Разработка высокоспецифичного радиохимического соединения на основе меченых 99mТс рекомбинантных адресных молекул для визуализации клеток с гиперэкспрессией Her-2/neu

Брагина Ольга Дмитриевна; Ларькина Мария Сергеевна; Стасюк Елена Сергеевна; Чернов Владимир Иванович; Юсубов Мехман Сулейман-Оглы; Скуридин Виктор Сергеевич; Деев Сергей Михайлович; Зельчан Роман Владимирович; Булдаков Михаил Александрович; Подрезова Екатерина Владимировна; Белоусов Михаил Валерьевич

УДК 576.3.086.8:544.582.3

DOI 10.20538/1682-0363-2017-3-25-33

Для цитирования: Брагина О.Д., Ларькина М.С., Стасюк Е.С., Чернов В.И., Юсубов М.С., Скуридин В.С., Деев С.М., Зель-чан Р.В., Булдаков М.А., Подрезова Е.В., Белоусов М.В. Разработка высокоспецифичного радиохимического соединения на основе меченых 99тТс рекомбинантных адресных молекул для визуализации клеток с гиперэкспрессией Her-2/neu. Бюллетень сибирской медицины. 2017; 16 (3): 25-33

Разработка высокоспецифичного радиохимического соединения на основе меченых 99тТс рекомбинантных адресных молекул для визуализации клеток с гиперэкспрессией Her-2/neu

Брагина О.Д 1, Ларькина М.С.3, Стасюк Е.С.2, Чернов В.И.1,2, Юсубов М.С.2,3, Скуридин В.С.2, Деев С.М.2,5, Зельчан Р.В.1, Булдаков М.А.1,4, Подрезова Е.В.2, Белоусов М.В.3

1 Научно-исследовательский институт (НИИ) онкологии Томского национального исследовательского медицинского центра (НИМЦ) Российской академии наук (РАН)

Россия, 634009, г. Томск, пер. Кооперативный, 5

2 Национальный исследовательский Томский политехнический университет (НИ ТПУ) Россия, 634050, г. Томск, пр. Ленина, 30

3 Сибирский государственный медицинский университет (СибГМУ) Россия, 634050, г. Томск, Московский тракт, 2

4 Национальный исследовательский Томский государственный университет (НИ ТГУ) Россия, 634050, г. Томск, пр. Ленина, 36

5 Институт биоорганической химии (ИБХ) им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Россия, 117997, г Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

РЕЗЮМЕ

В настоящее время актуальным является поиск новых диагностических методов, позволяющих с высокой информативностью и достоверностью выявлять злокачественные образования с гиперэкспрессией Нег-2/пеи. В последние годы активно развиваются радиоизотопные методы для выявления специфических опухолевых мишеней, при этом в качестве «нацеливающего» модуля выступают антитела.

Цель исследования. Создание химически стабильного радиохимического соединения для визуализации клеток с гиперэкспрессией Нег-2/пеи.

Материал и методы. Исследование проводилось с использованием двух клеточных линий аденокарцином человека с экспрессией (ВТ-474) и без экспрессии (МСТ-7) Нег-2/пеи. Характеристика специфичности связывания исследуемого комплекса с рецептором Нег-2/пеи определялась с помощью прямой радиометрии и планарной сцинтиграфии. Для оценки отличий количественных признаков между группами применялся непараметрический тест Манна - Уитни.

Результаты. Выход меченого комплекса составил более 91%, при радиохимической частоте - более 94%. При проведении визуальной сцинтиграфической оценки значительно большая интенсивность накопления изучаемого радиохимического соединения отмечалась в культуре клеток с гиперэкспрессией поверхностного рецептора Нег-2/пеи. Результаты прямой радиометрии также продемонстрировали более высокое накопление радиофармацевтического препарата в клеточной линии аденокарциномы

Н Брагина Ольга Дмитриевна, e-mail: [email protected].

молочной железы человека BT-474 с гиперэкспрессией Her-2/neu по сравнению с контрольной группой.

Заключение. При проведении доклинических испытаний in vitro показана высокая стабильность исследуемого соединения, а также его аккумуляция в группе клеток с гиперэкспрессией Her-2/neu.

Ключевые слова: DARPin, технеций-99м, хелатирующий агент, молекулярная визуали-

зация, рак молочной железы.

