CC BY
0
Для корреспонденции
Требух Марина Дмитриевна - младший научный сотрудник лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» Адрес: 109240, Российская Федерация, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14 Телефон: (495) 698-53-97 E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4077-1593
Требух М.Д., Садыкова Э.О., Шумакова А.А., Шестакова С.И.
Формирование подходов к оценке аллергенного потенциала белковых гидролизатов, полученных из нетрадиционных источников продовольственного сырья
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи, 109240, г. Москва, Российская Федерация
Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, 109240, Moscow, Russian Federation
Изучение перспектив применения альтернативных источников белка при производстве пищевой продукции позволило определить 2 основных направления, требующих комплексной научной поддержки: во-первых, разработка технологий производства и переработки пищевого белка для получения пищевых гидролизатов с заданным составом и свойствами, а во-вторых - оценка безопасности такой продукции, в том числе аллергенности. В настоящее время
Development of allergenic potential's assessment approaches of protein hydrolysates obtained from alternative food sources
Trebukh M.D., Sadykova E.O., Shumakova A.A., Shestakova S.I.
Финансирование. Работа проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания в рамках Программы фундаментальных научных исследований (тема FGMF-2022-0003). Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Садыкова Э.О., Требух М.Д.; сбор и статистическая обработка данных - все авторы; написание текста - Требух М.Д., Садыкова Э.О.; редактирование, утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи - все авторы.
Благодарности. Авторы искренне благодарят сотрудников лаборатории иммунологии ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»: доктора медицинских наук, профессора, главного специалиста Ригера Н.А. и кандидата биологических наук, научного сотрудника А.Н. Тимонина за помощь, оказанную при выполнении исследований.
Для цитирования: Требух М.Д., Садыкова Э.О., Шумакова А.А., Шестакова СИ. Формирование подходов к оценке аллергенного потенциала белковых гидролизатов, полученных из нетрадиционных источников продовольственного сырья // Вопросы питания. 2024. Т. 93, № 6. С. 91-97. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2024-93-6-91-97 Статья поступила в редакцию 17.07.2024. Принята в печать 25.11.2024.
Funding. The research was funded by the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation (Minobrnauki) within the state assignment (FGMF-2022-0003).
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Contribution. Concept and design of the study - Sadykova E.O., Trebukh M.D.; collecting and statistical processing the material - all authors; text writing - Trebukh M.D., Sadykova E.O.; editing, approval of the final version of the article, responsibility for the integrity of all parts of the article - all authors. Acknowledgements. The authors would like to sincerely thank the staffs of the Laboratory of Immunology of the Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety: doctor of Medicine, professor, chief specialist Rieger N.A. and candidate of biological sciences, researcher Timonin A.N. for the help in carrying out the research.
For citation: Trebukh M.D., Sadykova E.O., Shumakova A.A., Shestakova S.I. Development of allergenic potential's assessment approaches of protein hydrolysates obtained from alternative food sources. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2024; 93 (6): 91-7. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2024-93-6-91-97 (in Russian) Received 17.07.2024. Accepted 25.11.2024.
в рамках работы по второму направлению проводятся исследования, включающие совершенствование подходов к оценке аллергенного потенциала инновационной пищевой продукции, поиск новых in vitro и in vivo моделей и биомаркеров, позволяющих гарантировать безопасность продукции для потребителей.
Цель исследования - на модели системной анафилаксии у крыс изучить аллергенный потенциал белковых гидроли-затов метанокисляющих бактерий и сформировать подходы к оценке безопасности пищевой продукции нового вида. Материал и методы. Аллергенный потенциал кислотного и ферментативного гидролизатов метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus изучен на модели системной анафилаксии в двух 30-дневных экспериментах на крысах-самцах линии Вистар, получавших с рационом в рамках 1-го эксперимента кислотный гидролизат, 2-го -ферментативный гидролизат. Животных соответствующих контрольных групп содержали на полусинтетическом казеиновом рационе. Замену ингредиентов рациона опытных групп проводили с учетом содержания белка, жиров, углеводов и пищевых волокон во вводимом продукте при соблюдении принципа изокалорийности и идентичности химического состава. Аллергенный потенциал гидролизатов исследовали, используя расширенный пул показателей: тяжесть активного анафилактического шока (летальность, число тяжелых реакций анафилаксии); цитокиновый профиль (содержание про- и противовоспалительных цитокинов, а также регуляторов клеточного и гуморального иммунного ответа), концентрация специфических к овальбумину куриного яйца иммуноглобулинов класса IgG до введения разрешающей дозы овальбумина куриного яйца.
