CC BY
11
УДК 66.063.62
Антонова М.М., Никитин А.А., Ермоленко Ю.В., Гельперина С.Э.
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ САМОСОБИРАЮЩИХСЯ СТРУКТУР НА ОСНОВЕ ГИДРОФОБИЗИРОВАННОЙ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ И НАНОЧАСТИЦ SPION
Антонова Мария Михайловна, студентка 4-го года обучения кафедры химии и технологии биомедицинских препаратов; e-mail: [email protected]
Никитин Алексей Андреевич, к.х.н., Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский технологический университет "МИСиС"; 119049, Москва, Ленинский пр-кт, д. 4, стр. 1;
Ермоленко Юлия Валерьевна, к.х.н., доцент кафедры химии и технологии биомедицинских препаратов; ФГБОУ ВО «Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева», Москва, Россия;125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20;
Гельперина Светлана Эммануиловна, д.х.н., начальник лаборатории систем доставки лекарственных средств; ФГБОУ ВО «Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева», Москва, Россия;125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20.
В статье рассмотрено получение мицеллярных форм гидрофобизированной гиалуроновой кислоты, нагруженных наночастицами суперпарамагнитного оксида железа (SPION). Полученные мицеллы визуализированы и охарактеризованы по размерам, зарядам и содержанию в них железа. Методом динамического светорассеяния изучена стабильность мицелл при разбавлении и установлены критические концентрации мицеллообразования.
Ключевые слова: гиалуроновая кислота, мицеллярные формы, наночастицы суперпарамагнитного оксида железа
DEVELOPMENT OF TECHNOLOGICAL APPROACHES FOR OBTAINING SELF-ASSEMBLY STRUCTURES BASED ON HYDROPHOBIZED HYALURONIC ACID AND SPION NANOPARTICLES
Antonova M.M.1, Nikitin A.A.2, Ermolenko Y.V.1, Gelperina S.E.1
1 D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia
2 National University of Science and Technology (MISIS), Moscow, Russia
The article discusses the preparation of micellar forms of hydrophobized hyaluronic acid loaded with nanoparticles of superparamagnetic iron oxide (SPION). The micelles are visualized and characterized by size, charge, and iron content. Using the dynamic light scattering method the stability of micelles upon dilution has been studied and the critical micelle concentration has been established.
Keywords: hyaluronic acid, micellar forms, superparamagnetic iron oxide nanoparticle (SPION).
Введение
Возможность применения неорганических наночастиц (НЧ) в медицине вызывает повышенный интерес в последние годы. В сравнении с традиционной химиотерапией использование НЧ, как носителей лекарственных веществ, имеет ряд преимуществ, таких как оптимизация фармакокинетики лекарственного вещества и эффективная доставка в опухолевые ткани, что приводит к общему снижению системной токсичности [1]. Суперпарамагнитные НЧ оксидов железа (SPION) биосовместимы и нетоксичны, а также обладают выраженными магнитными свойствами, что делает их пригодными для использования в качестве платформы для создания тераностиков [2]. Гиалуроновая кислота является одним из наиболее перспективных биополимеров-носителей, способным связываться с клеточным рецептором CD44, гиперэкспрессия которого характерна для многих опухолевых клеток [3]. Целью нашей работы являлось изучение возможности получение мицеллярных структур на основе гидрофобизированной олеиновой кислотой
гиалуроновой кислоты (ГК-С18), загруженных НЧ SPION, и характеристика их физико-химических параметров, в том числе, размер (гидродинамический диаметр), дзета-потенциал поверхности, содержание железа и критическая концентрация мицеллообразования (ККМ).
Экспериментальная часть
Получение мицеллярных форм ГК-С18, нагруженных НЧ SPION. В работе использовали следующие НЧ SPION: НЧ SPION (30 нм, Fe 3,67 мг/мл) - образец 1; НЧ SPION, содержащие кобальт -CoFe2O4 (10 нм, Fe 2,05 мг/мл) - образец 2; НЧ SPION (13 нм, Fe 7,47 мг/мл) - образец 3, а также гиалуроновую кислоту (олеилгиалуронат натрия, Delcore, производства Contipro a.s.), степень замещения 5-15%, молекулярная масса 5-15 кДа.
