CC BY
32
УДК 504.054:631.453
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ПРИЕМОВ БИОТЕСТИРОВАНИЯ ДЛЯ ОЦЕНКИ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ НА ПОЧВУ ИНВЕРТНО-ЭМУЛЬСИОННЫХ БУРОВЫХ РАСТВОРОВ И ИХ ДИСПЕРСИОННЫХ СРЕД*
Е.В. Плешакова, А.Ю. Беляков
С помощью трех методов биотестирования (фитотестирование, вермитестирование и по показателю активности дегидрогеназ Dietzia maris AM3) исследовано токсическое действие на почву инвертно-эмульсионных буровых растворов и их дисперсионных сред. Установлен высокий уровень токсичности почвы при загрязнении буровыми растворами на углеводородной основе. В ряду поллютантов выявлена минимальная токсичность минерального масла и бурового раствора на его основе.
Ключевые слова: инвертно-эмульсионные буровые растворы, фитотестирование, вермитестирование, активность дегидрогеназ.
Введение
В настоящее время в бурении нефтяных и газовых скважин широко используются буровые растворы на углеводородной основе. К таковым относятся инвертно-эмульсионные растворы (ИЭР), дисперсионной средой которых может выступать нефть, дизельное топливо или минеральное масло. Их дисперсионная фаза включает компоненты: известь, утяжелители, воду, соли, синтетические полимеры, органоглины и поверхностно-активные вещества (ПАВ), такие как сульфонол, синтанол и др. [2]. ИЭР в основном используют при бурении ответственных скважин, когда требуется буровой раствор с высокой ингибирующей способностью. Однако, несмотря на преимущества использования ИЭР, их более широкому внедрению препятствуют экологические проблемы, связанные с опасностью загрязнения окружающей среды компонентами, входящими в их состав, среди которых основными токсикантами являются углеводороды [10]. Поэтому при выборе типа ИЭР для бурения одним из ключевых моментов остается степень токсичности самих растворов и их дисперсионных сред для окружающей среды.
ИЭР применяли в основном на морских проектах, поэтому исследовано их токсическое действие на водные организмы. Доказано, что под влиянием этих растворов происходит изменение величины первичной продукции, снижение выживаемости и уменьшение плодовитости гидробионтов, нарушение стадий метаморфоза и регенерационных процессов [9]. Однако в последние годы применение ИЭР при строительстве скважин на суше быстро растет. В этом случае негативное влияние буровые растворы оказывают уже на почву, нарушая ее состав, свойства и плодородие. Прежде всего токсическое воздействие
сказывается на почвенной биоте и почвенно-погло-щающем комплексе, но эти проблемы изучены недостаточно.
Биотестирование является важным элементом биодиагностики качества техногенных субстратов и природных сред, в том числе почвы, способным интегрально и оперативно оценить степень их токсичности [3,11]. Методы биотестирования почвы основаны на использовании чувствительных к токсическим воздействиям организмов, среди которых микроорганизмы, микроводоросли, высшие растения, почвенные беспозвоночные. Для измерения токсичности почвы давно и широко применяется фитотестирование на основе высших растений, при котором определяются всхожесть семян и морфометрические характеристики растений, выращенных на этих почвах [4]. В России для экологического контроля используют методы биотестирования, включенные в Федеральный реестр методик и реестр Природоохранных нормативных документов, в которых тест-организмами являются гидробионты: Paramecium caudatum, Daphnia magna, Ceriodaphnia affinis и Scenedesmus qu-adricauda [12]. Многие исследователи считают, что комплексное биотестирование, т.е. расширенный набор биотест-систем, позволяет оценить токсичность не только исходных загрязнителей, но и их метаболитов [13].
Учитывая чрезвычайно сложный гетерогенный состав ИЭР, очевидно, что для адекватной оценки степени их негативного воздействия на почву требуется использование нескольких биотестов, при этом важен поиск оптимального сочетания методов биотестирования.
Цель настоящих исследований состояла в оценке влияния различных типов инвертно-эмульсионных буровых растворов и составляющих их дисперсион-
* Материалы этой работы были представлены на Международной конференции «Биодиагностика в экологической оценке почв и сопредельных сред», 4—6 февраля 2013 г., МГУ, Москва, Россия.
ных сред на почву с помощью разных приемов биотестирования.