ВВЕДЕНИЕ

На протяжении двух последних десятилетий особый интерес вызывает изучение поверхностного рецептора Her-2/neu, относящегося к семейству трансмембранных тирозинкиназных рецепторов (EGFR = ErbBl/HER1; ErbB2/HER2; ErbB3/ HER3; ErbB4/HER4) и в норме экспрессирующе-гося на поверхности всех эпителиальных клеток организма [1]. При злокачественной трансформации происходит амплификация гена neu, приводящая к гиперэкспрессии кодируемого им рецептора и усиленному формированию гомо- и гетеродимеров, что обусловливает неконтролируемую передачу сигнала и нарушение процессов апоптоза, пролиферации и клеточного деления [2, 3].

Наличие гиперэкспрессии Her-2/neu выявляется на поверхности опухолевых клеток при раке легкого, яичников, желудка, простаты и пр. [4]. Особое место среди злокачественных новообразований занимает рак молочной железы, при котором амплификация гена Her-2/neu отмечается у 15-20% больных и ассоциируется с агрессивным течением заболевания, а также с низкими показателями общей и безрецидивной выживаемости [5]. Все это позволяет успешно использовать Her-2/ neu в качестве мишени не только для диагностики, но также и для проведения направленной (тар-гетной) терапии у пациентов с гиперэкспрессией данного параметра [6]. Наиболее ярким примером является использование таргетного препарата трастузумаб (герцептин), который до сих пор остается золотым стандартом терапии больных Her-2/ neu-позитивным раком молочной железы, значительно увеличивающим показатели общей и безрецидивной выживаемости [7]. При этом на первом этапе определяется наличие и (или) отсутствие гиперэкспрессии этого рецептора на поверхности опухолевой клетки, а на втором (при наличии экспрессии соответственно) проводится лечение [8].

В настоящее время существует ряд диагностических методик, позволяющих выявить наличие гиперэкспрессии рецептора Her-2/neu

[9]. Наибольшее распространение получил им-муногистохимический метод, что обусловлено возможностью повседневной оценки экспрессии с использованием срезов парафиновых блоков ткани, фиксированной формалином [10]. Однако, несмотря на доступность и относительную дешевизну, он имеет ряд недостатков, к которым относят необходимость инвазивной процедуры (взятие биопсийного или операционного материала), высокую частоту ложноположительных и ложноотрицательных результатов, а также возможное нарушение методологии выполнения исследования и неправильную интерпретацию полученных результатов [11]. Более надежным способом выявления гиперэкспрессии Her-2/neu является флуоресцентная гибридизация in situ [12]. Однако, несмотря на высокую информативность, данная методика также имеет свои недостатки: невозможность выполнения исследования in vivo с оценкой распространенности опухолевого процесса (оценка основного опухолевого узла, регионарных лимфатических узлов, отдаленных органов и тканей). Неоднозначными также остаются случаи, связанные с опухолевой гетерогенностью экспрессии HER2, что является серьезной диагностической проблемой в определении точного рецепторного статуса злокачественного образования, и, соответственно, разрозненностью полученных результатов исследования [13, 14]. В связи с этим в настоящее время по-прежнему остается актуальным поиск новых диагностических методов, позволяющих с высокой информативностью и достоверностью выявлять злокачественные образования с гиперэкспрессией Her-2/ neu [15].

В последние годы активно развиваются радиоизотопные методы для выявления специфических опухолевых мишеней с применением радиоизотопов [16]. При этом в качестве «нацеливающего» на молекулярные мишени модуля выступают антитела [17]. Представляет интерес новый класс адресных молекул неиммуноглобулиновой природы Design Ankyrin Repeat Protein (DARPin), которые являются пригодными для соединения с радиоактивными изотопами [18]. Главными

преимуществами таких белковых структур являются небольшой размер (14-20 кДа), стабильная структура, высокая специфичность и аффинность к антигену, а также значительно более низкая стоимость производства, обусловленная их экспрессией в бактериальных средах [19, 20].

Наиболее часто используемым радионуклидом для радиодиагностических препаратов выступает технеций-99м (99тТс), главными достоинствами которого является его доступность, короткий период полураспада (Т^ = 6,05 ч), невысокая стоимость изготовления и эксплуатации генераторов 99тТс, а также простая технология получения элюата из генератора 99тТс [21, 22].

Важным в радиохимическом синтезе является выбор хелатирующего агента для связывания 99тТс, а также разработка методики химической модификации рекомбинантных адресных молекул с сохранением их способности связываться со специфическими рецепторами опухолевых клеток [23, 24].

Целью настоящего исследования являлось создание химически стабильного радиохимического соединения для визуализации клеток с гиперэкспрессией Her-2/neu. При этом в качестве «нацеливающего» модуля использовался анти-Нег-2/neu белок DARPin9_29, а в качестве визуализирующего - радиоизотоп 99mTc. В качестве хелатирующего агента применялся сукцини-мид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гекса-ноат (DPAH-NHS ester) [25].