Результаты. В эксперименте на сенсибилизированных крысах показано, что включение в рацион белковых гидролизатов метанокисляющих бактерий вызывает повышение аллергической реактивности. Тяжесть системной анафилаксии у крыс 1-й опытной группы, получавших с рационом кислотный гидролизат, была на 20% (p<0,05) выше, чем у животных 1-й контрольной группы, у крыс 2-й опытной группы - на 33% (p<0,05) ниже соответствующей контрольной. Оценка интенсивности гуморального иммунного ответа демонстрирует статистически незначимое повышение суммы антител IgG1 + IgG4 у крыс 1-й опытной группы по сравнению с соответствующей контрольной группой на 11% (p>0,05), величина данного показателя у крыс 2-й опытной группы была на 81% (p<0,05) выше, чем у животных 2-й контрольной группы. Изучение цитокиновых профилей сыворотки крови выявило повышение их концентрации у крыс обеих опытных групп по сравнению с соответствующими контролями: у крыс 1-й опытной группы 8 из 12 показателей превышали контрольные значения на 4-69% (p>0,05), у крыс 2-й опытной группы 7 из 12 показателей превышали контрольные значения на 5-19% (p>0,05), а 2 из 12 - на 88-191% (p<0,05). Обработка этих данных методом непараметрического рангового двухфакторного дисперсионного анализа подтвердила влияние технологии гидролиза белка метанокисляющих бактерий на аллергенность гидролизатов, а также влияние источника белка в рационе.
Заключение. Результаты исследования аллергенного потенциала белковых гидролизатов метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus на модели системной анафилаксии у крыс свидетельствуют о перспективности использования ферментативного гидролиза, однако для создания продукта с низкой остаточной антигенностью и иммуногенностью необходима дальнейшая оптимизация технологии. На основании анализа полученных данных были сформированы подходы к оценке аллергенного потенциала инновационной пищевой продукции, полученной с использованием микробного синтеза, включающие выполнение целого ряда исследований in vitro и in vivo.
Ключевые слова: пищевая продукция нового вида; аллергенный потенциал; Methylococcus capsulatus; ферментативный гидролиз; кислотный гидролиз
The investigation of the perspectives for the application of alternative protein sources in food production has allowed us to identify two main directions requiring comprehensive scientific support: firstly, the development of production and processing of food protein technologies to obtain food hydrolysates with a given composition and properties, and secondly, the assessment of the such product safety, including evaluation of their allergenic potential. Currently, within the second direction, research is being conducted to improve approaches to assessing the allergenic potential of innovative food, search for new in vitro and in vivo models and biomarkers to guarantee the safety of these products for consumers.
The purpose of the study was to research the allergenic potential of the methanotrophic bacteria protein hydrolysates on the model of systemic anaphylaxis in rats and to formulate approaches to assessing the novel foods' safety.
Material and methods. The allergenic potential of acid and enzymatic hydrolysates of Methylococcus capsulatus methanotrophic bacteria was investigated on the systemic anaphylaxis' model in two 30-day experiments on Wistar rats' male fed diet containing acid hydrolysate in the 1st experiment and enzymatic hydrolysate in the 2nd experiment. Animals of the corresponding control groups were kept on semi-synthetic casein diet. The ingredients of the experimental groups' diets were substituted taking into account the content of protein, fat, carbohydrates and dietary fibers in the hydrolysates in compliance with the principle of isocaloric content and identity of chemical composition. Allergenic potential of hydrolysates was assessed using an expanded pool of indicators: severity of active anaphylactic shock (mortality, number of severe anaphylaxis reactions); cytokine profile (content of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines, as well as regulators of cellular and humoral immune response), ovalbumin specific IgG immunoglobulin level before administration of ovalbumi permissive dose.
Results. In the sensitised rats the inclusion of methanotrophic bacteria hydrolysates in the diet caused an increase in allergic reactivity. The systemic anaphylaxis severity was 20% (p<0.05) higher in rats of the 1st experimental group receiving acid hydrolysate with the diet than in animals of the 1st control group; in rats of the 2nd experimental group it was 33% (p<0.05) lower than the corresponding control. The assessment of the humoral immune response intensity shows a slight statistically unreliable increase by 11% (p>0.05) in the sum of IgG1 + IgG4 antibodies in rats of the 1st experimental group compared to the corresponding control group. This indicator in rats of the 2nd experimental group was 81% (p<0.05) higher than in rats of the 2nd control group. The study of serum cytokine profiles revealed an increase in Th1/Th2-regulators of the immune response in rats of both experimental groups compared to the corresponding controls: in rats of the 1st experimental group 8 out of 12 indices exceeded control values by 4-69% (p>0.05), in rats of the 2nd experimental group 7 out of 12 indices exceeded control values by 5-19% (p>0.05), and 2 out of 12 - by 88-191% (p<0.05). The experimental data processed by nonparametric ranked two -factor dispersion analysis confirmed the influence of the methanotrophic bacteria protein hydrolysis' technology on the hydrolysates allergenicity and the influence of the diet protein source. Conclusion. The results of the allergenic potential' investigation of Methylococcus capsulatus protein hydrolysates in the systemic anaphylaxis rats' model indicate the promising use of enzymatic hydrolysis. However, further optimisation of the technology is required to create a product with low residual antigenicity and immunogenicity. Approaches to allergenic potential assessment of innovative food obtained by microbial synthesis, including a number of in vitro and in vivo studies, were formed on the basis of the obtained data analysis.
