CC BY
244
ЭКОЛОГИЯ
УДК 504.06:631.453
Е.В. Плешакова РАЗРАБОТКА НОВОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЁННОЙ ПОЧВЫ
Разработан и апробирован метод определения токсичности почвы по дегидрогеназной активности бактерий. Показано, что интродукция нефтеокисляющего штамма способствует максимальному снижению токсичности нефтезагрязнённой почвы по сравнению со стимуляцией естественной микрофлоры и самоочищением.
Нефтезагрязнённая почва, углеводороды, токсичность,
дегидрогеназы, микробный штамм Dietzia maris АМ3.
E.V. Pleshakova CREATION OF A NEW METHOD FOR OIL-CONTAMINATED SOIL TOXICITY DETERMINATION
The method for soil toxicity determination by bacteria dehydrogenase activity was developed and tested in the article. It shows that the introduction of oil-oxidizing strain promotes the maximum decrease in oil-contaminated soil toxicity in comparison with stimulation of the indigenous micro flora and selfcleaning.
Oil-contaminated soil, hydrocarbons, toxicity, dehydrogenases, Dietzia maris АМ3microbial strain.
В настоящее время в России и других странах существует серьёзная экологическая проблема - загрязнение окружающей среды нефтью и нефтепродуктами. Экологический ущерб от загрязнения почв нефтяными углеводородами весьма велик - от снижения качества и продуктивности почв до вывода земель из сельскохозяйственного оборота.
Для очистки загрязнённых почв в мире активно разрабатываются и применяются технологии их восстановления, среди которых перспективными и экологически безопасными являются биотехнологические способы, основанные на использовании природных или селекционированных микроорганизмов, растений и др. [1, 2].
Эффективность очистки загрязнённых почв традиционно оценивают с помощью химикоаналитических методов, нередко дорогих и трудоёмких. Биотестирование, биоиндикация и экотоксикология, наряду с методами аналитической химии, позволяют получить интегральную токсикологическую характеристику загрязнённой среды, построить наиболее полную картину деградации почв. Для оценки процесса биодеградации
загрязнителей в почве применяют биотестирование с использованием микроорганизмов, инфузорий, низших ракообразных, водорослей, высших растений, дождевых червей [3, 4].
У различных тестов есть свои недостатки. Большинство ферментативных тестов оценивают потенциальную активность почвенных ферментов, их преимущество - в лёгкости измерения, а недостаток - в косвенном подходе. В настоящее время государственными природоохранными органами для задач экологического контроля рекомендованы несколько разработанных биологических тест-систем. Они имеют государственные свидетельства о метрологической аттестации и включены в Федеральный реестр методик и так называемый реестр Природоохранных нормативных документов (ПНДФ). Перечень таких методик невелик, и основаны они главным образом на использовании тест-организмов из числа гидробионтов: равноресничной инфузории Paramecium caudatum, низших ракообразных Daphnia magna и Ceriodaphnia affinis, а также зелёной протококковой водоросли Scenedesmus quadricauda [4]. При анализе этими методами готовят водные вытяжки из почвы, что не всегда отражает истинную токсичность почвы. Широко применяется для измерения токсичности почвы -фитотестирование на основе высших растений, при котором исследуется всхожесть семян и морфометрические характеристики растений, выращенных на исследуемых почвах [5]. Достоинством использования фитотестов является то, что в них используется сама загрязнённая почва, а не водный экстракт из неё; а недостатком - сравнительно большая продолжительность и трудоёмкость анализа. Также показано, что результаты фитотестирования во многом зависят от воздушного и водного режима почвы в ходе экспериментов, а не от прямого токсического действия ксенобиотиков на всхожесть и прорастание растений.
Таким образом, проблема биологического мониторинга загрязнённых почв, несмотря на свою давнюю и неизменную актуальность, всё ещё далека от оптимального разрешения. Это объясняется количеством и составом загрязняющих веществ, интенсивностью механических повреждений и неоднозначностью ответных реакций почв на воздействие этих веществ [6]. Поэтому поиск оптимальных приёмов биотестирования для оценки степени загрязнённости и токсичности почвы продолжается.
Нами был разработан метод определения токсичности почвы по дегидрогеназной активности бактерий. Данный метод основан на способности ферментов микроорганизмов -дегидрогеназ восстанавливать за счёт дегидрирования субстрата бесцветный трифенилтетразолийхлорид (ТТХ) до трифенилформазана (ТФФ), имеющего тёмно-красный цвет. Ферменты дегидрогеназы высокочувствительны к действию ядовитых веществ, в присутствии которых их активность снижается, что позволило нам путём сравнения количества ТФФ, образованного дегидрогеназами микробного штамма Dietzia maris АМ3 (из коллекции Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов), в опытах и контроле оценить степень токсичности исследуемых образцов почвы. Данный микроорганизм был выделен из нефтешлама (г. Саратов), и, как было установлено, обладает значительной дегидрогеназной активностью.