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Кодирующая последовательность DARPin9_29 была амплифицирована с плазмиды рСО-Hnse-DARPin-d18-9-29 c использованием специфических праймеров 5'-cgccgaattcttgcaggtttcagccag (предоставлена проф. Деевым С.М., ИБХ им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН).

Технеций-99м для исследований был получен из генератора технеция «99mTc-rT-TOM» [21]. Пертехнетат-ионы, присутствующие в исходном элюате из генератора, имеют высшую степень окисления (VII), при которой они не обладают высокой химической активностью и не проявляют склонности к комплексообразованию. Для понижения их степени окисления используются различные восстановители, но чаще всего применяют хлорид двухвалентного олова [26]. В данной работе в качестве восстановителя также использовался хлорид двухвалентного олова (SnCl2-2H20). В качестве хелатирующего агента применялся сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)ами-но)гексаноат (DPAH-NHS ester).

Для исследования и синтеза хелатирующего агента применялись субстраты, реагенты и органические растворители, являющиеся товарными продуктами фирм Aldrich (США), Fluka (Швейцария) и других, соответствующей чистоты, которые использовались без предварительной очистки.

Синтез DPAH-NHS ester проводили по разработанной методике на кафедре технологии органических веществ и полимерных материалов НИ ТПУ. В качестве основного субстрата использовали циклогексанон, промежуточного субстрата -метиловый эфир 6-иодгексановой кислоты [27].

Для получения радиофармацевтического препарата (РФП) во флакон вместимостью 10 см3 с набором реагентов (100 мкл раствора DPAH-DARPin9_29 концентрацией 0,5 мг/мл (в фосфатном буфере), 60 мкл раствора цитрата натрия с концентрацией 100 мг/мл и 20-60 мкл раствора SnCl2-2H20 с концентрацией 7 мг/мл) через пробку вводят 1 мл элюата 99тТс с активностью 0,5-3,7 ГБк (не вставляя воздушную иглу). После перемешивания и инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре препарат готов к применению.

Определения радиохимического выхода и радиохимической чистоты (РХЧ) полученного РФП проводили с помощью тонкослойной хроматографии на пластинах силикагеля (Sorbfil, Россия). В качестве подвижных фаз применяли две системы: ацетон (система 1) и смесь - С2Н5ОН (96%) : NH4OH (25%) : Н2О в соотношении 2 : 5 : 5 (система 2) соответственно. В ацетоне комплекс 99mT:-DPAH-DARPin9_29 остается на линии старта, а пертехнетат-ионы 99тТс(У11) поднимаются с фронтом растворителя. В систему 2 комплекс 99mT:-DPAH-DARPin9_29 и свободные пертехнетат-ионы поднимаются с фронтом элюента, а гидролизованный технеций остается на линии старта. Распределение активности 99тТс на радиохроматограммах изучали с помощью установки «ГаммаСкан-01А» («Амплитуда», Россия).

В качестве исследуемой группы использовались клетки аденокарциномы молочной железы человека BT-474 с гиперэкспрессией Her-2/neu, контрольной - клетки человеческой аденокар-циномы молочной железы MCF-7. Обе клеточные линии культивировали в питательной среде DMEM («Панэко», Россия) с добавлением 10%-й инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (Biosera, Франция) и пенициллина-стрептомицина («Панэко», Россия) при 37 °С и 5%-м уровне СО2. Клеточную суспензию пересевали в новые чашки Петри (ТТР, Швейцария) каждые

3-4 дня при достижении 70-80% монослоя. Клетки снимали раствором трипсин-ЭДТА («Панэко», Россия). Подсчет количества клеток проводили в камере Горяева.

Характеристику специфичности связывания комплекса с рецептором Her-2/ neu определяли с помощью прямой радиометрии и планарной сцинтиграфии в пяти экспериментальных исследованиях. Для изучения особенностей накопления исследуемого комплекса клетки аденокарци-номы молочной железы человека BT-474 и MCF-7 в количестве 35 000 клеток/мл среды рассеивали в 96-луночный планшет в объеме 200 мкл суспензии на лунку и культивировали в течение ночи, затем среда удалялась, а клетки промывались натрий-фосфатным буфером (PBS). Далее каждую клеточную культуру объемом по 1 мл (3 млн клеток/мл) распределяли по пяти пробиркам и в каждую добавляли по 70 МБк (100 мкл) исследуемого РФП с последующей инкубацией в течение 40 мин при температуре 4 °С. После завершения инкубации пробирки с исследуемыми субстанциями центрифугировали в течение 5 мин при скорости 1000 g, затем удаляли надосадоч-ную жидкость и измеряли радиоактивность осадка. Измерение производилось с использованием гамма-счетчика для исследований in vitro («Амплитуда», Россия).