Keywords: novel food; allergenic potential; Methylococcus capsulatus; enzymatic hydrolysis; acid hydrolysis
Динамическое развитие технологий пищевых производств, обусловленное достижениями современной науки в области глубокой переработки, выделения и очистки отдельных ингредиентов, в том числе из нетрадиционного сырья, не только расширяет сырьевую базу соответствующих отраслей промышленности, но и накладывает дополнительные обязательства в части обеспечения безопасности такой продукции [1]. Пищевая продукция нового вида, не имеющая истории безопасного применения в пищу, в большинстве юрис-дикций рассматривается как источник потенциальных рисков для здоровья человека, поэтому важнейшим условием возможности использования такой продукции является доказательство ее безопасности, полученное в рамках комплексных исследований. Согласно практике, сложившейся в Российской Федерации, изучение аллергенного потенциала пищевой продукции нового вида представляет собой один из важнейших этапов оценки безопасности, требующий непрерывного научного обеспечения в части совершенствования методологии этих исследований [2].
Доказано, что аллергенный профиль пищевой продукции изменяется в зависимости от способа ее технологической обработки. Одним из эффективных инструментов снижения аллергенности посредством разрушения конформационных или линейных эпитопов, пептидных связей, образования низкомолекулярных (корот-коцепочечных) пептидов и аминокислот, модификации структуры аллергенов (в том числе снижения способности IgE-связывания) служит технология ферментативного гидролиза [3, 4]. Короткоцепочечные пептиды и свободные аминокислоты теряют способность взаимодействовать с антиген-презентирующими Т-клетками и индуцировать реакцию дегрануляции клеток-мишеней. По разным оценкам, молекулярная масса пептидов, ниже которой аллергенность гидролизата становится минимальной, составляет ~3,5-10 кДа [5-7]. Однако на практике ферментативный гидролиз может и не оказать влияния на IgE-эпитопы аллергена или привести к образованию новых эпитопов вместо существующих. Также сохранность антигенных свойств ферментативного гидролизата обусловлена наличием низкомолекулярных пептидов, которые образуют иммуногенные комплексы с высокомолекулярными ингредиентами в составе пищевых продуктов [8, 9].
Цель исследования - на модели системной анафилаксии у крыс изучить аллергенный потенциал белковых гидролизатов метанокисляющих бактерий и сформировать подходы к оценке безопасности пищевой продукции нового вида.
Материали методы
Исследования являются частью комплексного изучения пищевой ценности [10-12] и безопасности белковых гидролизатов метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus. Материалом для эксперимен-
тов в рамках данной публикации послужили белковые гидролизаты метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus: кислотный гидролизат (1-й эксперимент), полученный методом гидролиза соляной кислотой в мягких условиях, и ферментативный гидролизат (2-й эксперимент), полученный при помощи комплекса ферментных препаратов - амилазы, липазы и проте-азы. Дизайны обоих экспериментов были идентичны. Исследования длительностью 30 дней каждый воспроизведены на модели системной анафилаксии индуцированного анафилактического шока на крысах-самцах линии Вистар поколения F1, выведенных от животных, получавших экспериментальные рационы на протяжении всего периода онтогенеза. Животные были разделены на группы: в рамках 1-го эксперимента -на 1-ю контрольную (n=30) и 1-ю опытную (n=30), в рамках 2-го эксперимента - на 2-ю контрольную (n=30) и 2-ю опытную (n=30). Исходный возраст крыс в 1-м эксперименте составлял ~41 день, во 2-м эксперименте - ~36 дней. Крысы 1-й и 2-й контрольных групп получали полусинтетический казеиновый рацион [13], 1-й опытной - рацион с добавлением кислотного гидролизата (12 г/100 г рациона), 2-й опытной - с добавлением ферментативного гидролизата (28 г/100 г рациона). Замену ингредиентов рациона опытных групп производили с учетом содержания белка, жиров, углеводов и пищевых волокон во вводимом продукте при соблюдении принципа изокалорийности и идентичности химического состава.
Аллергенный потенциал белковых гидролизатов изучен на модели системной анафилаксии у крыс, воспроизведенной в соответствии с МУ 2.3.2.3388-16 «Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения с комбинированными признаками», с незначительными модификациями [2]. На 1, 3, 5-е сутки эксперимента крыс внутрибрюшинно сенсибилизировали овальбумином куриного яйца (ОВА). На 21-й день после первой сенсибилизации однократно вводили ОВА для индукции вторичного иммунного ответа. На 29-е сутки внутривенно вводили разрешающую дозу ОВА. В течение 1-х суток после этого оценивали тяжесть реакции анафилаксии, выраженной в баллах. Интенсивность гуморального иммунного ответа определяли по концентрации циркулирующих специфических IgG к ОВА, выполняющих у животных данной линии функцию аллергических антител.
Изучение цитокинового профиля сыворотки крови крыс [гранулоцитарно-макрофагальный колониестиму-лирующий фактор, интерферон у, интерлейкин (ИЛ)10, ИЛ-12(р70), ИЛ-13, ИЛ-1а, ИЛ-1р, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, фактор некроза опухоли а] проводили методом мультиплексного анализа (панель Bio-Plex Pro™ Rat Cytokine 12-Plex, Bio-Rad, США) на проточном анализаторе Luminex 200 (Luminex Corporation, США).
