CC BY
35
М. А. Носов, А. Флюгель, Е. А. Корнева РЕГУЛЯТОРНЫЕ ФЕНОМЕНЫ,
ВЫЗВАННЫЕ ЭНЦЕФАЛИТОГЕННЫМИ Т-КЛЕТКАМИ НА ПЕРИФЕРИИ И В ЦНС В ПРОЦЕССЕ РАЗВИТИЯ АДОПТИВНОГО ПЕРЕНОСНОГО ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО АУТОИММУННОГО ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА
Отдел общей патологии и патологической физиологии учреждения РАМН НИИ «Институт Экспериментальной Медицины» СЗО РАМН, Санкт-Петербург, Россия Отдел экспериментальной и клинической нейроиммунологии,
Институт изучения рассеянного склероза, Геттинген, Германия
Введение. Адоптивный переносной экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) является моделью для изучения Т-клеточной составляющей патогенеза рассеянного склероза и вызывается введением активированных лимфоцитов, сенсибилизированных к основному белку миелина (МБР) [1, 2]. Модификация адоптивной модели ЭАЭ, предложенная А. П^е1, позволила доставить в энцефалитогенные Т-клетки (ЭГТК) ген зеленого флуоресцирующего белка и отследить пути миграции и изменение фенотипа этих клеток на различных этапах развития ЭАЭ [3, 4]. Переносной экспериментальный энцефаломиелит — монофазное нейродегенеративное заболевание, протекающее в 3 этапа. Преклинический этап заболевания длится 2-3 дня с момента введения Т-клеток и характеризуется отсутствием клинических проявлений. На этой стадии миелин сенсибилизированные Т-лимфоциты не проявляют патологической активности и мигрируют через различные органы. Не имея никаких проявлений, преклиническая стадия необходима для созревания Т-клеток. В конце преклинической фазы наблюдается аккумуляция ЭГТК в селезенке и их последующая миграция в ЦНС. На втором этапе мигрировавшие в ЦНС ЭГТК активируются и провоцируют возникновение очагов воспаления, незначительную демиелинизацию и нарушение приводимости нейронов с последующими параличами. На последней стадии (7-10 день после введения ЭГТК) воспаление в ЦНС затухает, и двигательная активность восстанавливается [5].
Присутствие пяти миллионов активированных ЭГТК в различных органах на пре-клиническом этапе развития ЭАЭ в течение первых 3-х суток, до их миграции в ЦНС, не может не вызвать ответной паракринной и аутокринной регуляторной реакции, выражающейся, например, в продукции противовоспалительных цитокинов (интерлейкина 10 (1Ь-10), трансформирующего фактора роста бэтта (ТСЕв) или ответа со стороны нейро-эндокринной системы. [6, 7, 8]. Используя инъекции различного количества активированных ЭГТК, мы попытались определить локализацию, интенсивность и эффективность эндогенной иммунорегуляции, в ответ на их введение, на преклинических этапах развития переносного ЭАЭ, что позволит искать способы экзогенной активации механизмов регуляции, подавляющих активность энцефалитогенных клеток.
© М. А. Носов, А. Флюгель, Е. А. Корнева, 2010
Методы исследования
Антиген сенсибилизированные лимфоциты, их генетическая модификация и индукция ЭА Э. Методы получения антиген сенсибилизированных лимфоцитов и их генетическая модификация были описаны ранее в работе A. Fluegel [3].
Для трансдукции лимфоцитов были использованы векторы, созданные на основе ретровируса мышиных стволовых клеток pMSCVneo (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany) и экспрессирующие красный флуоресцентный белок (RFP), или тимидин киназу вируса простого герпеса первого типа совместно с зеленым флуоресцентным белком в бицистронной кассете (GFP-IRES-TK) под LTR промотором. ЭАЭ был индуцирован внутривенным введением активированных лимфоцитов, после чего животных ежедневно осматривали для своевременного выявления клинических симптомов и взвешивали. Клинические симптомы определяли в соответствии со следующей шкалой: 0,5 — ослабление тонуса хвоста; 1 — паралич хвоста; 2 — нарушение походки; 3 — паралич задних конечностей; 4 — тетрапарез; 5 — смерть.