После трехкратной отмывки выполнялась визуальная сцинтиграфическая оценка интенсивности включения РФП в исследуемые группы клеток с использованием гамма-камеры (муль-тидетекторная гамма-камера E.CAM180 (Siemens, Германия) с последующей обработкой получен-

ных данных с применением пакета специализированных программ Esoft 5.5 (Siemens, Германия).

Статистическая обработка полученных результатов осуществлялась с использованием пакета программ Statistica for Windows. Для оценки отличий количественных признаков между группами применялся непараметрический тест Манна - Уитни. Во всех процедурах статистического анализа уровень значимости p принимали равным 0,05. Результаты представлены как М ± SD, где М - среднее арифметическое, SD - стандартное отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В табл. 1 представлены результаты связывания молекулы DPAH-DARPin9_29 с технецием-99м в зависимости от количества вводимого восстановителя. Наибольший радиохимический выход при низком содержании примесей невосстановленного и гидролизованного технеция-99м наблюдался при добавлении к смеси состава 100 мкл раствора DPAH-DARPin9_29, 60 мкл раствора цитрата натрия и 50 мкл раствора хлорида олова, он составил более 91%. При добавлении большего количества хлорида олова радиохимический выход снижался из-за увеличения количества образовавшегося коллоида гидролизованного технеция-99м. Дальнейшие исследования in vitro выполнялись с соединением, имеющим следующий состав: 100 мкл раствора DPAH-DARPin9_29 с концентрацией 0,5 мг/мл (в фосфатном буфере), 60 мкл раствора цитрата натрия с концентрацией 100 мг/мл, 50 мкл раствора SnCl2-2H20 с концентрацией 7 мг/мл и 99тТс с активностью 0,5-3,7 ГБк.

Т а б л и ц а 1

Эффективность связывания молекулы DPAH—DARPin9_29 с технецием-99м в зависимости от количества восстановителя, %

Состав радиофармпрепарата Выход Невосстановленный 99тТс (VII) Гидролизованный 99mTc

100 мкл БРАН-БАКРт9_29 + 20 мкл раствора ЭпС122Н2О + 60 мкл раствора цитрата натрия 79,0 15,8 0,9

100 мкл БРАН-БАКРт9_29 + 30 мкл раствора ЭпС122Н2О + 60 мкл раствора цитрата натрия 83,0 10,8 1,2

100 мкл БРАН-БАКРт9_29 + 40 мкл раствора ЭпС122Н2О + 60 мкл раствора цитрата натрия 89,7 8,6 2,4

100 мкл БРАН-БАКРт9_29 + 50 мкл раствора ЭпС122Н2О + 60 мкл раствора цитрата натрия 91,3 2,0 3,0

100 мкл БРАН-БАКРт9_29 + 60 мкл раствора ЭпС122Н2О + 60 мкл раствора цитрата натрия 89,3 0,9 8,9

Основной механизм действия специфических РФП на основе рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29 заключается в их взаимодействии с рецепторами на поверхности опухолевых клеток, что позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять злокачественные новообразования различных локализаций с гиперэкспрессией Her-2/neu. Для изучения специфичности накопления изучаемого препарата на основе рекомбинантных адресных молекул 99mTc-DPAH-DARPin9_29 была выбрана клеточная линия аденокарциномы молочной железы человека BT-474, которая характеризуется гиперэкспрессией рецептора Her-2/neu. Доказательством селективного взаимодействия с препаратом является высокая аккумуляция препарата на поверхности исследуемой группы клеток.

При проведении визуальной сцинтиграфиче-ской оценки значительно большая интенсивность накопления изучаемого РФП отмечалась в культуре клеток с гиперэкспрессией поверхностного рецептора Her-2/neu (рисунок).