Крыс содержали в пластиковых клетках с древесной подстилкой (по 2 особи в клетке), в отапливаемом (при температуре от 20 до 24 °С) и вентилируемом помещении
Таблица 1. Тяжесть активного анафилактического шока и интенсивность гуморального иммунного ответа крыс-самцов линии Вистар Table 1. Active anaphylactic shock severity and intensity of humoral immune response in male Wistar rats
Показатель Indicator 1-й эксперимент (кислотный гидролизат) Experiment 1 (acid hydrolysate) 2-й эксперимент (ферментативный гидролизат) Experiment 2 (enzymatic hydrolysate)
1-я контрольная группа control 1 group (n=30) 1-я опытная группа test 1 group (n=30) 2-я контрольная группа control 2 group (n=30) 2-я опытная группа test 2 group (n=30)
Тяжесть активного анафилактического шока (ААШ) / Active anaphylactic shock severity (AAS)
Летальность Mortality n 19 25 17 7
р <0,05t <0,05t
Частота тяжелых реакций ААШ (+++ и ++++) Incidence of severe AAS reactions (+++ and ++++) % 63 83 57 24
р <0,05t <0,05t
Сумма антител (IgG1 и IgG4) в сыворотке крови (до введения разрешающей дозы) The sum of the serum antibodies (IgG1 and IgG4) (before shocking dose)
M±m, мг/мл / mg/ml 2,89±1,87 3,22±1,27 3,02±0,31 5,46±0,55
р >0,05# <0,05#
П р и м е ч а н и е. Отличие от соответствующей контрольной группы: # - согласно непараметрическому критерию Манна-Уитни; f - согласно точному U-тесту Фишера.
N o t e. Difference from the corresponding control group: # - according to the nonparametric Mann-Whitney test; f - according to Fisher's exact U-test.
с естественным освещением, доступ к корму и воде - ad libitum. На протяжении эксперимента вели ежедневные наблюдения за внешним видом, поведением, поедаемо-стью корма и общим состоянием животных, массу тела крыс измеряли еженедельно. Работу с животными проводили в соответствии с ГОСТ 33215-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур» и ГОСТ 33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами».
Статистическую обработку данных осуществляли при помощи программы SPSS Statistics 23 (IBM, США), с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни, точного теста Фишера, многомерного критерия х2, рангового двухфакторного дисперсионного анализа. Проверку нормальности распределения полученных данных осуществляли методом Колмогорова-Смирнова, однородности дисперсии - с помощью теста Левена. Во всех случаях различия признавали достоверными на уровне значимости р<0,05. Результаты исследований представлены в виде М±т, где М - среднее значение показателей, т - стандартная ошибка.
Результаты и обсуждение
Общее состояние животных в течение каждого эксперимента было удовлетворительным, гибели крыс не отмечено. Крысы 1-й опытной группы, получавшие кислотный гидролизат, в отличие от 3 других групп, демонстрировали сниженную двигательную активность, а также повышенный уровень тревожности и низкий прирост массы тела. В конце эксперимента масса тела
крыс 1-й опытной группы составляла 282±3 г и была на 18% (p<0,05) ниже, чем у крыс 1-й контрольной группы (343±4 г); во 2-й опытной группе масса тела крыс значимо не отличалась от таковой у крыс 2-й контрольной группы, составив 349±5 против 339±5 г (p>0,05).
Тяжесть системной анафилаксии у крыс 1-й опытной группы, получавших с рационом кислотный гидролизат, была на 20% (p<0,05) выше, чем у животных 1-й контрольной группы, у крыс 2-й опытной группы - на 33% (p<0,05) ниже, чем у соответствующей контрольной группы (табл. 1). Оценка интенсивности гуморального иммунного ответа показала незначительное статистически недостоверное повышение суммы антител IgG1 + IgG4 у крыс 1-й опытной группы по сравнению с соответствующей контрольной группой - на 11% (p>0,05), величина данного показателя у крыс 2-й опытной группы была статистически значимо - на 81% (p<0,05) выше, чем у крыс 2-й контрольной группы.
Изучение цитокиновых профилей сыворотки крови выявило повышение их концентрации у крыс обеих опытных групп по сравнению с соответствующими контролями: у крыс 1-й опытной группы 8 из 12 показателей превышали контрольные значения на 4-69% (p>0,05), у крыс 2-й опытной группы 7 из 12 показателей превышали контрольные значения на 5-19% (p>0,05), а 2 из 12 - на 88-191% (p<0,05) (табл. 2). Полученные данные были обработаны с помощью непараметрического рангового двухфакторного дисперсионного анализа, в рамках которого подтверждено влияние технологии гидролиза белка метанокисляющих бактерий (кислотный/ферментативный), а также влияние источника белка рациона (казеин/гидролизат метанокисляющих бактерий) (см. табл. 2).