Объекты и методы исследования
В лабораторных экспериментах изучали токсическое действие на почву трех видов ИЭР, различающихся типом дисперсионных сред, среди которых были минеральное масло И-20 (ИЭР-1), нефть (ИЭР-2) и дизельное топливо (ИЭР-3). Отдельно оценивали токсическое воздействие на почву вышеперечисленных дисперсионных сред, входящих в состав исследуемых буровых растворов. ИЭР с объемным соотношением углеводородная фаза: водная фаза 75: 25 были смоделированы на основе литературных данных о буровых растворах, наиболее распространенных в бурении нефтяных и газовых скважин [1,2]. Остальные реагенты, входящие в состав ИЭР, следующие (г/л): органобентонит — 4,6, сульфонол — 22,8, BaSO4 — 64,5, Ca(OH)2 — 22,8, CaCl2 — 51,8.
В экспериментах использовали чернозем южный суглинистый, отобранный в Саратовской обл., со следующими гранулометрическими характеристиками: частицы > 5 мм — 1,8%; < 5—> 3 мм — 4,2; <3—>1 мм — 10,0; < 1—> 0,5 мм — 11,5; < 0,5—> 0,25 мм — 19,0; < 0,25 мм — 53,6%. Он содержал: 0,9% общего органического углерода, 6,3 мг/кг NO3, 59,3 мг/кг NH3, 156 мг/кг подвижного Р2О5; рН почвы (солевой) 7,2. Перед экспериментом из почвы удаляли крупные включения, просеивали через сито с диаметром ячеек 5 мм и загрязняли ИЭР и дисперсионными средами в концентрации 40 и 25 г/кг соответственно на основании данных о потерях ИЭР с выбуренной породой при бурении скважин, которые происходят, несмотря на использование высокотехнологичного оборудования. Для равномерного распределения загрязнителей почву выдерживали в течение суток. В качестве контроля использовали исходную чистую почву. Токсичность образцов почвы определяли непосредственно после загрязнения (1 сут.) и через 30 сут. выдерживания без полива при комнатной температуре.
В фитотесте изучали трехсуточные проростки редиса сорта «Заря», оценивая: всхожесть семян (%), среднюю длину ростка и среднюю длину корня (мм) [7]. Определяли разницу (%) изученных показателей между загрязненной и контрольной чистой почвами.
Вермитестирование проводили методом, основанным на определении выживаемости дождевых червей при воздействии токсических веществ [6]. В качестве тест-организмов использовали дождевых (компостных) червей «Старатель», полученных в лабораторных условиях профессором А.М. Игониным путем скрещивания особей двух пространственно отдаленных популяций навозных червей Eisenia foetida. Нами впервые были использованы данные организмы элитной промышленной линии для оценки токсичности инвертно-эмульсионных буровых растворов. В почву (1 кг) помещали по 20 особей. Для создания опти-
мальных условий для них в ходе биотестирования ее увлажняли профильтрованной водопроводной водой до 75% влажности, дополнительно вносили биогумус в соотношении 1:6. Инкубировали дождевых червей при комнатной температуре. Показателем служило среднее количество выживших организмов в тестируемой почве по сравнению с контролем (незагрязненная почва). Критерий высокой токсичности — гибель 50% и более червей в почве по сравнению с контролем. Кратковременное биотестирование в течение двух суток позволило выявить острое токсическое действие на червей загрязнителей почвы. При более длительном биотестировании (7 сут. экспозиции) оценивали хроническое действие на них экополлютантов.
Для оценки токсичности почвы использовали также разработанный нами ранее метод анализа де-гидрогеназной активности бактерий D. maris AM3, основанный на способности микробных дегидроге-наз за счет дегидрирования восстанавливать субстрат — бесцветный 2,3,5-трифенилтетразолийхло-рид до 2,3,5-трифенилформазана (ТФФ), имеющего темно-красный цвет [8]. Ферменты дегидрогеназы высоко чувствительны к действию ядовитых веществ, в присутствии которых их активность снижается, что позволило нам путем сравнения количества ТФФ в опытных и контрольных образцах почвы оценить степень их токсичности. Количество ТФФ определяли колориметрически измерением интенсивности окраски раствора при экстрагировании формазана. Данный метод биотестирования имеет высокую чувствительность. Он позволяет не только регистрировать возможность образования в почве опасныгх метаболитов токсикантов, но и обойти защитные барьеры организма, так как при его использовании токсикант воздействует непосредственно на белковую систему.
Биотестирование проводили в трех повторностях разными методами, отдельно для каждого варианта почвы. Математическую обработку полученныгх данных выполняли с использованием компьютерной программы Microsoft Excel 2003.