Крысы инбредной линии Lewis были получены из вивария института Биохимии Макса Планка (Мартинсрид, Германия). Животные содержались в стандартных условиях, постоянной температуре окружающей среды (+22°С), 12-часовом световом дне и свободном доступе к воде и пище. Инъекции ганцикловира (GCV) осуществлялись вну-трибрюшинно, ежедневно начиная со дня введения лимфоцитов (20 мг на килограмм веса животных).
Подсчет клеток проточной цитометрией. Для подсчета клеток проточной цитометрией производили забор органов на различных сроках после внутривенного введения активированных MBP-сенсибилизированных Т-клеток (3 х 106, 5 х 106 или 9 х 106 клеток). Органы помещали на лед и взвешивали. Для анализа забирали: селезенку, околотимические лимфатические узлы (parathymic nodes — PT LNs), и спинной мозг. Селезенку гомогенизировали через металлический фильтр, после чего обрабатывали ACK буфером для лизирования эритроцитов. Белые кровяные клетки отмывали и ре-суспендировали в фосфатном буфере для дальнейшего подсчета. Лимфатические узлы выделяли, гомогенизировали и клетки отмывали фосфатным буфером. Спинной мозг гомогенизировали и клетки помещали на Nycodens градиент для выделения лимфоцитов. Флуоресцентные гранулы добавляли в пробу для проточной цитометрии в определенном количестве, что позволило подсчитать общее количество ЭГТК в образце. Цитометрию проводили на FACS Calibur (BD).
Количественная ПЦР. Для анализа уровня экспрессии про- и противовоспалительных цитокинов в спинном мозге, лимфатических узлах и селезенке использовали метод количественной ПЦР. Органы забирали и ресуспендировали в TRIZol (Invitrogen, USA). RNA изолировали и синтезировали кДНК согласно протоколу производителя (RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas). Количественную ПЦР производили TaqMan методом с использованием Maxima™ Probe qPCR Master Mix (Fermentas).
Результаты
Сравнительный анализ клинических симптомов и распределения ЭГТК в ЦНС, селезенке и лимфатических узлах в зависимости от количества введенных сенсибилизированных лимфоцитов. Клинические симптомы (КС) ЭАЭ и изменение веса животных отслеживали с момента внутривенного введения 3-х или 9-ти миллионов активированных ЭГТК, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок. Введение
ЦНС Селезенка ЛУ Рис. 1. Динамика изменения клинических симптомов ЭАЭ при инъекции 3х106 ЭГТК (А) и 9х106 ЭГТК (Б) и их инфильтрация в ЦНС.
А и Б: столбики — интенсивность проявления клинических симптомов, в условных единицах. Линии — изменение веса. В — Удельное количество ЭГТК в ткани ЦНС, селезенке и лимфатических узлах на четвертый день после введения ЭГТК клеток.
3-х миллионов ЭГТК вызывает проявление незначительных клинических симптомов, выраженных в ослаблении тонуса хвоста на третьи сутки только у части животных. Выраженные параличи наступают на 4-е сутки (рис. 1А). При введении 9 миллионов ЭГТК, клиническая картина развития ЭАЭ явно представлена на третьи сутки после введения, и длительность забеливания пролонгирована на 1 сутки по сравнению с ее продолжительностью у животных, получивших инъекцию 3-х миллионов ЭГТК (рис. 1Б). Тем не менее, максимальные значения КС при введении 3-х или 9-ти миллионов ЭГТК различаются незначительно, а различия в динамике изменения веса животных не достоверны (рис. 1А и Б).
