36 0-13
M±m 2,23±0,57 3,00±0,60 2,37±0,64
min-max 0-8 0-8 0-9
Постимплантационная гибель / Post-implantation loss
% M±m 4,7±1,6 14,8±3,4* 10,5±2,4p=0,059 0-100
min-max 0-18 0-56 0-25
Абс. / Abs. Всего / Total 7 34 16 0-10
M±m 0,54±0,18 1,89±0,50* 1,07±0,27
min-max 0-2 0-9 0-3
* - статистически значимое (p<0,05) отличие от показателя контрольной группы.
* - statistically significant (p<0.05) difference from the control.
Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ IBM SPSS 23.0 (IBM, США). Результаты приведены в виде М±т и min-max, где М -выборочное среднее измеряемых величин, т - стандартная ошибка, min и max - соответственно минимальное и максимальное значение измеряемой величины, а также в долях (процентах) или в абсолютных числах. Оценку достоверности различий средних величин, удовлетворяющих условиям нормального распределения и равенству дисперсий, проводили методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Для сравнения количественных признаков, не удовлетворяющих условиям нормального распределения и равенству дисперсий, использовали ранговый двухфакторный дисперсионный анализ. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (p) принимали равным 0,05 [8].
Результаты и обсуждение
Общее состояние животных всех групп было удовлетворительным. К 100-му дню жизни, соответствующему
оптимальному для спаривания возрасту физиологической зрелости, отмечались статистически значимые различия массы тела контрольной и опытных групп: масса тела самок контрольной группы составляла 252,7±2,6 г, самцов - 400,3±8,3 г, 1-й опытной группы -224,5±1,4 и 320,8±5,3 г, 2-й опытной группы - 211,4±2,4 и 292,5±4,1 г соответственно. Масса тела самок 1-й и 2-й опытных групп была на 11,2 и 16,3% (р<0,05) ниже, чем у самок контрольной группы, самцов - на 19,9 и 26,9% (р<0,05) ниже, чем у контрольных животных.
Эффективность спаривания самок и самцов контрольной группы составляла 76,7 и 100%, 1-й опытной группы - 83,3 и 100%, 2-й опытной группы - 100 и 100% соответственно. Следует отметить, что группа, подвергавшаяся более продолжительному воздействию глифосата, демонстрировала беспрецедентно высокие показатели эффективности спаривания для самок: при данных условиях эксперимента (длительность ссаживания 7 дней) оптимальными значениями считаются 75-90%, поскольку продолжительность эстрального цикла у крыс составляет от 1,5 до 10 дней, и не все крысы достигают фазы эструса в отведенный период.
Таблица 2. Зоометрические показатели плодов поколения F-, (M±m) Table 2. Zoometric parameters of F1 progeny prenatal development (M±m)
Показатель / Indicator Группа / Group Референсные значения Reference range
контроль control (n=65) опыт-1 test-1 (n=90) опыт-2 test-2 (n=79)
Масса тела, г / Fetal weight, g 3,208±0,077 3,230±0,088 3,298±0,077 1,51-6,12
Краниокаудальный размер, см / Craniocaudal size, cm 3,540±0,039 3,502±0,039 3,532±0,037 2,40-5,10
Масса печени / Weight of liver абс.1 / abs* 0,230±0,006 0,233±0,007 0,239±0,006 0,058-0,648
отн.2 / rel2 6,948±0,109 7,220±0,101 7,246±0,106 2,08-13,68
Масса почек / Weight of kidneys абс.1 / abs1 0,023±0,001 0,023±0,001 0,023±0,001 0,006-0,098
отн.2 / rel2 0,687±0,013 0,686±0,012 0,699±0,017 0,227-2,538
Масса сердца / Weight of heart абс.1 / abs1 0,019±0,001 0,020±0,001 0,019±0,001 0,005-0,050
отн.2 / rel2 0,584±0,011 0,607±0,090 0,585±0,010 0,184-1,598
Масса легких / Weight of lungs абс.1 / abs1 0,100±0,003 0,097±0,003 0,099±0,002 0,020-0,213
отн.2 / rel2 3,051 ±0,049 3,032±0,038 2,999±0,040 0,761-5,789
П р и м е ч а н и е.1 - абсолютная масса внутреннего органа, г;2 - относительная масса внутреннего органа, г/100 г массы тела. N o t e.1 - absolute weight of internal organ, g: 2 - relative weight of internal organ, g/100 g body weight.