Результаты и их обсуждение
Для оценки токсичности почвы нами были выбраны три биотест-системы. Как считают исследователи [5, 11], для объективного анализа экологической токсичности природных сред и объектов окружающей среды целесообразно использовать в качестве тест-культур представителей трех основных звеньев трофической (пищевой) цепи биогеоценозов: продуцентов, консументов и редуцентов. В связи с этим мы использовали представителей всех названных звеньев: высшие растения, дождевых червей и микроорганизмы.
Результаты биотестирования почвы на дождевыгх червях «Старатель», проведенного сразу после внесения загрязнителей (рис. 1), продемонстрировали, что показатели выживаемости тест-объектов в загряз-
Через сутки после загрязнения Через 30 сут. после загрязнения
Рис. 1. Результаты вермитестирования почвы после внесения загрязнителей
ненной и контрольной почвах существенно различались. В почве, загрязненной минеральном маслом, выживаемость червей через двое суток экспозиции составила 100%, что свидетельствовало об отсутствии ее острой токсичности. В варианте с ИЭР, основой которого было минеральное масло, выживаемость составила 25%. Во всех остальных вариантах она была крайне низкой — от 0 до 10%, что указывало на острое токсическое воздействие данных загрязнителей на дождевых червей. То же наблюдалось и через 7 сут. инкубирования: в почве, загрязненной минеральным маслом, выживаемость червей снизилась со 100 до 83%.
Краткосрочное биотестирование, осуществленное через 30 сут. после внесения поллютантов в почву, по-
казало 100%-ю выживаемость тест-организмов в варианте с минеральным маслом и ИЭР на его основе (рис. 1). В остальных почвенных образцах ее показатели не изменились по сравнению с предыдущим тестированием. В почве, загрязненной минеральным маслом, выживаемость червей через 7 сут. экспозиции осталась на уровне 100%.
Результаты вермитестирования свидетельствовали о высокой степени токсичности почвы при внесении в нее ИЭР и их дисперсионных сред, за исключением минерального масла, при добавлении которого в почву токсический эффект не проявлялся как непосредственно после загрязнения, так и 30 сут. спустя. Через 30 сут. наблюдалось снижение токсичности почвы, загрязненной ИЭР с минеральным маслом, что может быть связано с процессами абиотической и биотической трансформации углеводородов, входящих в состав данного бурового раствора.
Результаты фитотестирования представлены в таблице. В качестве контроля мы рассматривали чистую почву и данные представляли в процентах от контроля. Всхожесть семян редиса после внесения в почву загрязнителей снизилась, за исключением варианта с минеральным маслом и ИЭР на его основе. Наиболее заметно угнеталась всхожесть семян под влиянием ИЭР с нефтью в качестве дисперсионной среды, составляя всего 16% от контроля. Через 30 сут. показатели всхожести остались на прежнем уровне в почве с дисперсионными средами, а в образцах
Оценка токсичности почвы с помощью фитотестирования
Варианты почвы с загрязнителями Экспозиция почвы после внесения загрязнителей, сут. Всхожесть Средняя длина корня Средняя длина ростка
% процент от контроля мм процент от контроля мм процент от контроля
Контроль — чистая почва 95,0 ± 2,33 100 37,5 ± 1,60 100 17,3 ± 1,97 100
ИЭР-1 1 81,6 ±2,76 85,8 ± 1,98 18,8 ±0,54 50,1 ± 1,48 4,8 ± 1,37 27,7 ± 0,35
30 80,0 ± 0,93 83,2 ± 1,12 20,9 ± 1,45 55,8 ± 1,37 5,2 ±0,41 30,3 ± 1,05
Минеральное масло 1 93,3 ± 1,95 98,2 ± 2,43 12,7 ± 1,54 33,9 ± 1,89 12,7 ± 2,54 73,4 ± 1,28
30 86,6 ±2,81 91,2 ±2,32 13,9 ± 0,44 37,1 ± 1,43 16,2 ± 1,76 93,6 ±2,13
ИЭР-2 1 15,0 ± 1,34 15,8 ± 0,44 10,8 ± 2,03 28,8 ± 0,89 5,7 ±2,12 33,1 ± 1,21
30 46,6 ± 1,99 49,0 ± 0,65 15,1 ± 1,44 40,2 ± 1,09 5,9 ± 0,33 34,1 ±2,44
Нефть 1 60,0 ± 2,04 63,1 ± 1,22 8,9 ± 2,30 23,9 ± 1,56 5,3 ± 0,33 30,7 ± 1,12
30 65,0 ± 1,06 68,4 ± 1,29 1,2 ± 1,65 40,4 ± 0,34 6,7 ± 0,91 39,1 ±2,34
ИЭР-3 1 50,0 ± 1,02 52,6 ± 0,89 1,2 ± 1,23 32,4 ± 0,45 8,4 ± 1,22 48,7 ± 0,67
30 76,6 ± 2,76 80,6 ± 2,05 4,0 ± 1,87 10,7 ± 0,91 1,7 ± 2,04 79,3 ± 0,45
Дизельное топливо 1 74,4 ± 1,22 63,1 ± 1,22 12,4 ± 1,23 33,2 ± 1,33 14,6 ± 1,22 84,7 ± 1,16
30 71,6 ± 1,78 75,4 ± 0,53 15,4 ± 0,54 41,1 ± 2,05 5,8 ± 0,88 33,7 ± 0,43
с ИЭР наблюдалась тенденция к увеличению, указывая на снижение токсического влияния растворов.