Штамм D. maris АМ3 выращивали в течение 3 сут. на мясо-пептонном агаре (МПА). Готовили в стерильном физиологическом растворе суспензию тест-культуры D. maris АМ3 с оптической плотностью 0,5 ед. Оптическую плотность бактериальной суспензии определяли на КФК-2 в кюветах 10 мм при синем светофильтре (Л, = 440 нм). В химически чистые сухие пробирки вносили в указанной последовательности следующие растворы: 1,2 мл 1/15 М Na2HPO4; 0,5 мл 0,1 М глюкозы; 0,1 мл 0,1 М MgSO4; 0,2 мл 0,5% ТТХ; 1 мл бактериальной суспензии; 1 г почвы, предварительно простерилизованной прогреванием в сушильном шкафу при t = 180°С в течение 1,5 часов для инактивации естественных почвенных ферментов. В качестве контроля анализировали бактериальную суспензию с вышеназванными растворами без добавления почвы и почву без добавления субстрата.
Смесь инкубировали в термостате при t = 28°С в течение 5 сут. до появления окраски формазана. Из реакционной смеси ТФФ экстрагировали ацетоном (по 5 мл в каждую пробирку). Для полного извлечения формазана из реакционной смеси пробирки тщательно встряхивали, а затем отстаивали. На полноту извлечения ТФФ указывало обесцвечивание реакционной смеси. ТФФ осторожно, с помощью фторопластовой пипетки переносили в кюветы для колориметрирования толщиной 10 мм и измеряли светопоглощаемость растворов при синем светофильтре (Л, = 440 нм). Количество образованного бактериями ТФФ рассчитывали по калибровочной кривой и в зависимости от этого показателя оценивали токсичность почвенных образцов.
Следует отметить, что разработанный нами метод биотестирования прост, хорошо воспроизводим, обеспечивает получение точных и стабильных результатов. Для анализа используются непосредственно образцы почвы, а не почвенная вытяжка, как в методах на основе гидробионтов (инфузорий, дафний и др.), что позволяет наиболее достоверно оценить токсичность почвы. Известно, что ряд экотоксикантов, например, продукты трансформации нефтяных углеводородов, обладают мутагенными, тератогенными и канцерогенными свойствами, создающими непосредственную угрозу для здоровья человека [7]. Метод, основанный на измерении активности микробных дегидрогеназ, обладает высокой чувствительностью, он позволяет регистрировать возможность образования в почве опасных метаболитов токсикантов.
При разработке нового метода в качестве сравнительного приёма тестирования почвы использовали фитотестирование на 3-суточных проростках скороспелого редиса сорта «Заря», оценивая следующие показатели: всхожесть семян в %; средняя длина ростка и средняя длина корня [8]. Всхожесть семян определяли по формуле:
„ число проросших семян
Всхожесть =------------------------.
общее количество семян
У проростков редиса измеряли в мм длину побегов и длину корней. На основании проведенных измерений вычисляли среднюю длину побега и среднюю длину корня - это отношение суммарной длины побегов или корней к числу проросших семян. Контролем служила чистая почва. Определяли разницу (в %) изученных показателей между загрязнённой и контрольной чистой почвой. Разницу показателей до 10% по сравнению с контролем не принимали во внимание и почву считали экологически чистой, разница в 10-30% указывала на слабую токсичность почвы, от 30 до 50% - на среднюю степень, а выше 50% - на высокую степень фитотоксичности почвы.
Разработанный метод был апробирован для определения токсичности нефтезагрязнённого (20 г/кг) чернозёма южного в процессе очистки почвы при самоочищении и использовании двух приёмов биоремедиации: интродукции
нефтеокисляющего штамма D. maris АМ3 и стимуляции естественного микробного сообщества. Для стимуляции естественных микроорганизмов через 3 сут. после загрязнения в почву добавляли: минеральное удобрение азофоску, являющееся
источником азота и фосфора (0,7 г/кг), и древесные опилки в качестве структуратора (1/3 объёма почвы). При биоаугментации одновременно с внесением минерального удобрения и структуратора в почву добавляли активный нефтеокисляющий штамм D. maris АМ3 в количестве 1x10 кл/г почвы. Почву перемешивали и инкубировали в пластмассовых контейнерах (по 1 кг) при температуре 25°С в течение 60 сут. Производилась регулярная агротехническая обработка: рыхление один раз в неделю и поддержание влажности на уровне 10-15%. Вариант с самоочищением только увлажняли. В качестве контроля в экспериментах использовали незагрязнённую почву. Остаточное содержание нефтяных углеводородов в почве определяли гравиметрическим методом [9], извлекая сумму неполярных и малополярных углеводородов из почвенного образца органическим растворителем (четырёххлористым углеродом) с одновременной очисткой элюата на окиси алюминия в хроматографической колонке.