Возможно, длительная экспозиция токсикантом оказала влияние на сокращение эстрального цикла, в результате чего все самки этой группы забеременели.
Общее состояние самок Р0 во время беременности было удовлетворительным, по внешнему виду и поведению самки контрольной и опытных групп не различались между собой, относительный прирост массы тела самок 1-й и 2-й опытных групп был несколько выше, чем у контрольных животных.
Обзорные макроскопические исследования внутренних органов беременных самок не выявили никаких патологических изменений ни в одной группе, массы внутренних органов находились в пределах физиологических колебаний, характерных для крыс линии Вистар. При изучении эндокринной функции гонад на 20-й день беременности не выявлено различий между группами, содержание половых гормонов находилось в пределах нормы.
Анализ пренатального развития потомства F1 выявил, что по количеству желтых тел, мест имплантации и живых плодов самки контрольной и опытных групп не имели достоверных различий, тем не менее значения этих показателей у крыс 2-й опытной группы были несколько ниже нормы, характерной для крыс линии Вистар (табл. 1). Предимплантационная гибель эмбрионов во всех группах была несколько выше нормы, тогда как постимплантационная гибель была выше нормы в 1-й и 2-й опытных группах, превышая величину данного показателя у крыс контрольной группы в 3,1 и 2,2 раза соответственно.
Зоометрические показатели и масса внутренних органов плодов варьировали в пределах физиологической нормы, плоды опытных групп не имели достоверных отличий от плодов контрольной группы (табл. 2).
При обследовании плодов всех групп по методу Wilson аномалий развития внутренних органов не выявлено.
Таблица 3. Постнатальное развитие потомства F-, Table 3. Postnatal development of F1 progeny
Показатель / Indicator Группа / Group
контроль control опыт-1 test-1 опыт-2 test-2
Общее количество ссаженных самок / Number of mating rats 30 30 30
Общее количество забеременевших самок / Number of pregnant females 23 25 30
Общее количество родивших самок / Total number of delivered females 23 25 30
Общее количество пометов, уничтоженных материнским животным в 1-й день жизни Total number of litters killed by the mother animal on the 1st day of life 0 0 2
Общее количество крысят / Total number of pups 261 240 272
Из них мертворожденных / Of these, stillbirths 0 1 4
Средняя величина помета / Mean litter size M±m 11,3±0,6 9,6±0,4* 8,9±0,6*
min-max 1-15 5-13 1-12
Выживаемость потомства / Pup survival
Выживаемость с 1 -го по 25-й день жизни, % / Survival from the 1st to the 25th day of life, % 72,4 72,0 72,4
П р и м е ч а н и е. * - статистически значимое (p<0,05) отличие от показателя контрольной группы. N o t e. * - statistically significant (p<0.05) difference from the control.