Проведенные исследования показали, что в обеих группах сенсибилизированных крыс, получавших раци-
Таблица 2. Концентрация цитокинов в сыворотке крови крыс-самцов линии Вистар, выживших после введения разрешающей дозы овальбу-мина (M±m), пг/мл
Table 2. Serum cytokine levels of surviving male Wistar rats after ovalbumin shocking dose (M±m), pg/ml
Показатель Indicator 1-й эксперимент (кислотный гидролизат) Experiment 1 (acid hydrolysate) 2-й эксперимент (ферментативный гидролизат) Experiment 2 (enzymatic hydrolysate) Фактор ** Factor**
1-я контрольная группа control 1 group (n=11) 1-я опытная группа test 1 group (n=5) 2-я контрольная control 2 group (n=13) 2-я опытная test 2 group (n=23)
Провоспалительные цитокины / Pro-inflammatory cytokines
ИЛ-1а / IL-1a 0,150±0,017 0,174±0,023 0,240±0,017 0,286±0,026 А, Б
ИЛ-Iß / IL-1ß 0,100±0,014 0,169±0,044 0,244±0,019 0,459±0,077 к А, Б
ИЛ-6 / IL-6 1,698±0,192 1,614±0,201 1,727±0,130 1,757±0,191 -
ФНОа / TNFa 0,627±0,072 0,626±0,109 0,644±0,058 0,674±0,061 -
ГМ-КСФ / GM-CSF 0,050±0,009 0,085±0,020 0,144±0,015 0,419±0,105 к А, Б
Thl-регуляторы клеточного иммунного ответа / Th1-regulators of the cellular immune response
ИЛ-2 / IL-2 5,404±0,671 5,450±1,033 5,655±0,718 6,356±1,235 -
ИЛ-12(р70) / IL-12(p70) 0,639±0,089 0,707±0,151 0,760±0,081 0,856±0,143 -
ИФН-у / IFN-y 0,384±0,042 0,360±0,048 0,859±0,084 0,944±0,136 А
^2-регуляторы гуморального иммунного ответа / Th2-regulators of humoral immune respons
ИЛ-4* / IL-4* 0,112±0,013 0,122±0,016 0,193±0,016 0,217±0,025 А
ИЛ-5 / IL-5 0,908±0,051 0,942±0,075 1,457±0,117 1,608±0,141 А
ИЛ-10* / IL-10* 0,147±0,015 0,176±0,026 0,220±0,017 0,227±0,023 А
ИЛ-13* / IL-13* 0,657±0,067 0,515±0,081 0,986±0,085 1,008±0,117 А
П р и м е ч а н и е. Th1 - Т-хелперы 1-го типа; Th2 - Т-хелперы 2-го типа; ГМ-КСФ - колониестимулирующий фактор; ФНОа - фактор некроза опухоли а; ИФН-у - интерферон у; * - противовоспалительные цитокины; к - статистически значимое отличие (p<0,05) от показателя животных соответствующей контрольной группы согласно непараметрическому ранговому тесту Манна-Уитни; ** - фактор, со стороны которого влияние достоверно (p<0,05) согласно непараметрическому ранговому двухфакторному дисперсионному анализу: А - технология гидролиза белка метанокисляющих бактерий (кислотный/ферментативный); Б - источник белка рациона (казеин/гидролизат метанокисляющих бактерий).
N o t e. Th1 - T-helper type 1; Th2 - T-helper type 2; GM-CSF - colony-stimulating factor; TNF-а - tumor necrosis factor а; IFN-y -interferon y; * - anti-inflammatory cytokines; к - statistically significant difference (p<0.05) from the corresponding control group (nonparametric Mann-Whitney rank test); ** - factor, the influence of which is reliable (p<0.05) according to the nonparametric rank two-factor analysis of variance: A - technology of hydrolysis of protein of methane-oxidizing bacteria (acid/enzymatic); Б - source of dietary protein (casein/hydrolysate of methane-oxidizing bacteria).
оны с добавлением кислотного и ферментативного гидролизатов белка М. оарзиашэ, наблюдался рост аллергической реактивности, выраженный в повышении содержания иммуноглобулинов и цитокинов. Увеличение летальности и частоты шоковых реакций, отмеченное у получавших кислотный гидролизат крыс 1-й опытной группы, может быть опосредованно связано с неполной реализацией потенциала физического развития этих животных, о чем свидетельствует низкая масса тела в конце эксперимента, которая явилась причиной их низкой устойчивости при воздействии индуцированного анафилактического шока [14, 15].
Уменьшение прироста массы тела у крыс 1-й опытной группы при одинаковом содержании белка в рационах опытных и контрольных групп может быть обусловлено плохой поедаемостью из-за неудовлетворительных органолептических свойств исследуемого гидролизата (горький вкус) и его низкой биологической ценностью (дефицит триптофана) [16].
Вероятной причиной горького вкуса гидролизата является повышение содержания образовавшихся в процессе кислотного гидролиза свободных аминокислот и пептидов (с молекулярной массой <1 кДа), а также пептидов, содержащих концевые гидрофобные аминокислоты. Кроме того, кислотный гидролиз приводит
к разрушению незаменимых аминокислот (триптофана, метионина, цистеина и др.), снижая биологическую ценность белковых концентратов [6, 17]. Повышение аллергической реактивности у крыс этой группы также может быть связано с присутствием в кислотных гидролизатах продуктов рацемизации аминокислот р-аминокислот) [18, 19].
Потребление сенсибилизированными крысами 2-й опытной группы рациона с добавлением ферментативного гидролизата не увеличивало тяжесть реакции системной анафилаксии по сравнению с контрольными животными, получавшими стандартный рацион, однако вызывало повышение уровней иммуноглобулинов и цитокинов. Следовательно, с определенной долей уверенности можно предположить, что изучаемый продукт демонстрировал остаточную антигенность, обусловленную в том числе наличием иммуногенных комплексов, образовавшихся в результате связывания низкомолекулярных пептидов с макромолекулами [8, 20, 21].
