CC BY
33
УДК 542.08
Лисенкова Ю.С., Ермоленко Ю.В., Осипова Н.С., Поливанова А.Г., Гельперина С.Э.
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ПРИРОДЫ ОРГАНИЧЕСКОГО РАСТВОРИТЕЛЯ НА МИЦЕЛЛООБРАЗОВАНИЕ В РАСТВОРАХ ГИДРОФОБИЗИРОВАННОЙ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ
Лисенкова Юлия Сергеевна, студентка кафедры химии и технологии биомедицинских препаратов; e-mail: [email protected]
Ермоленко Юлия Валерьевна, к.х.н., доцент кафедры химии и технологии биомедицинских препаратов; Поливанова Анна Геннадьевна, к.х.н., доцент кафедры химии и технологии биомедицинских препаратов; Осипова Надежда Сергеевна, ведущий инженер, Инжиниринговый центр РХТУ;
Гельперина Светлана Эммануиловна, д.х.н., профессор кафедры химии и технологии биомедицинских препаратов.
ФГБОУ ВО «Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева», Москва, Россия; 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20.
Изучено влияние органического растворителя на критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ) самоорганизующихся структур (полимерных мицелл) на основе гиалуроновой кислоты, гидрофобизированной олеиновой кислотой (ГК С18:1). Полимерные мицеллы получали в присутствии флуоресцентного красителя кумарина-6 методом упаривания растворителя (хлороформа или хлористого метилена). Установлено, что использование в качестве растворителя хлороформа способствует более эффективному включению кумарина-6 в структуру мицелл, однако при этом ККМ полученных мицелл высока и составляет 0,10 мг/мл, что свидетельствует о их невысокой устойчивости. Использование хлористого метилена приводит к получению более устойчивых мицелл, характеризующихся значением ККМ 0,015 мг/мл.
Ключевые слова: полимерные мицеллы; гидрофобизированная гиалуроновая кислота; критическая концентрация мицеллообразования (ККМ).
EFFECTS OF ORGANIC SOLVENT ON FORMATION OF MICELLES OF HYDROPHOBIZED HYALURONIC ACID IN SOLUTIONS
Lisenkova Y.S., Ermolenko Y.V., Osipova N.S., Polivanova A.G., Gelperina S.E.
The effects of organic solvent on the critical micellar concentration (CMC) during polymeric micelle formation of hyaluronic acid hydrophobized with oleic acid have been studied. The polymeric micelles were produced in the presence of coumarin-6 fluorescent dye by a solvent evaporation method using chloroform or dichloromethane as an organic medium. The use of chloroform as the solvent enabled a more efficient incorporation of coumarin-6 in the micellar structure; however, the CMC of the obtained micelles was high, amounting to 0.10 mg/ml, which indicated their low stability. The use of dichloromethane resulted in more stable micelles, with a CMC of 0.015 mg/ml.
Keywords: polymeric micelles; hydrophobized hyaluronic acid; critical micellar concentration (cmc).
Введение
Системы доставки лекарственных веществ (ЛВ) на основе амфифильных полимеров позволяют обеспечить пролонгированное действие ЛВ, увеличить их растворимость и снизить токсичность. Гиалуроновая кислота низкой молекулярной массы ( ~ 5-20 кДа), гидрофобизированная олеиновой кислотой (ГК С18:1) (рис.1) — это нетоксичный, биосовместимый и биоразлагаемый амфифильный полимер, использующийся для получения самоорганизующихся структур (полимерных мицелл) [1]. Одним из ключевых параметров, определяющих стабильность мицелл в растворах при высоких разбавлениях, является критическая концентрация мицеллообразования (ККМ). Целью исследования было изучение влияния органического несмешивающегося с водой растворителя на ККМ полимерных мицелл из ГК С18:1, полученных в присутствии флуоресцентного красителя кумарина-
6. Для определения ККМ спектрофлуориметрический метод.