Таблица 4. Динамика массы тела и краниокаудального размера потомства F-, в 1-й месяц жизни Table 4. F1 pups' body weight and craniocaudal size progress In the 1st month of life
Группа / Group Дни жизни / Day of life
2-й 5-й 10-й 15-й 20-й 25-й
Масса тела, г / Body weight, g
Контроль / Control n 261 237 224 211 202 189
M±m 5,75±0,05 7,21 ±0,08 9,64±0,13 12,16±0,16 15,59±0,23 21,15±0,29
Опыт-1 / Test-1 n 239 226 202 186 181 172
M±m 5,91±0,05* 7,30±0,08 9,88±0,16 12,81 ±0,23 16,04±0,34 22,55±0,44*
Опыт-2 / Test-2 n 265# 240 219 203 194 194
M±m 5,61±0,05* 6,90±0,08* 9,24±0,15* 12,03±0,26 14,83±0,34 20,38±0,48
Референсные значения / Reference range M±m 6,66±0,01 11,17±0,03 20,08±0,05 29,58±0,07 42,26±0,11 64,25±0,16
Краниокаудальный размер, см / Craniocaudal size, cm
Контроль / Control M±m 5,12±0,02 5,79±0,03 6,66±0,03 7,39±0,03 8,16±0,04 9,11±0,05
Опыт-1 / Test-1 M±m 5,17±0,02 5,80±0,03 6,65±0,03 7,38±0,04 8,25±0,05 9,24±0,06
Опыт-2 / Test-2 M±m 5,08±0,02 5,61 ±0,02* 6,50±0,03* 7,21 ±0,04* 7,94±0,05* 8,89±0,06*
Референсные значения / Reference range M±m 5,35±0,01 6,57±0,01 8,10±0,01 9,72±0,01 11,34±0,01 13,20±0,01
П р и м е ч а н и е. * - статистически значимое (p<0,05) отличие от показателя контрольной группы; # - 3 крысенка умерли в 1-й день жизни.
N o t e. * - statistically significant (p<0.05) difference from the control; # - 3 pups died on the first day of life.
Формирование основных анатомических систем протекало без особенностей. Обзорные исследования скелета по методу Dawson не выявили аномалий развития скелета плодов контрольной и опытных групп. Длина участков оссификации в закладках костей конечностей и черепа плодов 1-й и 2-й опытных групп не имела достоверных отличий от контроля.
При анализе постнатального развития крысят было выявлено значимое снижение средней величины пометов у крыс 1-й и 2-й опытных групп по сравнению с контрольными животными - на 15,8% (р<0,05) и 21,3% (р<0,05) соответственно (табл. 3). Принимая во внимание, что диапазон нормы для данного показателя составляет 10,6-14,6 крысят в помете, средняя величина пометов в обеих опытных группах была ниже нормы. Выживаемость потомства в течение 1-го месяца жизни во всех группах составляла 72,3%, что соответствует нижней границе нормы, характерной для крыс линии Вистар [9].
Комплексное изучение постнатального онтогенеза потомства F1 в течение 1-го месяца жизни выявило значительное отставание развития крысят всех групп от нормы - по морфофункциональным показателям (дина-
мика массы тела и краниокаудального размера) (табл. 4) и показателям физического развития (отлипание ушных раковин, открытие глаз и т.п.) (табл. 5); отставание от нормы составляло от 38,4 до 121,5%. При этом различия между группами были незначительны, например: масса тела крысят 1-й опытной группы на 2-й и 25-й дни жизни была выше, чем у крысят контрольной группы, на 2,7 и 6,6% (р<0,05) соответственно. Краниокаудальный размер крысят 1-й опытной группы не имел значимых отличий от контроля. Масса тела крысят 2-й опытной группы на протяжении всего периода наблюдений была ниже, чем у контрольных: на 2-10-й дни - на 2,5-4,3% (р<0,05), на 15-25-й дни - на 1,0-4,9% (р>0,05). Кра-ниокаудальный размер крысят 2-й опытной группы на 5-25-й дни жизни был на 2,4-3,1% (р<0,05) ниже, чем у крысят контрольной группы.