Так же было проанализировано количество клеток в селезенке, околотимических лимфатических узлах (ЛУ) и спинном мозге (ЦНС) при введении различного количества ЭГТК на четвертые сутки. Обнаружено, что инфильтрация ЭГТК в ЦНС у животных, получивших инъекцию 9-ти миллионов клеток на 80 процентов больше по сравнению с их количеством у животных, которым вводили 3 миллиона клеток (рис. 1В). Увеличение количества ЭГТК в селезенке при инъекции 9-ти миллионов клеток составило примерно 50 процентов от числа, обнаруженного при введении 3-х миллионов клеток, а в лимфоузлах их количество не зависело от количества введенных клеток (рис. 1В).
Экспрессия про- и противовоспалительных маркеров в ЦНС и селезенке. Исследована экспрессия интерферона гамма (№N7), интерлейкина-10 (1Ь-10), трансформирующего фактора роста бета (ТСРв) и индуцированной ситазы окиси азота ^N08) в тканях спинного мозга и селезенке на четвертый день после введения 3-х или 9-ти мил-
ЦНС Селезенка цнс Селезенка
Рис. 2. Изменение уровня экспрессии про- и противовоспалительных цитокинов в ЦНС, селезенке и лимфатических узлах на 4 сутки развития ЭАЭ, вызванного введением 3-х или 9-ти миллионов ЭГТК.
лионов ЭГТК (рис. 2). Экспрессия №N7 обнаружена, главным образом в ЦНС, причем ее интенсивность у животных, получивших инъекцию 9-ти миллионов на 100 процентов выше по сравнению с уровнем экспрессии у животных, которым вводили 3 миллиона ЭГТК. Уровень экспрессии №N7 мРНК в селезенке был значительно ниже, чем в ЦНС. 1Ь-10 и ТОРв мРНК экспрессировались более интенсивно в клетках селезенки по сравнению с мозгом. При этом различия в уровне экспрессии 1Ь-10 мРНК в селезенке после инъекции различного числа ЭГТК не были обнаружены. Изменение количества ТОРв мРНК в селезенке коррелировало с количеством введенных клеток. Интенсивность экспрессии iNOS мРНК была выше в ЦНС после введения 9-ти миллионов ЭГТК по сравнению с ее уровнем у животных, получивших 3 миллиона клеток (рис. 2).
Сравнительный анализ клинических симптомов и распределения ЭГТК при неинвазивном удалении части их популяции гп угуо. Для анализа других возможных механизмов регуляции ЭГТК на преклиническом этапе развития переносного ЭАЭ использовали комбинированное введение ЭГТК, экспрессирующих красный флуоресцентный белок (ЯРР), и/или зеленый флуоресцентный белок совместно с тимидин киназой вируса простого герпеса первого типа (ОРР-ББУ-ТК). Использование системы индуцированного самоубийства—ББУ-ТК/ОСУ дает возможность селективно удалять клетки, экспрессирующие ББУ-ТК (ББУ-ТК+) гп шш, провоцируя их самоубийство введением ганцикловира (ОСУ) —вещества, не токсичного для ББУ-ТК- клеток. В данной серии экспериментов использовали 4 различных комбинации введения ЭГТК: 5 х 106 ЯРР+ ЭГТК; 5 х 106 ОРР+ ЭГТК; 5 х 106 ЯРР+ ЭГТК и 5 х 106 ОРР+-ТК+ ЭГТК; 5 х 106 ЯРР+ ЭГТК и 5 х 106 ОРР+-ТК+ ЭГТК в комбинации с ежедневным введением ОСУ.
Введение ЯРР+ ЭГТК или ОРР+-ТК+ ЭГТК вызывало сходное проявление клинических симптомов с максимумом на 4-й день после введения (рис. ЗА и Б). Совместное введение ЯРР+ ЭГТК и ОРР+-ТК+ ЭГТК приводило к незначительному утяжелению клинической картины, но динамика заболевания оставалась схожей с наблюдаемой при
- Клинические симптомы; ♦ - Изменение веса
Рис. 3. Динамика изменения клинических симптомов ЭАЭ при неинвазивном удалении части популяции ЭГТК.
При введении: А-5х106 ИРР+ ЭГТК, Б-5х106 СРР+ ЭГТК; При совместном введении: В —5х106 СРР+ ЭГТК и 5х106 КРР+ ЭГТК, Г —5х106 СРР+ ЭГТК и 5х106 ИРР+ ЭГТК и ежедневных инъекциях ганцикловира (20 мг/кг веса).