Было показано, что загрязнение почвы сырой нефтью значительно ингибировало дегидрогеназную активность D. maris АМ3. На рис. 1 представлены результаты анализа токсичности почвы по дегидрогеназной активности штамма D. maris АМ3. Хорошо видно, что в пробирках с нефтезагрязнённой почвой (№ 4-6), формазан, дающий интенсивное красное окрашивание в чистой почве (пробирки № 1-3), не образуется. Это свидетельствует о токсическом воздействии загрязнителя на дегидрогеназы тест-микроорганизма D. maris АМ3.
На рис. 2 представлены результаты оценки токсичности нефтезагрязнённой почвы в процессе очистки по дегидрогеназной активности D. maris АМ3 и результаты фитотестирования. В качестве контроля мы рассматривали чистую почву, и данные представляли в % от контроля. Как видно из рис. 2 а, через 30 сут. в вариантах с самоочищением почвы и стимуляцией сохранялась низкая активность дегидрогеназ, что являлось показателем токсичности нефтезагрязнённой почвы. В почве со штаммом-интродуцентом количество формазана было в 1,5-2,5 раза выше, чем в других вариантах, что свидетельствовало о меньшей токсичности данной почвы.
Рис. 1. Определение токсичности почвы по дегидрогеназной активности штамма й. тэпэ АМ3.
Пробирки: 1-3 - чистая почва; 4-6 - нефтезагрязнённая почва;
7-8 - контроль й. тэпэ АМ3 без почвы
Через 60 сут. во всех вариантах активность дегидрогеназ снизилась, что, возможно, связано с накоплением в почве в конце ремедиации токсичных метаболитов и продуктов разложения биоты, оказывающих ингибирующее действие на дегидрогеназы штамма D. maris АМ3.
При фитотестировании исследуемой почвы были получены следующие результаты. Загрязнение почвы нефтью по отношению к чистой контрольной почве несколько снижало всхожесть семян редиса (рис. 2 б), более заметно угнеталось развитие ростков и корней у редиса - на 8-20 и 10-15% соответственно (рис. 2 в и 2 г). Через 30 сут. ремедиации средняя длина корней у проростков редиса была на 6-44% выше (рис. 2 г), а средняя длина ростка, напротив, на 39-52% ниже, чем в контроле (рис. 2 в), что свидетельствовало о токсичности почвы. Всхожесть семян через 30 сут. после загрязнения при самоочищении и стимуляции была чуть ниже, чем в чистой почве, а в варианте с интродуцированным штаммом-деструктором на 9% выше. Через 60 сут. в очищенной почве наблюдалась стимуляция развития корней у проростков редиса, длина которых на 2-16% была выше, чем в контроле. Ростки развивались лучше, чем в начале и середине эксперимента и были на 43-67% длиннее, чем в чистой почве, что свидетельствовало об очистке почвы от загрязнителя. Всхожесть семян редиса при использовании приёмов биоремедиации была немного ниже по сравнению с контролем.
В целом, сравнивая способы очистки почвы по показателям фитотоксичности, можно отметить, что при использовании штамма-интродуцента D. maris АМ3 всхожесть семян редиса была выше, чем в остальных вариантах через 30 сут., средняя длина корня - через 30 и 60 сут., варианты с самоочищением и стимуляцией естественных микроорганизмов были близки.
ШИШ
ми
З0
сутки
З0
сутки
UUlEL
& 140
И самоочищение □ стимуляция □ аугментация
Рис. 2. Оценка токсичности почвы по дегидрогеназной активности бактерий (а), по показателям всхожести семян редиса (б), средней длины ростка проростков редиса (в) и средней длины корня проростков редиса (г), % от контроля
В эксперименте нами определялась убыль общих нефтяных углеводородов в почве через 30 и 60 сут. очистки (рис. 3), которая при использовании приёмов ремедиации была значительно выше, чем при самоочищении почвы.