На основании полученных результатов можно предположить, что превалирующее воздействие на отставание роста и развития крысят 1-го месяца жизни имеет обеспеченность белком, а не токсический фактор. В период вскармливания потомства самки получали рацион с 6% содержанием белка, и поскольку, согласно данным литературы [10-12], состав грудного молока коррелирует
Таблица 5. Физическое развитие потомства F1 в 1-й месяц жизни (M±m, дни, n - все крысята) Table 5. Physical development of the pups F1 (M±m, days, n - all rats)
Показатель / Indicator Группа / Group Норма по [9] The normal range [9]
контроль / control опыт-1/ test-1 опыт-2 / test-2
Отлипание ушных раковин / Ear unfolding 4,43±0,55 4,35±0,53 4,36±0,52 Со 2-го дня / From the 2nd day
Появление волосяного покрова / First coat 8,56±0,72 8,59±0,67 8,66±0,75 С 5-го дня / From the 5th day
Прорезывание резцов / Incisor eruption 11,66±0,56 11,37±0,61 11,64±0,74 С 6-го дня / From the 6th day
Открытие глаз / Eye opening 16,85±1,24 17,06±1,33 17,34±1,28 С 12-го дня / From the 12th day
Опускание семенников / Testicle lowering 30,19±1,28 30,34±2,00 31,46±1,73 С 18-го дня / From the 18th day
Открытие влагалища / Vagina opening 38,74±7,99 42,50±2,17 44,05±3,23 С 28-го дня / From the 28th day
с составом рациона в части долевого распределения макронутриентов, очень высока вероятность снижения пищевой ценности молока на протяжении всего периода лактации.
Действие токсического фактора на фоне пониженной обеспеченности белком не приводило к комплексным изменениям репродуктивной функции крыс, опытные группы отличались от контрольной только по показателю постимплантационной гибели и среднему размеру пометов в постнатальный период развития. Анализ полученных данных в совокупности с результатами подострого токсикологического эксперимента на самцах крыс линии Вистар, также получавших модельный токсикант глифосат на фоне низкобелковых рационов [13, 14], свидетельствует о сокращении эффективности использования данной алиментарной модели снижения адаптационного потенциала в ряду подострые токсикологические исследования ^ репротоксикологиче-ские исследования. Примечательно, что алиментарная
модель снижения адаптационного потенциала за счет дефицита витаминов группы В, солей железа и магния демонстрировала обратную последовательность: репро-токсикологические исследования ^ подострые токсикологические исследования [1-3].
Заключение
Использование в репротоксикологических исследованиях алиментарной модели снижения адаптационного потенциала лабораторных животных, основанной на дефиците белка в рационе, не представляется целесообразным, поскольку не повышает ни выраженность реакции на токсическое воздействие, ни достоверность получаемых результатов. Данная модель может быть рекомендована для подострых токсикологических исследований малотоксичных объектов, в частности при оценке безопасности пищевой продукции нового вида.
Сведения об авторах
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация):
Шестакова Светлана Игоревна (Svetlana I. Shestakova) - научный сотрудник лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-0279-4134
Станкевич Ангелина Андреевна (Angelina A. Stankevich) - инженер-исследователь 2-й категории лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1797-6512
Котова Дарина Сергеевна (Darina S. Kotova) - лаборант-исследователь лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-7173-3629
Требух Марина Дмитриевна (Marina D. Trebukh) - младший научный сотрудник лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4077-1593
Никитин Николай Сергеевич (Nikolay S. Nikitin) - младший научный сотрудник лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-5091-0991
Садыкова Эльвира Олеговна (Elvira O. Sadykova) - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи E-mail: [email protected]
https://orcid.org/0000-0001-5446-5653
Тышко Надежда Валерьевна (Nadezhda V. Tyshko) - доктор медицинских наук, заведующий лабораторией оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи E-mail: [email protected]
https://orcid.org/0000-0002-8532-5327
Литература
1. Tyshko N.V., Sadykova E.O., Shestakova S.I., Nikitin N.S., Trebukh M.D., Loginova M.S. The use of the adaptation potential reduction model for reproductive toxicity research in vivo // J. Toxicol. 2020. Vol. 2020, N 1. Article ID 8834630. DOI: https://doi.org/10.1155/2020/8834630
2. Никитин Н.С., Тышко Н.В. Морфологические особенности печени крыс в условиях разной обеспеченности витаминами и минеральными веществами // Вопросы питания. 2023. Т. 92, № 5. С. 70—79. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-5-70-79
3. Tsatsakis A., Tyshko N.V., Goumenou M., Shestakova S.I., Sadykova E.O., Zhminchenko V.M. et al. Detrimental effects of 6 months exposure to very low doses of a mixture of six pesticides associated with chronic vitamin deficiency on rats // Food Chem. Toxicol. 2021. Vol. 152. Article ID 112188. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fct.2021.112188
4. Макарова М.Н., Макаров В.Г., Рыбакова А.В., Зозуля О.К. Питание лабораторных животных. Основные рационы. Сообщение // Международный вестник ветеринарии. 2017. № 2. С. 91—105.