Более заметно угнеталось развитие ростков и особенно корней у проростков редиса, причем под влиянием и всех дисперсионных сред, и ИЭР почти в равной степени — на 50—76%. Минимальное ингибирование корней было в почве с ИЭР на основе минерального масла, максимальное — в почве с нефтью. Через 30 сут. в образцах почвы с дизельным топливом и ИЭР на его основе их угнетение усугубилось, особенно в варианте с ИЭР-3 — средняя длина корня составляла лишь 11% от контроля, что, возможно, связано с накоплением в почве продуктов трансформации, более токсичных для растений, чем исходный загрязнитель. В почве с минеральным маслом и соответствующим ИЭР этот показатель не изменился по сравнению с начальным определением, в почве с нефтью и ИЭР на ее основе ингиби-рование корней у проростков редиса немного уменьшилось.
Как показали результаты фито-тестирования почвы через одни сутки после загрязнения, средняя длина ростка редиса в вариантах со всеми исследуемыми ИЭР была в 2—3,6 раза ниже, чем в контрольной почве. Максимальное ингибирование развития ростков наблюдалось в вариантах с ИЭР-1 на основе минерального масла и ИЭР-2 на основе нефти, минимальное — с ИЭР-3 на основе дизельного топлива. В образцах с дисперсионными средами показатели средней длины ростка меньше отличались от контроля: с дизельным топливом — на 15, минеральным маслом — на 27, наиболее существенно в почве с нефтью — на 69%. Через 30 сут. ингиби-рующее воздействие на ростки уменьшилось в вариантах с минеральным маслом, дизельным топливом и ИЭР на его основе.
В целом на основании показателей всхожести семян, средней длины корня и средней длины ростка проростков редиса почва с нефтью и ИЭР на ее основе отличалась самой высокой токсичностью. Минеральное масло и ИЭР на его основе оказывали менее выраженный токсический эффект по сравнению с другими поллютантами. В то же время следует отметить, что минеральное масло сразу после внесения в почву ингибировало рост корней проростков редиса на 66%, а ИЭР на его основе в 3,6 раза сильнее угнетало развитие ростков.
В ходе оценки токсичности почвы с помощью разработанного нами метода по дегидрогеназной активности D. maris АМ3 были получены следующие ре-
Рис. 2. Оценка токсичности почвы по дегидрогеназной активности D. maris АМ3
зультаты (рис. 2). Дисперсионные среды, внесенные в почву, не влияли на активность дегидрогеназ микробного штамма АМ3, тогда как буровые растворы на основе этих сред снижали данный показатель на 18—30% по сравнению с чистой почвой. Через 30 сут. содержание ТФФ, которое отражало активность де-гидрогеназ D. maris АМ3, снизилось во всех вариантах. Максимальное снижение отмечено в образцах почвы, загрязненной нефтью и ИЭР на ее основе: на 51 и 63% соответственно по сравнению с исходной чистой почвой. Токсическое действие остальных дисперсионных сред и буровых растворов на активность дегидрогеназ тест-микроорганизма через 30 сут. экспозиции почвы также увеличилось.
Выводы
В качестве тест-объектов для оценки токсического действия на почву буровых растворов и их компонентов нами были использованы организмы разных трофических уровней: высшие растения, почвенные беспозвоночные и микроорганизмы. При сравнении результатов, полученных с помощью трех приемов биотестирования, были установлены сходные тенден-
ции. Из всех дисперсионных сред минеральное масло оказалось наименее токсичным, загрязненная им почва не была токсичной для дождевых червей и оказывала слабое токсическое воздействие на ферменты бактерий. Исключением явилось значительное ингибирование корней проростков редиса в почве с минеральным маслом, что скорее всего связано с нарушением под влиянием этого загрязнителя агрофизических свойств почвы.