Несмотря на очевидные преимущества технологии ферментативного гидролиза, не всегда достигается требуемая степень расщепления белка и разрушение областей антигенных детерминант. Имеются основания полагать, что дальнейшая корректировка технологии гидролиза, с учетом специфичности ферментов (сайтов
гидролиза), а также данных эпитопного картирования аллергенов, позволит получить продукт с оптимальным молекулярно-массовым распределением и низкой остаточной антигенностью.
Таким образом, анализ полученных данных позволил сформировать подходы к оценке безопасности пищевой продукции нового вида. Во-первых, in vitro блок исследований гидролизата должен включать определение степени гидролиза, молекулярно-массового распределения пептидных фракций и остаточной антиген-ности продукта; во-вторых, in vivo блок исследований на модели системной анафилаксии у крыс (индуцированного анафилактического шока) должен включать изучение расширенного пула показателей тяжести активного анафилактического шока (летальность, число тяжелых реакций анафилаксии, анафилактический индекс); цитокинового профиля сыворотки крови (содержание про- и противовоспалительных цитокинов, регуляторов клеточного и гуморального иммунного ответа), а также
Сведения об авторах
иммуноглобулинов класса IgG1, IgG4 и патоморфологи-ческую характеристику лимфоидной ткани иммуноком-петентных органов.
Заключение
Результаты исследования аллергенного потенциала белковых гидролизатов метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus на модели системной анафилаксии у крыс свидетельствуют о перспективности использования ферментативного гидролиза, однако для создания продукта с низкой остаточной антигенностью и иммуногенностью необходима дальнейшая оптимизация технологии.
На основании анализа полученных данных были сформированы подходы к оценке безопасности пищевой продукции нового вида, включающие выполнение исследований in vitro и in vivo.
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация):
Требух Марина Дмитриевна (Marina D. Trebukh) - младший научный сотрудник лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4077-1593
Садыкова Эльвира Олеговна (Elvira O. Sadykova) - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи E-mail: [email protected]
https://orcid.org/0000-0001-5446-5653
Шумакова Антонина Александровна (Antonina A. Shumakova) - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1373-4436
Шестакова Светлана Игоревна (Svetlana I. Shestakova) - научный сотрудник лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-0279-4134
Литература
1. Мезенова О.Я. Современная пищевая биотехнология: основные проблемы и вызовы // Вестник Международной академии холода. 2023. № 1. С. 35-46. DOI: https://doi.org/10.17586/1606-4313-2023-22-1-35-46
2. Требух М.Д., Тышко Н.В., Садыкова Э.О., Никитин Н.С., Гмошинский И.В. Изучение влияния биомассы личинок черной львинки (Hermetia illucens) на иммунный статус крыс // Вопросы питания. 2024. Т. 93, № 2. С. 41-51. DOI: https://doi.org/10.33029/ 0042-8833-2024-93-2-41-51
3. Liang X., Wang Z., Yang H., Luo X., Sun J., Yang M. et al. Evaluation of allergenicity of cow milk treated with enzymatic hydrolysis through a mouse model of allergy // J. Dairy Sci. 2022. Vol. 105, N 2. Р. 1039-1050. DOI: https://doi.org/10.3168/jds.2021-20686
4. Woern C., Grossmann L. Microbial gas fermentation technology for sustainable food protein production // Biotechnol. Adv. 2023. Vol. 69. Article ID 108240 DOI: https://doi.org/10.1016/j.biotechadv. 2023.108240
5. Лукушкина Е.Ф., Баскакова Е.Ю., Афраймович М.Г., Гуренко С.П., Власова И.Н., Кузмичев Ю.Г. Роль смесей на основе высокогидролизованных белков молочной сыворотки в питании детей с различной патологией // Вопросы современной педиатрии. 2015. Т. 14, № 1. С. 48-54.
6. Макарова И.В., Коростовцев Д.С., Трусова О.В. Эффективность применения смеси на основе гидролизата сывороточных белков «Нутрилон Пепти ТСЦ» в диетотерапии детей с аллергией к белкам коровьего молока // Педиатрия. Журнал имени Г.Н. Сперанского. 2006. Т. 85, № 3. С. 45-49.
7. Семенова Е.С., Симоненко Е.С., Симоненко С.В., Зорин С.Н., Петров Н.А., Мазо В.К. Исследование параметров процесса гидролиза белков молока с использованием ферментных препаратов отечественного производства // Пищевые системы. 2023. Т. 6, № 2. С. 224-232. DOI: https://doi.org/10.21323/2618-9771-2023-6-2-224-232
8. Зорин С.Н. Ферментативные гидролизаты пищевых белков для специализированных пищевых продуктов диетического (лечебного и профилактического) питания // Вопросы питания. 2019. Т. 88, № 3. С. 23-31. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2019-10026
9. Громов Д.А., Борисова А.В., Бахарев В.В. Пищевые аллергены и способы получения гипоаллергенных пищевых продуктов // Техника и технология пищевых производств. 2021. Т. 51, № 2. С.232-247. DOI: https://doi.org/10.21603/2074- 9414-2021-2-232-247
10. Садыкова Э.О., Требух М.Д., Никитин Н.С., Шестакова С.И., Шумакова А.А., Макаренко М.А., Тышко Н.В. Альтернативные источники пищевого белка: концентрат из бактерий Methylococcus capsulatus, характеристика состава и биологическая
ценность // Вопросы питания. 2023. Т. 92, № 3. С. 36—44. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-3-36-44
11. Тышко Н.В., Шестакова С.И., Шумакова А.А. Биологическая ценность белкового концентрата на основе Methylococcus 17. capsulatus ГСБ-15 // Международный конгресс биотехнология: состояние и перспективы развития : сборник. Москва, 2022.