% « • Нег-2+ Нег-2 -

Рисунок. Визуальная сцинтиграфическая оценка накопления радиофармпрепарата 99mТс—DPAH—DARPin9_29: А — клетки тканей злокачественных опухолей с гиперэкспрессией Her-2/neu (BT-474, Her-2/neu — позитивная, человеческая аденокарцинома молочной железы); В — клетки тканей злокачественных опухолей без гиперэкспрессии Her-2/neu (MCF-7, Her-2/neu — отрицательная, человеческая аденокарцинома молочной железы)

Fig. Visual scintigraphic evaluation of the accumulation of radiopharmaceutical 99m Tc-DPAH-DARPin9_29: A — tissue cells of malignant tumors with Her-2/neu overexpression (BT-474, Her-2/neu-positive, human mammary gland adenocarcinoma); B — tissue cells of malignant tumors without overexpression of Her-2/neu (MCF-7, Her-2/neu — negative, human mammary gland adenocarcinoma)

Т а б л и ц а 2

Накопление радиофармацевтического препарата "mTc-DPAH-DARPin9_29 в клеточных линиях BT-474 и MCF-7, M ± SD

№ эксперимента MCF-7 (МБк) BT-474 (МБк) Р

1 0,098 ± 0,014 0,306 ± 0,038 0,043

2 0,072 ± 0,021 0,4 ± 10,025 0,038

3 0,087 ± 0,019 0,29 ± 0,042 0,019

4 0,069 ± 0,022 0,31 ± 0,039 0,025

5 0,091 ± 0,015 0,40 ± 20,051 0,003

При проведении прямой радиометрии также продемонстрировано более высокое накопление РФП в клеточной линии аденокарциномы молочной железы человека BT-474 с гиперэкспрессией Her-2/neu по сравнению с контрольной группой (табл. 2).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в работе изучено новое специфичное соединение на основе рекомбинантных адресных молекул 99mTc-DPAH-DARPin9_29, описана процедура его получения, охарактеризованы его специфичность и аффинность к рецептору Her-2/ neu. Высокая специфичность и стабильность данного препарата делают его перспективным агентом для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией Her-2/neu.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ И ВКЛАД АВТОРОВ

Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи, и сообщают о вкладе авторов. Брагина О.Д. - разработка концепции и дизайна исследования, интерпретация данных, проверка критически важного интеллектуального содержания, подготовка текста статьи, окончательное утверждение версии, которая сдается в печать. Ларькина М.С. - разработка концепции и дизайна исследования, интерпретация данных, проверка критически важного интеллектуального содержания, подготовка текста статьи. Стасюк Е.С. - разработка концепции и дизайна исследования, интерпретация данных, проверка критически важного интеллектуального содержания, подготовка текста статьи. Чернов В.И. -обоснование рукописи, разработка концепции и дизайна исследования, интерпретация данных, проверка критически важного интеллектуального содержания, подготовка текста статьи. Юсу-бов М.С. - разработка концепции и дизайна исследования, интерпретация данных, проверка критически важного интеллектуального содержания, подготовка текста статьи. Скуридин В.С. -разработка концепции и дизайна исследования, интерпретация данных, проверка критически важного интеллектуального содержания, подготовка текста статьи. Деев С.М. - разработка концепции и дизайна исследования, Зельчан Р.В. - подготовка текста статьи. Булдаков М.А. - подготовка текста статьи. Подрезова Е.В. - интерпретация данных. Белоусов М.В. - интерпретация данных, проверка критически важного интеллектуального содержания.

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Авторы заявляют об отсутствии финансирования при проведении исследования.

ЛИТЕРАТУРА

1. Полянский О.Л., Лебеденко Е.Н., Деев С.М. ERBB онкогены - мишени моноклональных антител // Биохимия. 2012; 3 (77): 289-311.

2. Чернов В.И., Брагина О.Д., Синилкин И.Г., Медведева А.А., Зельчан Р.В. Радиоиммунотерапия: современное состояние проблемы // Вопросы онкологии. 2016; 62 (1): 24-30.

3. Чернов В.И., Брагина О.Д., Синилкин И.Г., Медведева А.А., Зельчан Р.В. Радиоиммунотерапия в лечении злокачественных образований // Сибирский онкологический журнал. 2016; 15 (2): 101-106.

4. Slamon D.J., Clark G.M., Wong S.G. et al. Human breast cancer: correlation of relapse an survival with amplification of the Her-2/neu oncogenes // Science. 1987; 235: 177-182. doi: 10.1126/science.3798106.

5. Romond E.H., Perez E.A., Bryant J. et al. Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2-positive breast cancer // N. Engl. J. Med. 2005; 353: 1673-1684. doi: 10.1056/NEJMoa052122.

6. Verma S., Miles D., Gianni L. et al. Trastuzumab em-tansine for HER2-positive advanced breast cancer // N. Engl. J .Med. 2012; 367: 1783-1791. doi: 10.1056/NEJ-Moa1209124.

7. Babyshkina N., Malinovskaya E., Cherdinceva N. et al. Neoadjuvant chemotherapy for different molecular breast cancer subtypes: a retrospective study in Russian population // Medical Oncology. 2014; 31 (9): 1-12.