Столбики — интенсивность проявления клинических симптомов. Линии — изменение веса.
Рис. 4. Изменение количества ЭГТК в ЦНС при неинвазивном удалении части популяции введением ганцикловира (20 мг/кг веса).
Количество ИРР+ ЭГТК — А или СРР+ ЭГТК — Б в ЦНС на 4-е сутки после введения ЭГТК: 5х106 ИРР+ ЭГТК; 5х106 СРР+ ЭГТК; 5х 106 ИРР+ ЭГТК И 5х106 СРР+-ТК+ ЭГТК; 5х106 ИРР+ ЭГТК И 5х106 СРР+-ТК+ ЭГТК в комбинации с ежедневным введением ОСУ. * (р<0.05) ^еэ^
раздельном введении клеток (рис. ЗВ). Введение ганцикловира животным, получившим ЯРР+ ЭГТК и ОРР+-ТК+ ЭГТК не привело к значительным изменениям клинических симптомов и динамики веса животных в процессе развития ЭАЭ (рис. ЗГ).
Для анализа распределения ЭГТК в ЦНС производили подсчет количества ЯРР+ и ОРР+-ТК+ клеток на грамм ткани с помощью флуоресцентно активированной про-
точной цитометрии (FACS). Совместное введение RFP+ и клеток приводит к уменьшению инфильтрации ЦНС RFP+ клетками по сравнению с ее интенсивностью, наблюдающейся после введения только RFP+ клеток. Более того, удаление из организма GFP+-TK+ клеток с помощью обработки GCV приводит к компенсаторному увлечению числа RFP+ клеток в ЦНС (рис. 4А). Аналогично, совместное введение RFP+ и GFP+-TK+ клеток приводит к уменьшению инфильтрации ЦНС GFP+ клетками по сравнению с интенсивностью инфильтрации, определяемой после введения только GFP+ клеток. Обработка животных ганцикловиром, после введения RFP+ и GFP+-TK+ ЭГТК предотвращает инфильтрацию мозга GFP+ клетками (рис. 4Б).
Обсуждение. Переносной экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит вызывается введением, in vivo или in vitro, активированных Т-клеток, сенсибилизированных к антигену нервной системы, например основному белку миелина [1, 9]. На преклинической, бессимптомной стадии развития ЭАЭ, введенные клетки мигрируют через периферические органы и органы иммунной системы, что, согласно одной из гипотез, необходимо для формирования «миграционного фенотипа», позволяющего им преодолевать гематоэнцефалический барьер [10, 11]. Присутствие активированных ЭГТК, активно экспрессирующих провоспалительные цитокины, неизбежно активирует аутокринные и паракринные механизмы регуляции воспаления, в частности, продукцию противовоспалительных цитокинов. Можно предположить, что степень выраженности этой реакции должна быть пропорциональна интенсивности воспаления, определяющейся количеством введенных клеток [12]. IL-10 активирует транскрипционный фактор STAT3 в моноцитах, который требуется для активации продукции многих противовоспалительных цитокинов [13, 14]. С другой стороны, присутствие IFNy ведет к активации STAT1 в ответ на стимуляцию интерлекином-10, а соответственно и к активации провоспалительных цитокинов [15]. Таким образом, соотношение IL-10/ IFNy играет важную роль в выборе пути развития иммунной реакции, и в случае дисбаланса может приводить как к невосприимчивости иммунной системы к инфекции, так и к развитию хронических воспалительных или аутоиммунных заболеваний. TGF^ так же имеет выраженные противовоспалительные свойства и ингибирует или ослабляет развития аутоиммунных заболеваний, таких как ЭАЭ [16, 17] и аутоиммунный диабет [18]. Кроме того, TGFe, напрямую регулируя продукцию IFNy, ингибирует развитие Th1 CD4+ Т лимфоцитов [19].