С. 199-201. DOI: https://doi.org/10.37747/2312-640X-2022-20-199-201
12. Котова Д.С., Требух М.Д., Садыкова Э.О. Анализ аминокислотного состава белкового концентрата, полученного инновационными 18. биотехнологическими методами микробного синтеза // Материалы XVIII Всероссийского конгресса с международным участием «Нутрициология и диетология для здоровьесбережения населения России» : сборник. Москва, 2023. С. 243. DOI: https:// 19. doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-5s-302
13. Тышко Н.В., Жминченко В.М., Пашорина В.А., Селяскин К.Е., Мельник Е.А., Мустафина О.К. и др. Сравнительная характеристика влияния экспериментальных рационов на рост и развитие крыс // Вопросы питания. 2011. Т. 80, № 5. С. 30-38. 20.
14. Daly J.M., Reynolds J., Sigal R.K., Shou J., Liberman M.D. Effect of dietary protein and amino acids on immune function // Crit. Care Med. 1990. Vol. 18, suppl. 2. Р. S86-S93. DOI: https://doi.org/10.1097/ 00003246-199002003-00002
15. Tourkochristou E., Triantos C., Mouzaki A. The influence of nutritional 21. factors on immunological outcomes // Front. Immunol. 2021. Vol. 12. Article ID 665968. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.665968
16. Садыкова Э.О., Требух М.Д., Никитин Н.С., Шестакова С.И., Шумакова А.А., Макаренко М.А. и др. Альтернативные источники пищевого белка: концентрат из бактерий Methylococcus
capsulatus, характеристика состава и биологическая ценность // Вопросы питания. 2023. Т. 92, № 3. С. 36-44. DOI: https://doi. org/10.33029/0042-8833-2023-92-3-36-44
Костылева Е.В., Середа А.С., Великорецкая И.А., Курбатова Е.И., Цурикова Н.В. Использование протеолитических ферментов для получения белковых гидролизатов пищевого назначения из вторичного сырья // Вопросы питания. 2023. Т. 92, № 1. С. 116-132. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-1-116-132 Gao R., Yu Q., Shen Y., Chu Q., Chen G., Fen S. et al. Production, bioactive properties, and potential applications of fish protein hydroly-sates: developments and challenges // Trends Food Sci. Technol. 2021. Vol. 110. Р. 687-699. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tifs.2021.02.031 Yarnpakdee S., Benjakul S., Kristinsson H.G., Kishimura H. Antioxidant and sensory properties of protein hydrolysate derived from Nile tilapia (Oreochromis niloticus) by one- and two-step hydrolysis // J. Food Sci. Technol. 2015. Vol. 52, N 6. Р. 336-349. DOI: https://doi. org/10.1007/s13197-014-1394-7
Зорин С.Н., Сидорова Ю.С., Мазо В.К. Ферментативные гидро-лизаты белков молочной сыворотки и куриного яйца: получение, физико-химическая и иммунохимическая характеристики // Вопросы питания. 2020. Т. 89, № 1. С. 64-68. DOI: https://doi. org/10.24411/0042-8833-2020-10007
Симоненко Е.С., Симоненко С.В., Гмошинский И.В., Ригер Н.А., Шумакова А.А., Зорин С.Н. Влияние лактоферрина и ферментативных гидролизатов белков коровьего и кобыльего молока на анафилактическую чувствительность и цитокиновый профиль крыс // Вопросы питания. 2024. Т. 93, № 2. С. 31-40. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2024-93-2-31-40
References
10.
11.