8. Чернов В.И., Брагина О.Д., Синилкин И.Г., Медведева А.А., Зельчан Р.В. Радионуклидная тераностика злокачественных образований // Вестник рентгенологии и радиологии. 2016; 97 (5): 306-313.

9. Zahid M., Khan S., Khan R. et al. Detection of HER2/ neu gene amplification by fluoroscence in situ hybridization technique // Pathology. 2016; 48 (1): 163-170.

10. Orlando L., Viale G., Bria E. et al. Discordance in pathology report after central pathology review: Implications for breast cancer adj'uvant treatment // Breast. 2016; 30: 151-155. doi: 10.1016/j.breast.2016.09.015.

11. Telugu R.B., Chowhan A.K., Rukmangadha N. et al. Human epidermal growth factor receptor 2/neu protein expression in meningiomas: An immunohistochemical study // J. Neurosci Rural Pract. 2016; 7 (4): 526-531. doi: 10.4103/0976-3147.188640.

12. Hanna W.M., Rüschoff J., Bilous M. et al. HER2 in situ hybridization in breast cancer: clinical implications of polysomy 17 and genetic heterogeneity // Mod. Pathol. 2013; 27: 4-18. doi: 10.1038/modpathol.2013.103.

13. Kurozumi1 S., Padilla M., Kurosumi M. et al. HER2 in-tratumoral heterogeneity analyses by concurrent HER2 gene and protein assessment for the prognosis of HER2 negative invasive breast cancer patients // Breast Cancer

Res Treat. 2016; 158: 99-111. doi: 10.1007/s10549-016-3856-2.

14. Seol H., Lee H.J., Choi Y. et al. Intratumoral heterogeneity of HER2 gene amplification in breast cancer: its clinicopathological significance // Modern Pathology. 2012; 25: 938-948. doi: 10.1038/modpathol.2012.36.

15. Riccarbona G., Decristoforo C. Peptide targeted imaging of cancer // Cancer Biother. Radiopharm. 2003; 18: 675-687. doi:10.1089/108497803770418238.

16. Engfeldt T., Orlova A., Tran T. et al. Imaging of HER2-expressing tumours using a synthetic Affibody molecule containing the 99mTc-chelating mercaptoace-tyl-glycyl-glycyl-glycyl (MAG3) sequence // European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 2007; 34 (5). 722-733. doi: 10.1007/s00259-006-0266-4.

17. Stumpp M. T., Binz H.K., Amstutz P. DARPins: A new generation of protein therapeutics // Drug Discovery Today. 2008; 13 (15): 695-701.

18. Tamaskovic R., Simon M., Stefan N. et al. Designed ankyrin repeat proteins (DARPins) from research to therapy // Methods Enzymol. 2012; 503: 101-134. doi: 10.1016/j.drudis.2008.04.013.

19. Boersma Y.L., Pluckthun A. DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications // Curr. Opin. Biotechnol. 2011; 22: 849-57. doi: 10.1016/j.copbio.2011.06.004.

20. Binz H.K., Stumpp M.T., Forrer P., Amstutz P., Pluck-thun A. Designing repeat proteins: well-expressed, soluble and stable proteins from combinatorial libraries of consensus ankyrin repeat proteins // J. Mol. Biol. 2003; 332: 489-503.

21. Skuridin V.S., Stasyuk E.S., Nesterov E.A., Sadkin V.L., Rogov A.S. Adsorption of 99mTc on Aluminum Oxide // Radiochemistry. 2011; 5 (53): 448-451.

22. Stasyuk E.S., Nesterov E.A., Skuridin V.S. et al. A procedure for sorbent pretreatment for the production of high-activity "Mo/"mTc generators based on enriched 98Mo // Radiochemistry. 2012; 54 (4): 391-394.

23. Gabriel M., Decristoforo C., Donnemiller E. et al. An intrapatient comparison of 99mTc-EDDA/HYNICTOC with 111In-DTPA-octreotide for diagnosis of somatosta-tin receptorexpressing tumors // J. Nucl. Med. 2003; 44: 708-716.

24. Yusubov M.S., Svitich D.Y., Larkina M.S. et al. Applications of iodonium salts and iodonium ylides as precursors for nucleophilic fluorination in Positron Emission Tomography // ARKIVOC. 2013; (i): 364-395.

25. Kulibaba E.V., Larkina M.S. New syntheses of bis(2-pyr-idylmethyl)amino acid // IX international conference of young scientists on chemistry «Mendeleev 2015». Book of abstracts. Saint Petersburg. 7-10 of April 2015; 250.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

26. Skuridin V.S., Stasyuk E.S., Rogov A.S. et al. Modified DTPA molecule-based nanocolloid radiopharma-

ceuticals // Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry. 2015; 303 (3): 1961—1965. 27. Юсубов М.С., Жданкин В.В., Ларькина М.С., Дрыгу-

нова Л.А. Способ получения ю-иодалифатических карбоновых кислот и их эфиров. Патент № 2494087. 2013; Опубл. 27.09.2013. Бюл. № 27.