200 мг ГК-С18 растворили в 20 мл деионизированной воды (MQ). Раствор перемешивали в течение 2 часов, после чего гомогенизировали на ультразвуковом
гомогенизаторе 60 с (70Вт, цикл 1 с). К полученному раствору добавляли 700 мкл SPION, ресуспендированных в хлороформе, и
гомогенизировали в течение 15 минут (70Вт, цикл 1 с) при охлаждении до 0° С. Растворитель упаривали до пленки, которую затем ресуспендировали в 20 мл деионизированной воды (MQ). Полученный раствор центрифугировали (4500 об/мин, 10 минут), супернатант отбирали во флаконы и лиофилизировали. С использованием данной методики получали мицеллы, нагруженные НЧ SPION (образец 1, образец 2 и образец 3).
Определение физико-химических параметров мицеллярных форм. С помощью наносайзера (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments, Malvern, UK) определяли размер мицелл (метод динамического светорассеяния) и дзета-потенциал их поверхности (метод микроэлектрофореза). Морфологию мицелл оценивали методом просвечивающей электронной спектроскопии (электронный микроскоп JEOL JEM-1400, JEOL, Ltd, Япония, ускоряющее напряжение 120 кВ).
Количественное определение железа в мицеллах rKC18:SPION. Содержание железа в полученных мицеллярных формах определяли методом прямой спектрофотометрии (Shimadzu UV-1800, Shimadzu Corp., Япония) по реакции двухвалентной ионной формы железа с фенантролином (о-фенантролин, 1-водн., Sigma-Aldrich). Градиуровочную зависимость строили, используя в качестве стандарта раствор Fe2+ (соль Мора, хч). Для подавления мицеллообразования растворы градуировочной серии и анализируемые растворы готовили в 50% водном растворе ДМСО.
Определение критической концентрации мицеллообразования / сравнение стабильности мицеллярных форм ГК-С18 и TK-C18:SPION. Готовили 7 растворов ГК-С18 и TK-C18:SPION с убывающей концентрацией 0,5; 0,2; 0,1; 0,05; 0,01; 0,005; 0,001; 0,0005 мг/мл. Из полученных растворов отбирали пробы объемом 1 мл и измеряли CountRate (скорость счёта) (Zetasizer Nano ZS) в режиме
обратного рассеяния с максимальной аттенуацией. Строили график в координатах зависимости Count Rate от концентрации. По пересечению линейных участков графика определяли ККМ. Результаты и их обсуждение Мицеллы, загруженные SPION, получали методом ультразвуковой гомогенизации, как описано в работе [4]. Использовали три образца НЧ SPION, отличающихся по размеру и составу (образцы 1, 2, 3). Характеристики полученных мицелл приведены в таблице 1. Для количественной оценки загрузки НЧ SPION в мицеллы рассчитывали эффективность загрузки по формуле:
кол-ЕозагруженногоКе и сходно екол- е о Fe Размеры определяли сразу после получения мицелл и при разбавлении в 50 раз. Уменьшение гидродинамического диаметра частиц при разбавлении указывает на то, что в концентрированном растворе мицеллы, возможно, ассоциированы друг с другом, что следует отнести к действию водородных связей между молекулами ГК. Следует отметить, что мицеллы, загруженные SPION, имеют существенно меньшие размеры: 158 нм для образца 1, 186 нм для образца 2, 120 нм для образца 3 по сравнению с 346 нм для мицелл ГК-С18 без SPION. Дзета-потенциал поверхности всех полученных структур отрицательный, что объясняется наличием карбоксильных групп (таблица 1).
Изучение стабильности полученных структур при разбавлении показало, что включение SPION повышает стабильность мицелл ГК-С18. ККМ для мицеллярных форм TK-C18:SPION составляет 0,002 мг/мл, тогда как для мицелл ГК-С18 она намного выше - 0,01 мг/мл (рис.1).