Mezenova O.Ya. Modern food biotechnology: main problems and challenges. Vestnik Mezhdunarodnoy akademii kholoda [Journal of International Academy of Refrigeration]. 2023; (1): 35—46. DOI: https://doi. org/10.17586/1606-4313-2023-22-1-35-46 (in Russian) Trebukh M.D., Tyshko N.V., Sadykova E.O., Nikitin N.S., Gmoshinski I.V. Impact of black soldier fly (Hermetia illucens) larvae biomass on the immune status of rats. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2024; 93 (2): 41-51. DOI: DOI: https://doi. org/10.33029/0042-8833-2024-93-2-41-51 (in Russian) Liang X., Wang Z., Yang H., Luo X., Sun J., Yang M., et al. Evaluation of allergenicity of cow milk treated with enzymatic hydrolysis through a mouse model of allergy. J Dairy Sci. 2022; 105 (2): 1039-50. DOI: https://doi.org/10.3168/jds.2021-20686
Woern C., Grossmann L. Microbial gas fermentation technology for sustainable food protein production. Biotechnol Adv. 2023; 69: 108240 DOI: https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2023.108240 Lukushkina E.F., Baskakova E.Yu., Afraymovich M.G., Gurenko S.P., Vlasova I.N., Kuzmichev Y.G. Place of the extensively hydrolyzed cow's milk protein-based formulas in the diet of children with different pathologies. Voprosy sovremennoy pediatrii [Problems of Modern Pediatrics]. 2015; 14 (1): 48-54 (in Russian)
Makarova I.V., Korostovtsev D.S., Trusova O.V. Effectiveness of using a mixture based on whey protein hydrolysate «Nutrilon Pepti TSC» in diet therapy of children with allergy to cow's milk proteins. Pediatriya. Zhurnal imeni G.N. Speranskogo [Pediatrics Journal named after G.N. Speransky]. 2006; 85 (3): 45-9. (in Russian) Semenova E.S., Simonenko E.S., Simonenko S.V., Zorin S.N., Petrov N.A., Mazo V.K. Study of parameters of milk proteins hydrolysis with the help of Russian-produced enzyme preparations. Pish-chevye sistemy [Food Systems]. 2023; 6 (2): 224-32. DOI: https://doi. org/10.21323/2618-9771-2023-6-2-224-232 (in Russian) Zorin S.N. Enzymatic hydrolysates of foods for therapeutic and prophylactic nutrition. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2019; 88 (3): 23-31. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2019-10026 (in Russian) Gromov D.A., Borisova A. V., Bakharev V.V. Food allergens and methods for producing hypoallergenic foods. Tekhnika i tekhnologiya pischevykh proizvodstv [Technique and Technology of Food Production]. 2021; 51 (2): 232-47. DOI: https://doi.org/10.21603/2074- 94142021-2-232-247 (in Russian)
Sadykova E.O., Trebukh M.D., Nikitin N.S., Shestakova S.I., Shuma-kova A.A., Makarenko M.A., Tyshko N.V. Alternative protein sources: bacteria Methylococcus capsulatus concentrate, characteristic of composition and biological value. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2023; 92 (3): 36-44. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-3-36-44 (in Russian)
Tyshko N.V., Shestakova S.I., Shumakova A.A. Biological value of protein concentrate from Methylococcus capsulatus strain GSB-15. In: International Congress: Biotechnology: State of the Art and Perspectives. Moscow, 2022: 199-201. DOI: https://doi.org/10.37747/2312-640X-2022-20-199-201 (in Russian)
12.
13.
14.
15.
19.
20.
21.
Kotova D.S., Trebukh M.D., Sadykova E.O. Analysis of amino acid composition of protein concentrate obtained by innovative biotechno-logical methods of microbial synthesis. In: Proceedings of the XVIII All-Russian Congress with international participation «Nutriciology and Nutrition for Health-Saving Population of Russia». Moscow, 2023: 243. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-5s-302 (in Russian)
Tyshko N.V., Zhminchenko V.M., Pashorina V.A., Selyaskin K.E., Mel'nik E.A., Mustafina O.K., et al. A comparative assessment of the diet influence on growth and development of rats. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2011; 80 (5): 30-8. (in Russian) Daly J.M., Reynolds J., Sigal R.K., Shou J., Liberman M.D. Effect of dietary protein and amino acids on immune function. Crit Care Med. 1990; 18 (suppl 2): S86-93. DOI: https://doi.org/10.1097/00003246-199002003-00002
Tourkochristou E., Triantos C., Mouzaki A. The influence of nutritional factors on immunological outcomes. Front Immunol. 2021; 12: 665968. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.665968 Sadykova E.O., Trebukh M.D., Nikitin N.S., Shestakova S.I., Shuma-kova A.A., Makarenko M.A., et al. Alternative protein sources: bacteria Methylococcus capsulatus concentrate, characteristic of composition and biological value. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2023; 92 (3): 36-44. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-3-36-44 (in Russian)
Kostyleva E.V., Sereda A.S., Velikoretskaya I.A., Kurbatova E.I., Tsurikova N.V. Proteases for obtaining of food protein hydrolysates from proteinaceous by-products. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2023; 92 (1): 116-32. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-1-116-132 (in Russian)
Gao R., Yu Q., Shen Y., Chu Q., Chen G., Fen S., et al. Production, bioactive properties, and potential applications of fish protein hydro-lysates: developments and challenges. Trends Food Sci Technol. 2021; 110: 687-99. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tifs.2021.02.031 Yarnpakdee S., Benjakul S., Kristinsson H.G., Kishimura H. Anti-oxidant and sensory properties of protein hydrolysate derived from Nile tilapia (Oreochromis niloticus) by one- and two-step hydrolysis. J Food Sci Technol. 2015; 52 (6): 336-49. DOI: https://doi.org/10.1007/s13197-014-1394-7
Zorin S.N., Sidorova Yu.S., Mazo V.K. Enzymatic hydrolysates of whey protein and chicken egg protein: production, physical-chemical and immunochemical characteristics. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2020; 89 (1): 64-8. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2020-10007 (in Russian)
Simonenko E.S., Simonenko S.V., Gmoshinsky I.V., Riger N.A., Shumakova A.A., Zorin S.N. Influence of lactoferrin and enzymatic hydrolysates of cow's and mare's milk proteins on anaphylactic sensitivity and cytokine profile of rats. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2024; 93 (2): 31-40. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2024-93-2-31-40 (in Russian)
2
4
6
7
8.
9