В данной работе показано, что экспрессия IL-10 в селезенке не зависит от количества введенных ЭГТК, в то время как уровень экспрессии TGF^ прямо пропорционален количеству введенных ЭГТК клеток. С другой стороны, клинические симптомы у животных, получивших инъекцию 9-ти миллионов ЭГТК, были незначительно тяжелее, чем у животных, которым вводили 3 миллиона клеток, что соответствует интенсивности инфильтрации ЭГТК в ЦНС. Так, трехкратное увеличение количества введенных ЭГТК ведет к увеличению их числа в ЦНС только на 80 процентов (рис. 2). Таким образом, уже на преклиническом этапе развития ЭАЭ имеет место противовоспалительный отвер на введение ЭГТК и специфическая активация экспрессии TGF^ в селезенке является одним из ключевых компонентов, определяющих этот процесс. Наряду с этим, важным компонентом в механизмах регуляции воспаления является продукция глюкокортикоидных гормонов, происходящая в результате активации гипоталамо-ги-пофизарной системы. Несмотря на то, что стимуляция иммунной системы вызывает активацию гипоталамических структур, выражающуюся в изменении электрофизио-логических показателей и активации генов немедленного ответа, уже через 30 минут
после антигенного воздействия, повышение уровня продукции глюкортикоидов требует более продолжительного времени и не может оказывать выраженного влияния на преклинической стадии развития ЭАЭ [20, 21].
В другой серии экспериментов для индукции ЭАЭ использовали инъекцию RFP + ЭГТК в комбинации с ЭГТК экспрессирующими GFP и HSV-TK, что делает возможным неинвазивное, селективное удаление GFP-ТК^ ЭГТК in vivo. Было обнаружено, что введение животным ГЦВ ведет к полному удалению GFP+ ЭГТК из инфильтратов спинного мозга. Интересно, что при этом наблюдалось увеличение инфильтрации ЦНС RFP+ клетками (рис. 4А и Б). Таким образом, можно предположить наличие неизвестного механизма, определяющего «вместимость» ЦНС для энцефалитогенных клеток, что косвенно подтверждается непропорционально малыми изменениями клинической картины при введении 5 х 106 RFP+ ЭГТК (рис.ЗА); 5 х 106 GFP+ ЭГТК (рис.ЗБ); 5 х 106 RFP+ ЭГТК и 5 х 106 GFP+-TK+ ЭГТК (рис. ЗВ); 5 х 106 RFP+ ЭГТК и 5 х 106 GFP+-TK+ ЭГТК в комбинации с ежедневным введением GCV (рис.ЗГ). Следует заметить, что для индукции апоптоза GFP-ТК^ ЭГТКок гацикловиром требуется не менее 48 часов, что достаточно для активации регуляторного механизма, описанного выше, и, следовательно, компенсаторное увеличение инфильтрации RFP ЭГТК можно предположительно рассматривать, как процесс, определяющийся свойствами ЦНС, а не только ингибирующим влиянием TGF^.
Таким образом, полученные нами данные подтверждают, что включение регуляторных механизмов в ответ на присутствие энцефалитогенных клеток происходит уже на преклиническом этапе развития переносного ЭАЭ, что может быть важно для поиска путей терапии, основанной на усилении эндогенных регуляторных реакций. Кроме того, обнаружен феномен компенсаторного замещения в ЦНС неинвазивно удаленных энцефалитогенных клеток контрольными.
Литература
1. Finbloom D. S., Winestock K. D. «IL-10 induces the tyrosine phosphorylation of tyk2 and Jakl and the differential assembly of STAT1 alpha and STAT3 complexes in human T cells and monocytes.» J Immunol 1995, 155(3): 1079-90.
2. Herrero C., X. Hu, et al. «Reprogramming of IL-10 activity and signaling by IFN-gamma.» J Immunol 2003, 171(10): 5034-41.
3. Фрейдлин И. С. Паракринные и аутокринные механизмы цитокиновой иммунорегуляции. Иммунология. 2001, №5. С. 417.