Поступила в редакцию 22.12.2016 Утверждена к печати 30.06.2017

Брагина Ольга Дмитриевна, канд. мед. наук, мл. науч. сотрудник, отделение радионуклидной диагностики, НИИ онкологии Томского НИМЦ РАН, г. Томск.

Ларькина Мария Сергеевна, канд. фарм. наук, доцент, кафедра фармацевтического анализа, СибГМУ, г. Томск.

Стасюк Елена Сергеевна, канд. техн. наук, науч. сотрудник, лаборатория № 31, НИ ТПУ, г. Томск.

Чернов Владимир Иванович, д-р мед. наук, профессор, зам. директора по научной работе и инновационной деятельности, зав. отделением радионуклидной диагностики, НИИ онкологии Томского НИМЦ РАН, г. Томск.

Юсубов Мехман Сулейман-оглы, д-р хим. наук, профессор, зав. кафедрой технологии органических веществ и полимерных материалов, НИ ТПУ, г. Томск.

Скуридин Виктор Сергеевич, д-р техн. наук, профессор, зав. лабораторией № 31, НИ ТПУ, г. Томск.

Деев Сергей Михайлович, канд. хим. наук, д-р биол. наук, профессор, член-корр. РАН, зав. лабораторией молекулярной иммунологии, ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г. Москва; эксперт лаборатории № 31, НИ ТПУ, г. Томск.

Зельчан Роман Владимирович, канд. мед. наук, врач-радиолог, отделение радионуклидной диагностики, НИИ онкологии Томского НИМЦ РАН, г. Томск.

Булдаков Михаил Александрович, канд. биол. наук, ст. науч. сотрудник, лаборатория иммунологии, НИИ онкологии Томского НИМЦ РАН; ст. науч. сотрудник, лаборатория трансляционной клеточной и молекулярной биомедицины, НИ ТГУ, г. Томск.

Подрезова Екатерина Владимировна, инженер, кафедра технологии органических веществ и полимерных материалов, НИ ТПУ, г. Томск.

Белоусов Михаил Валерьевич, д-р фарм. наук, профессор, зав. кафедрой фармацевтического анализа, СибГМУ,

(*) Брагина Ольга Дмитриевна, e-mail: [email protected].

УДК 576.3.086.8:544.582.3

DOI 10.20538/1682-0363-2017-3-25—33

For citation: Bragina O.D., Larkina M.S., Stasyuk E.S., Chernov V.I., Yusubov M.S., Skuridin V.S., Deyev S.M., Zelchan R.V., Buldakov M.A., Podrezova E.V., Belousov M.V. Development of highly specific radiochemical compounds based on 99m Tc-labeled recombinant molecules for targeted imaging of cells overexpressing Her-2/neu. Bulletin of Siberian Medicine. 2017; 16 (3): 25—33

The development of a highly specific radiochemical compound based on labeled 99mtc recombinant molecules for targeted imaging of cells with the overexpression of Her-2 / neu

Bragina O.D.1, Larkina M.S.3, Stasyuk E.S.2, Chernov V.I.12, Yusubov M.S.23, Skuridin V.S.2, Deyev S.M.5, Zelchan R.V.1, Buldakov M.A.1,4, Podrezova E.V.2, Belousov M.V.3

1 Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center (NRMC), Russian Academy of Science (RAS) 5, Kooperativnii Str, Tomsk, 634009, Russian Federation

2 National Research Tomsk Polytechnic University (NR TPU) 30, Lenina Str., Tomsk, 634050, Russian Federation

3 Siberian State Medical University

2, Moskow Tract, Tomsk, 634050, Russian Federation

4 National Research Tomsk State University (NR TSU) 36, Lenina Str., Tomsk, 634050, Russian Federation

5 Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences 16/10, Miklukho-Maklaya Str., Moscow, 117997, Russian Federation

г. Томск.

Currently, there is a urgent need to search for new diagnostic methods that allow us to reveal malignant tumors with the overexpression of Her-2/neu with high accuracy. In recent years radioisotope methods have been actively developing to identify specific tumor targets, with antibodies being the "targeting" module.

The purpose of the study. Creation of a chemically stable radiochemical compound for the imaging of cells with the overexpression of Her-2/neu.