Таблица 1. Характеристики полученных мицелл ГК-С18 и ГК-С18:SPION
№ образца Размеры конц. р-р, нм растворе, нм Размеры при разб., нм PDI Дзета-потенциал, мВ Эффективность загрузки, %
1 245,9 ± 1,3 158,4 ± 3,7 0,143 ± 0,025 -49,0 ± 1,3 50,2 %
2 439,1 ± 5,75 186,4 ± 1,7 0,096 ± 0,012 -135,0 ± 2,8 88,2 %
3 223,3 ±2,8 120,8 ± 6,2 0,147 ± 0,036 -108,2 ± 2,9 92,6 %
Мицеллы ГК-С18 без SPION 834,6 ± 23,4 346,5±31,9 0,320±0,041 - -
Рис. 1. Определение ККМ методом ДСР для а) мицелл ГК-С18; б) мицеллярных форм ГК-С18:SPION
Эффективность проникновения мицелл в ткани опухоли увеличивается с уменьшением их размера [5]. Для выделения фракции мицелл с меньшими размерами использовали центрифугирование (образец №1 ГК-С18^РЮК). Размеры полученных мицелл при разбавлении в 50 раз сразу после получения, через пять дней и через месяц (-2°С) приведены в таблице 2. Увеличивая скорость
центрифугирования до 8000 об/мин, удается отобрать фракцию мицелл размером около 110 нм. Как следует их данных таблицы 2, мицеллы весьма устойчивы: их размер сохраняется не менее 1 месяца.
Для визуализации полученных структур и оценки полидисперсности использовали просвечивающую электронную микроскопию (ПЭМ).
Таблица 2. Влияние скорости центрифугирования на размер мицелл ГК-С18, нагруженных SPION
Скорость центрифугирования, об/мин Размеры мицелл в 1 день, нм Размеры мицелл на 5 день, нм Размеры мицелл на 30 день, нм
3000 об/мин 165,7 ± 6,225 175,2 ± 2,798 151,5 ± 0,755
4500 об/мин 155,8 ± 5,166 154,4 ± 1,745 144,7 ± 1,682
8000 об/мин 116,1 ± 2,027 126,3 ± 1,652 116,8 ± 1,744
Рисунок 2. ПЭМ-изображения мицеллярных форм rK-C18:SPION. 16а -
образец 3
образец 1; 16б -образец 2; 16в
Как видно на Рис. 2, мицеллярные структуры содержат ядро, состоящее из агломерированных SPION. Полученные структуры отличаются по размерам, все образцы полидисперсны, наибольшее количество невключенного железа присутствует в образце 3. Полученные результаты коррелируют с результатами, представленными в таблице 1. Зарегистрированное уменьшение размеров мицелл ГК-С18 при включении в них НЧ SPION c нашей точки зрения следует объяснять стабилизирующей ролью ядра. Стабилизированные олеиновой кислотой НЧ SPION собираются в агломераты в гидрофобном ядре мицелл, образуемых амфифильными молекулами ГК-С18, стабилизируя их форму и размер.
Выводы
Методом ультразвуковой гомогенизации получены мицеллы гидрофобизированной гиалуроновой кислоты, загруженные НЧ SPION (ГК-C18:SPION). Наилучшие результаты получены при использовании НЧ SPION, содержащих кобальт (CoFe2O4, образец 2): эти НЧ наиболее эффективно включаются в мицеллы (ЭЗ 88,2%) и обладают наименьшим индексом полидисперсности (PDI 0,096). Мицеллы сохраняют устойчивость при хранении в течение 1 месяца. Загрузка мицелл ГК-С18 НЧ SPION приводит к уменьшению их размера и индекса полидисперсности по сравнению с незагруженными (с 350 нм до —150 нм и с 0,320 до 0,096, соответственно), а также к увеличению
стабильности при разбавлении в 5 раз (с ККМ 0,01 до 0,002 мг/мл). Полученные мицеллярные структуры следует отнести к НЧ типа ядро/оболочка. В случае загрузки их лекарствами такие мицеллы могут быть использованы для конструирования тераностиков.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, проект 20-015-00381.
Список литературы
1. Zhu L. et al. Magnetic nanoparticles for precision oncology: Theranostic magnetic iron oxide nanoparticles for image-guided and targeted cancer therapy // Nanomedicine. - 2017. - Vol. 12, № 1. - P. 73-87.
2. Laurent S. et al. Iron Oxide Based MR Contrast Agents: from Chemistry to Cell Labeling // Current Medicinal Chemistry. - 2009. - Vol. 16. - P. 47124727
3. Day A.J., Prestwich G.D. Hyaluronan-binding proteins: Tying up the giant // Journal of Biological Chemistry. - 2002. - Vol. 277, № 7. - P. 4585-4588.
4. Smejkalova, Daniela; Nesporova, Kristina et al. Selective In Vitro Anticancer Effect of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles Loaded in Hyaluronan Polymeric Micelles // Biomacromolecules. -2014. - Vol. 11, №15. - P. 4012-4020
5. Soenen S.J. et al. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation // Nano Today. -2011. - Vol. 6, № 5. - P. 446-465.