использовали
Рис. 1. Структура гиалуроновой кислоты, модифицированной олеиновой кислотой (ГК С18:1); R1=H+,
Na+
Экспериментальная часть
Определение размеров полимерных мицелл ГК С18:1 методом динамического светорассеивания
(ДСР). Из водного раствора ГК С18:1 (Sodium O-octadec-9-enoyl hyaluronate, Mw = 5 - 20 кДа, степень замещения 5-15%, Contipro a.s., Чехия) с концентрацией 10 мг/мл готовили серию растворов (10-1, 10-3, 10-4, 10-5 мг/мл) последовательным
разбавлением (вода высокой степени очистки (Milli-Q)). Полученные растворы обработали ультразвуком (30 с, Elmasonic S100). Определяли размеры частиц в полученных растворах методом ДСР (режим обратного рассеяния света под углом 173о, длина волны лазера 633 нм) на анализаторе размеров Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical Ltd, Великобритания).
Получение полимерных мицелл на основе ГК С18:1 с включенным кумарином-6.
Метод твердой дисперсии [1]. Органическая фаза (ОФ): раствор кумарина-6 (3,9 мг) в 3 мл изопропанола. Водная фаза (ВФ): раствор ГК С18:1 в воде (конц. 1 мг/мл). К 2 мл ВФ добавляли 50 мкл ОФ (195 мкг кумарина-6). После перемешивания отгоняли смесь растворителей под вакуумом. Полученную пленку зеленоватого цвета диспергировали в 2 мл воды под действием УЗ в течение 30 с. Полученный раствор фильтровали через мембранный фильтр из политетрафторэтилена с размером пор 0,45 мкм, разбавляли в 10 раз и определяли размер частиц методом ДРС.
Метод упаривания растворителя [2]. ВФ: раствор ГК С18:1 в воде. Концентрации водных растворов ГК С18:1 составляли 10-7, 10-6, 10-5,10-4,10-3,10-2,10-1 и 1 мг/мл. ОФ: раствор кумарина-6 в хлористом метилене или хлороформе с концентрацией 3 мг/мл. В 2 мл каждого из растворов ГК С18:1 добавляли по 50 мкл ОФ (155 мкг кумарина-6), закрывали флаконы крышками и оставляли перемешиваться на магнитной мешалке (300 об/мин) 24 ч. Далее флаконы открывали и перемешивали при нагревании до 40оС 2 ч для удаления органических растворителей. Полученные суспензии фильтровали через мембранный фильтр из политетрафторэтилена с размером пор 0,45 мкм. Получали серию прозрачных растворов ГК с включенным кумарином-6 для измерения ККМ
спектрофлуориметрическим методом.
Определение ККМ
спектрофлуориметрическим методом. Для определения ККМ регистрировали изменение интенсивности флуоресценции Кумарина-6 с увеличением концентрации ГК С18:1 в исследуемых растворах. Количество добавленного кумарина-6 во всех растворах оставалось постоянным. Интенсивность флуоресценции кумарина-6 измеряли при длине волны 511 нм (длина волны возбуждения - 480 нм) в кювете 1 см. Исследование проводили при помощи спектрофлуориметра RF-6000 (Shimadzu, Япония). Полученные данные обрабатывали в программе Microsoft Excel 2013. Результаты и их обсуждение
Известно, что ГК С18:1 (рис.1) образует в водных растворах самоорганизующиеся системы, называемые полимерными мицеллами [1]. Размеры получаемых в водных растворах ГК С18:1 полимерных мицелл определяли методом ДСР, данные приведены в таб. 1 (РБ1 - индекс полидисперсности).
Таблица 1. Результаты ДРС-исследования самоорганизующихся структур ГК С18:1 в водных растворах
Концентрация ГК, мг/мл Средний размер, нм PDI
10-1 232,3±8,5 (100%) 0,229
10-3 206,4±11 (100%) 0,444
10-4 156,1±31,5 (100%) 0,441
10-5 189,4±10,7 (100%) 0,386
Как следует из приведенных в таб. 1 значений, размеры самоорганизующихся из ГК С18:1 структур характеризуются широкими значениями РБ1 и мало изменяются при разбавлении. Добавление кумарина-6 (метод твердой дисперсии) привело к уменьшению размеров образовавшихся мицелл и к уменьшению полидисперсности образца (136,7 ± 31,5 нм, РБ1 0,18).