ей
о
d
о
ро
о
d
о
в
CD
До
м\
І
□ самоочищение
□ стимуляция
□ аугментация
Зо
б0
70
б0
бо
80
° 40
£ б0
40
а 20
20
10
о
0
б
а
1б0
120
100
^ 80
cl 80
Ї б0
б0
40
40
S 20
9І 20
0
0
в
г
0
0
0
0
0
0
0
сутки
Рис. 3. Деструкция нефтяных углеводородов в южном чернозёме в ходе очистки
При стимуляции естественной микрофлоры деструкция нефти в почве через 30 сут. была на 10,5% выше, чем при самоочищении, через 60 сут. - на 23,7%.
Интродуцированный штамм D. maris АМ3 оказал положительное действие на убыль нефтяных углеводородов из почвы, которая через 30 сут. была на 11% выше, чем при использовании приёма стимуляции. Через 60 сут. степень деструкции при стимуляции приближалась к значениям при аугментации. Таким образом, в эксперименте обнаруживалась прямая корреляция между убылью нефти в почве и снижением фитотоксичности. Чем меньше в почве остаточного содержания нефтепродуктов, тем фитотоксичность ниже.
В целом, можно отметить, что при оценке токсичности нефтезагрязнённой почвы с помощью двух приёмов биотестирования (по дегидрогеназной активности D. maris АМ3 и фитотестированием) наблюдались сходные тенденции: через 30 сут. ремедиации показана средняя степень токсичности почвы, установлено, что очистка почвы, основанная на стимуляции аборигенной микрофлоры, способствует снижению токсичности почвы в большей степени, чем процесс самоочищения. Эти данные согласуются с данными химического анализа остаточных нефтяных углеводородов в почве. Вариант с аугментацией отличался большей степенью разложения нефтяных углеводородов, меньшей фитотоксичностью по показателям всхожести и средней длине корня проростков редиса и меньшей токсичностью почвы через 30 сут. по показателю дегидрогеназной активности бактерий.
Тот факт, что в конце очистки почва оказалась нетоксичной для растений, но ещё токсичной для микробных ферментов, свидетельствует о необходимости использования нескольких оптимальных биотестов для достоверной оценки токсичности почвы после биоремедиации.
ЛИТЕРАТУРА
1. Comparison of bio-augmentation and composting for remediation of oily sludge: A field-scale study in China / W. Ouyang, H. Liu, V. Murygina et al. // Process Biochem. 2005. Vol. 40. P. 3763-3768.
2. Schwab P. Heritability of phytoremediation potential for the alfalfa cultivar Riley in petroleum contaminated soil / P. Schwab, M.K. Banks, W.A. Kyle // Water, Air, Soil Poll. 2006. Vol. 177. P. 239-249.
3. Dorn P.B. Temporal еcological assessment of oil contaminated soils before and after bioremediation / P.B. Dorn, J.P. Salanitro // Chemosphere. 2000. Vol. 40. P. 419-426.
4. Экотоксикологическая оценка биосорбента нефти с целью сертификации / В.А. Терехова, И.Б. Арчегова, Ф.М. Хабибуллина и др. // Экология и промышленность России. 2006. № 3. С. 34-37.
5. Назаров А.В. Изучение причин фитотоксичности нефтезагрязненных почв /
A.В. Назаров, С. А. Иларионов // Письма в Международный научный журнал «Альтернативная энергетика и экология». 2005. № 1. С. 60-65.
6. Проблема диагностики и нормирования загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами / Ю.И. Пиковский, А.Н. Геннадиев, С.С. Чернянский, Г.Н. Сахаров // Почвоведение. 2003. № 9. С. 1132-1140.
7. Маджугина Ю. Г. Растения полигонов захоронения бытовых отходов мегаполисов как перспективные виды для фиторемедиации / Ю.Г. Маджугина,
B.В. Кузнецов, Н.И. Шевякова // Физиология растений. 2008. Т. 55. № 3. С. 453-463.
8. Остроумов С. А. Некоторые аспекты оценки биологической активности ксенобиотиков / С.А. Остроумов // Вестник Московского университета. Сер. 16. Биология. 1990. № 2. С. 27-34.
9. РД 52.18.647-2003. Методические указания для определения массовой доли нефтепродуктов в почвах. Методика выполнения измерений гравиметрическим методом. Утв. Росгидрометом 18.03.2003. Введ. 01.06.2003. 16 с.
Плешакова Екатерина Владимировна - Pleshakova Ekaterina Vladimirovna -
кандидат биологических наук, доцент Candidate of Biological Sciences, Associate
кафедры «Биохимия и биофизика» Professor of the Department of «Biochemistry
Саратовского государственного университета and Biophysics» of Saratov State University им. Н.Г. Чернышевского in the name of N.G. Chernyshevskiy
Статья поступила в редакцию 26.05.10, принята к опубликованию 14.07.10