Materials and methods. The study was conducted using two human adenocarcinoma cell lines with expression (BT-474) and without expression (MCF-7) Her-2/neu. The specificity of the binding of the test complex with Her-2/neu receptor was determined by direct radiometric and planar scintigraphy. To evaluate the differences in quantitative characteristics between the groups a non-parametric Mann - Whitney test was used.

Results. The yield of the labeled complex was more than 91% and the radiochemical frequency was more than 94%. When performing a visual scintigraphic evaluation, a much higher accumulation rate of the studied radiopharmaceutical preparation (RFP) was observed in the culture of cells with overexpression of the surface Her-2/neu receptor. Direct radiometric results also demonstrated a higher accumulation of RFPs in the human BT-474 mammary adenocarcinoma cell line with Her-2/neu overexpression in comparison with the control group.

Conclusion. Preclinical studies demonstrated high stability of the test compound, as well as its accumulation in the group of cells with Her-2/neu overexpression.

ABSTRACT

Key words: DARPin, technetium-99m, chelating agent, Her-2/neu, molecular imaging, breast cancer.

REFERENCES

1. Polanovski O. L., Lebedenko E. N., Deyev S. M. ERBB oncogeni - misheni monoclonalnikh antitel [ERBB - oncogenes as targets for monoclonal antibodies] // Biokhimiya - Biochemistry. 2012; 3 (77): 289-311 (in Russian).

2. Chernov V.I., Bragina O.D., Sinilkin I.G., et al. Radioim-munoterapiya: sovremennoe sostoyanie problemi [Radio-immunotherapy: current state of the problem] // Voprosi Oncologii - Questions of Oncology. 2016; 62 (1): 24-30 (in Russian).

3. Chernov V.I., Bragina O.D., Sinilkin I.G. et al. Radioimmu-notherapiya v lechenii zlokachestvennix obrazovanii [Ra-dioimmunotherapy in the treatment of malignancies] // Sibirskii Oncologicheskii Jurnal - Siber. J. Oncol. 2016; 15 (2): 101-106 (in Russian).

4. Slamon D.J., Clark G.M., Wong S.G. et al. Human breast cancer: correlation of relapse an survival with amplification of the Her-2/neu oncogenes // Science. 1987; 235: 177-182. doi: 10.1126/science.3798106.

5. Romond E.H., Perez E.A., Bryant J. et al. Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2-positive breast cancer // N. Engl. J. Med. 2005; 353: 1673-1684. doi: 10.1056/NEJMoa052122.

6. Verma S., Miles D., Gianni L. et al. Trastuzumab em-tansine for HER2-positive advanced breast cancer // N. Engl. J .Med. 2012; 367: 1783-1791. doi: 10.1056/NEJ-Moa1209124.

7. Babyshkina N., Malinovskaya E., Cherdinceva N. et al. Neoadjuvant chemotherapy for different molecular breast cancer subtypes: a retrospective study in Russian population // Medical Oncology. 2014; 31 (9): 1-12.

8. Chernov V.I., Bragina O.D., Sinilkin I.G. et al. Radionuclidnaya teranostica zlokachestvennix obrazovanii [Radionuclide teranostic of malignancies] // Vestnik Rentgenologii i Radiologii - Vestnik Rentgenologii and Radiologii. 2016; 97 (5): 306-313 (in Russian).

9. Zahid M., Khan S., Khan R. et al. Detection of HER2/ neu gene amplification by fluoroscence in situ hybridization technique // Pathology. 2016; 48 (1): 163-170.

10. Orlando L., Viale G., Bria E. et al. Discordance in pathology report after central pathology review: Implications for breast cancer adjuvant treatment // Breast. 2016; 30: 151-155. doi: 10.1016/j.breast.2016.09.015.

11. Telugu R.B., Chowhan A.K., Rukmangadha N. et al. Human epidermal growth factor receptor 2/neu protein expression in meningiomas: An immunohistochemical study // J. Neurosci Rural Pract. 2016; 7 (4): 526-531. doi: 10.4103/0976-3147.188640.

12. Hanna W.M., Rüschoff J., Bilous M. et al. HER2 in situ hybridization in breast cancer: clinical implications of polysomy 17 and genetic heterogeneity // Mod. Pathol. 2013; 27: 4-18. doi: 10.1038/modpathol.2013.103.

13. Kurozumi1 S., Padilla M., Kurosumi M. et al. HER2 in-tratumoral heterogeneity analyses by concurrent HER2 gene and protein assessment for the prognosis of HER2 negative invasive breast cancer patients // Breast Cancer Res Treat. 2016; 158: 99-111. doi: 10.1007/s10549-016-3856-2.