Представляло интерес получить полимерные мицеллы из ГК С18:1 при использовании несмешивающихся с водой органических растворителей и оценить их ККМ спектрофлуориметрическим методом (в присутствии гидрофобного флуоресцентного красителя кумарин-6). Для исследования выбрали близкие по полярности растворители, в которых кумарин-6 хорошо растворяется: хлороформ и хлористый метилен. Полимерные мицеллы получали методом упаривания растворителя. Для исследования готовили пробы с различной концентрацией ГК С18:1 и одной и той же концентрацией флуоресцентного красителя. Формирование полимерных мицелл ГК С18:1 с включенным кумарином-6 происходило в эмульсии о/в при длительном перемешивании. После упаривания органического растворителя и удаления образущегося оранжевого осадка кумарина-6 фильтрованием измеряли интенсивность
флуоресценции фильтратов. Результаты приведены на рис. 2 А (хлористый метилен), Б (хлороформ). ККМ определяли по пересечению линейных участков полученных зависимостей
Рис.2. Результаты спектрофлуориметрического исследования самоорганизующихся структур, полученных методом упаривания растворителя: А - растворитель хлористый метилен, Б - растворитель хлороформ
1.00Е-06 1.00Е-04 1.0UE-02 |,0СЕ+00
Концентрация раствора ГК С13:1, мг/мл
А
1 V, W / 175,00/ 1 1 140,00 1 t 1 105/00
7 * j ТА ЛП
ККМ=0,10 мг/мл 1 / /35,00 и
1
О
S-. -
■ел о О
1.00Е-06 ],ООЕ-(М l,OOE-02 1.00Е+00
Концентрация раствора ГК С18:1, мг/мл
Б
Из представленных данных следует, что наибольшая интенсивность флуоресценции (после ККМ) достигатся при использовании хлороформа в качестве растворителя, следовательно, можно предположить, что гидрофобный кумарин-6 лучше включается в мицеллы в присутствии менее полярного хлороформа. Однако мицеллы, образованные в присутствии хлороформа, имеют большее значение ККМ по сравнению с хлористым метиленом (0,10 против 0,015 (мг/мл).
Известно, что ККМ мицелл ГК С6 и С16 находится в диапазоне 0,0002-0,001 мг/мл [3]. Значения ККМ больше 0,04 мг/мл считаются высокими; такие мицеллы неустойчивы при сильном разбавлении, например, при введении в кровоток. Таким образом, в нашем эксперименте устойчивые мицеллы удалось получить только при использовании в качестве растворителя хлористого метилена.
Из полученных нами экспериментальных результатов следует, что даже небольшое уменьшение полярности использующегося при получении мицелл несмешивающегося с водой растворителя, привело к более эффективному включению в них кумарина-6; однако получающиеся мицеллы характеризовались более высоким ККМ. Следовательно, природа растворителя является существенным фактором влияния для получения устойчивых мицелл на основе ГК С18:1.
Выводы
Методом динамического светорассеяния установлено, что ГК С18:1 в водном растворе образуют самоорганизующиеся структуры размером около 200 нм, характеризующиеся широким распределением по размерам. Включение в них
кумарина-6 приводит к уменьшению их размеров (136,7 ± 31,5, PDI 0,18).
Спектрофлуориметрическим методом
установлено, что на ККМ и степень включения кумарина-6 в полимерные мицеллы на основе гидрофобизированной ГК С18:1 влияет выбор органического растворителя. Использование в качестве растворителя хлороформа способствует более эффективному включению кумарина-6 в структуру мицелл, при этом ККМ полученных мицелл высока и составляет 0,10 мг/мл. Использование хлористого метилена приводит к снижению ККМ до 0,015 мг/мл.
Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках государственного задания (проект FSSM-2020-0004).
Список литературы
1. D Smejkalova, K Nesporova, M Hermannova et al. Paclitaxel isomerisation in polymeric micelles based on hydrophobized hyaluronic acid // Pharmaceutical nanotechnology. - 2014. - Vol. 466. - № 1-2. - P. 147-155.
2. Патент РФ № 2640287С2, 27.12.2017. Смежкалова Даниэла, Хуэрта-Ангелес Глория С6-С18 -ацилированное производное гиалуроновой кислоты, способ его получения, наномицеллярная композиция на его основе, способ ее получения и способ получения стабилизированной наномицеллярной композиции и ее применение // Патент России № 2015125076 2017