4. Nosov M. A., Barabanova S. V., et al. «Antigen-induced activation of hypothalamic cells (assessed by expression of the c-fos gene).» Neurosci Behav Physiol 2002, 32(5): 523-8.
5. Flugel A., Berkowicz T., et al. «Migratory activity and functional changes of green fluorescent effector cells before and during experimental autoimmune encephalomyelitis.» Immunity 2001, 14(5): 547-60.
6. Korneva E. A. «Electrophysiological analysis of brain reactions to antigen.» Ann N Y Acad Sci 1987, 496: 318-37.
7. del Rey A., Klusman I., et al. «Cytokines mediate protective stimulation of glucocorticoid output during autoimmunity: involvement of IL-1.» Am J Physiol 1998, 275(4 Pt 2): R1146-51.
8. Karpus W. J., Swanborg R. H. «CD4+ suppressor cells inhibit the function of effector cells of experimental autoimmune encephalomyelitis through a mechanism involving transforming growth factor-beta.» J Immunol 1991, 146(4): 1163-8.
9. Ben-Nun A., Wekerle H., et al. «Vaccination against autoimmune encephalomyelitis with T-lymphocyte line cells reactive against myelin basic protein.» Nature 1981, 292(5818): 60-1.
1Q. Lin J. T., Martin S. L., et al. «TGF-beta 1 uses distinct mechanisms to inhibit IFN-gamma expression in CD4+ T cells at priming and at recall: differential involvement of Stat4 and T-bet.» J Immunol 2QQ5, 174(1Q): 595Q-8.
11. Kawakami N., Lassmann S., et al. «The activation status of neuroantigen-specific T cells in the target organ determines the clinical outcome of autoimmune encephalomyelitis.» J Exp Med 2QQ4, 199(2): 185-97.
12. Cautain B., Damoiseaux J., et al. «Essential role of TGF-beta in the natural resistance to experimental allergic encephalomyelitis in rats.» Eur J Immunol 2QQ1, 31(4): 1132-4Q.
13. Wekerle H., Linington C., et al. «Cellular Immune Reactivity within the Cns.» Trends in Neurosciences 1986, 9(6): 271-277.
14. Flugel A., Odoardi F., et al. «Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy.» J Neuroimmunol 2QQ7, 191(1-2): 86-97.
15. Wekerle H., Bradl M., et al. «The shaping of the brain-specific T lymphocyte repertoire in the thymus.» Immunol Rev 1996, 149: 231-43.
16. Young D.A., Lowe L.D., et al. «IL-4, IL-1Q, IL-13, and TGF-beta from an altered peptide ligand-specific Th2 cell clone down-regulate adoptive transfer of experimental autoimmune encephalomyelitis.» J Immunol 2QQQ, 164(7): 3563-72
17. Riley J. K., Takeda K., et al. «Interleukin-1Q receptor signaling through the JAK-STAT pathway. Requirement for two distinct receptor-derived signals for anti-inflammatory action.» J Biol Chem 1999, 274(23): 16513-21.
18. Korneva E. A., Shkhinek E. K. «Hypothalamo-hypophyseal-adrenal system in the regulation of immunologic processes.» Fiziol Zh SSSR Im I M Sechenova 1984, 7Q(9): 1286-93.
19. Носов М. А., Flugel A., Корнева Е. А. В поисках виновного: Анализ миграции энцефалитогенных Т-клеток на преклиническом этапе развития адоптивного ЭАЭ при их внутривенном или внутрибрюшинном введении. Российский Физиологический Журнал им. Сеченова. 95.N 12.2QQ9, стр. 1416-1426.
2Q. Flugel A., Willem M., et al. «Gene transfer into CD4+ T lymphocytes: green fluorescent protein-engineered, encephalitogenic T cells illuminate brain autoimmune responses.» Nat Med 1999, 5(7): 843-7.
21. Piccirillo C.A., Chang Y., et al. «TGF-betal somatic gene therapy prevents autoimmune disease in nonobese diabetic mice.» J Immunol 1998, 161(8): 395Q-6.
Статья поступила в редакцию 15 июня 2010 г.