12.
5. Van Bruggen A.H., He M.M., Shin K., Mai V., Jeong K.C., Finckh M.R. 10. et al. Environmental and health effects of the herbicide glyphosate // Sci. Total Environ. 2018. Vol. 616. Р. 255-268. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.scitotenv.2017.10.309
6. Thanomsit C., Saowakoon S., Wattanakornsiri A., Nanuam J., Prasat- 11. kaew W., Nanthanawat P. et al. The glyphosate (Roundup): fate in aquatic environment, adverse effect and toxicity assessment in aquatic organisms // Naresuan University Journal: Science and Technology (NUJST). 2020. Vol. 28, N 1. P. 65-81. DOI: https://doi.org/10.14456/nujst.2020.7
7. Дурнев А.Д., Смольникова Н.М., Скосырева А.М., Немова Е.П., Соломина А.С., Шреде О.В. и др. Методические рекомендации по изучению репродуктивной токсичности лекарст- 13 венных средств // Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / отв. ред. А.Н. Миронов. Москва : Гриф и К, 2012. С. 80-93.
8. Riffenburgh R.H., Gillen D.L. Statistics in Medicine. Elsevier 14 Academic Press, 2020. 822 p. ISBN: 9780128153284.
9. Suckow M.A., Wilson R.P., Hankenson F.C., Foley P.L. The Laboratory Rat. Elsevier Academic Press, 2019. ISBN: 978-0-12-814338-4. DOI: https://doi.org/10.1016/C2017-0-01188-6
Huang Z., Hu Y. Dietary patterns and their association with breast milk macronutrient composition among lactating women // Int. Breastfeed. J. 2020. Vol. 15, N 1. P. 52. DOI: https://doi.org/10.1186/s13006-020-00293-w
Xi Q., Liu W., Zeng T., Chen X., Luo T., Deng Z. Effect of different dietary patterns on macronutrient composition in human breast milk: a systematic review and meta-analysis // Nutrients. 2023. Vol. 15, N 3. P. 485. DOI: https://doi.org/10.3390/nu15030485 Adhikari S., Kudla U., Nyakayiru J., Brouwer-Brolsma E.M. Maternal dietary intake, nutritional status and macronutrient composition of human breast milk: systematic review // Br. J. Nutr. 2022. Vol. 127, N 12. P. 1796-1820. DOI: https://doi.org/10.1017/S0007114521002786 Никитин Н.С. Результаты морфологических исследований печени крыс в экспериментах с низким содержанием белка в рационе // Вопросы питания. 2023. Т. 92, № 5. С. 69-70. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-5s-063 Пашорина В.А., Никитин Н.С., Тышко Н.В. Формирование референсных значений массы внутренних органов крыс, получавших рационы с последовательно снижавшимся содержанием белка // Вопросы питания. 2023. Т. 92, № 5. С. 71-72. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-5s-066
References
Tyshko N.V., Sadykova E.O., Shestakova S.I., Nikitin N.S., Trebukh M.D., Loginova M.S. The use of the adaptation potential reduction model for reproductive toxicity research in vivo. J Toxicol. 2020; 2020 (1): 8834630. DOI: https://doi.org/10.1155/2020/8834630 Nikitin N.S., Tyshko N.V. Rats' liver morphological features under conditions of different supply of vitamins and minerals. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2023; 92 (5): 70-9. DOI: DOI: https://doi. org/10.33029/0042-8833-2023-92-5-70-79 (in Russian) Tsatsakis A., Tyshko N.V., Goumenou M., Shestakova S.I., Sadykova E.O., Zhminchenko V.M., et al. Detrimental effects of 6 months exposure to very low doses of a mixture of six pesticides associated with chronic vitamin deficiency on rats. Food Chem Toxicol. 2021; 152: 112188. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fct.2021.112188 Makarova M.N., Makarov V.G., Rybakova A.V., Zozulya O.K. Nutrition of laboratory animals. Basic diets. Report. Mezhdunarodniy vestnik veterinarii [International Journal of Veterinary Medicine]. 2017; (2): 91-105. (in Russian)
Van Bruggen A.H., He M.M., Shin K., Mai V., Jeong K.C., Finckh M.R., et al. Environmental and health effects of the herbicide glyphosate. Sci Total Environ. 2018; 616: 255-68. DOI: https://doi.org/10.1016/j.scito-tenv.2017.10.309
Thanomsit C., Saowakoon S., Wattanakornsiri A., Nanuam J., Prasat-kaew W., Nanthanawat P., et al. The glyphosate (Roundup): fate in aquatic environment, adverse effect and toxicity assessment in aquatic organisms. Naresuan University Journal: Science and Technology (NUJST). 2020; 28 (1): 65-81. DOI: https://doi.org/10.14456/nujst.2020.7 Durnev A.D., Smol'nikova N.M., Skosyreva A.M., Nemova E.P., Solomina A.S., Shrede O.V., et al. Guidelines for the study of reproductive
12.
13.
14.
toxicity of drugs. In: Mironov A.N. (ed.). Manual for Preclinical Studies of New Pharmacological Substances. Moscow, Grif i K, 2012: 80-93. (in Russian)
Riffenburgh R.H., Gillen D.L. Statistics in Medicine. Elsevier Academic Press, 2020: 822 p. ISBN: 9780128153284. Suckow M.A., Wilson R.P., Hankenson F.C., Foley P.L. The Laboratory Rat. Elsevier Academic Press, 2019. ISBN: 978-0-12-814338-4. DOI: https://doi.org/10.1016/C2017-0-01188-6
Huang Z., Hu Y. Dietary patterns and their association with breast milk macronutrient composition among lactating women. Int Breastfeed J. 2020; 15 (1): 52. DOI: https://doi.org/10.1186/s13006-020-00293-w Xi Q., Liu W., Zeng T., Chen X., Luo T., Deng Z. Effect of different dietary patterns on macronutrient composition in human breast milk: a systematic review and meta-analysis. Nutrients. 2023; 15 (3): 485. DOI: https://doi.org/10.3390/nu15030485
Adhikari S., Kudla U., Nyakayiru J., Brouwer-Brolsma E.M. Maternal dietary intake, nutritional status and macronutrient composition of human breast milk: systematic review. Br J Nutr. 2022; 127 (12): 1796820. DOI: https://doi.org/10.1017/S0007114521002786 Nikitin N.S Results of morphological studies of rat liver in experiments with low protein content in the diet. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2023; 92 (5): 69-70. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-5s-063 (in Russian)
Pashorina V.A., Nikitin N.S., Tyshko N.V. Reference values of the internal organs' weight of rats fed diets with gradually decreasing protein content. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2023; 92 (5): 71-2. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-5s-066 (in Russian)
1.
2
9
4
6
7