Все буровые растворы, внесенные в почву, по всем показателям биотестов обладали высокой токсичностью, которая незначительно уменьшалась через 30 сут. экспозиции. Буровые растворы на основе нефти и дизельного топлива, в дисперсионной среде которых содержались ароматические соединения и циклические углеводороды в средней и высокой концентрации, были более токсичны по отношению к тест-организмам по сравнению с ИЭР на основе минерального масла. Полученные данные позволяют рекомендовать использование минерального масла в качестве углеводородной основы ИЭР как наименее токсичной дисперсионной среды.
Результаты микробного теста показали, что активность дегидрогеназ D. maris AM3 в почве с различ-
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гаршина О.В., Хвощин П.А., Кузнецова О.Г. и др. Разработка, опыт применения и перспективы повторного использования инвертно-эмульсионных буровых растворов // Бурение скважин. 2011. № 10.
2. Грей Дж.Р, Дарли Г. С. Состав и свойства буровых агентов (промывочных жидкостей) / Пер. с англ. М., 1985.
3. Ибрагимова С.Т., Айткелъдиева С.А., Файзулина Э.Р. и др. Экологическая оценка нефтезагрязненных почв Казахстана по откликам стандартных биотест-систем // Докл. по экол. почвовед. 2009. Вып. 11, № 1.
4. Лисовицкая О.В., Терехова В.А. Фитотестирование: основные подходы, проблемы лабораторного метода и современные решения // Там же. 2010. Вып. 13, № 1.
5. Маячкина Н.В., Чугунова М.В. Особенности биотестирования почв с целью их экотоксикологической оценки // Вестн. Нижегород. ун-та им. Н.И. Лобачевского. 2009. № 1.
6. Международный стандарт ИСО 11268-1 «Определение загрязнения по острой летальной токсичности у земляных червей». М., 2012.
ными типами ИЭР была значительно ниже, чем в таковой с соответствующими дисперсионными средами, свидетельствуя о большей токсичности ИЭР, которая, вероятно, обусловлена комбинированным действием соединений, входящих в их состав. В то же время, судя по результатам фито- и вермитестирования, токсичность ИЭР и их дисперсионных сред (нефть, дизельное топливо) существенно не отличалась.
Следует отметить, что тест-организмы характеризовались разной чувствительностью к поллютантам. Через 30 сут. экспозиции в загрязненной почве по ряду показателей фито- и вермитестирования наблюдалось снижение токсичности, тогда как по показателю активности ферментов тест-микроорганизма токсичность всех образцов загрязненной почвы увеличилась. Это свидетельствует о необходимости использования нескольких биотестов для адекватной оценки токсичности почв.
В целом тремя способами биотестирования было доказано негативное влияние на почву исследованных буровых растворов и их компонентов, что требует разработки современных технологий их утилизации, а также технологий ремедиации почвы при загрязнении ее ИЭР.
7. Остроумов С.А. Некоторые аспекты оценки биологической активности ксенобиотиков // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 16. Биология. 1990. № 2.
8. Плешакова Е.В. Разработка нового метода определения токсичности нефтезагрязненной почвы // Вестн. СГТУ. 2010. Вып. 1, № 3(46).
9. Рыбина Т.Е. Токсичность буровых шламов разного состава нефтепромыслов Западной Сибири для пресноводных гидробионтов: Дис. ... канд. биол. наук. Борок, 2004.
10. Рязанов Я.А. Энциклопедия по буровым растворам. Оренбург, 2005.
11. Терехова В.А. Проверка безопасности искусственных почвогрунтов из органосодержащих отходов // Экология производства. 2010. № 2.
12. Терехова В.А, Арчегова И.Б., Хабибуллина Ф.М. и др. Экотоксикологическая оценка биосорбента нефти с целью сертификации // Экология и промышленность России. 2006. № 3.
13. Achazi R.K. Invertebrates in risk assessment development of a test battery and of short term biotests for ecological risk assessment of soil //J. Soils and Sediments. 2002. Vol. 2, N 4.
Поступила в редакцию 20.01.2013
TOXIC EFFECT OF INVERT EMULSION DRILLING FLUIDS AND THEIR DISPERSE MEDIUMS ON SOIL
E.V. Pleshakova, A.Yu. Belyakov
Using three biotesting methods (phyto-testing, vermi-testing and in terms of the activity of the dehydrogenases of Dietzia maris AM3) toxic effect of invert-emulsion drilling fluids and their disperse mediums on soil was investigated. High level of toxicity of soil, contaminated with hydro-
carbon based drilling fluids, was established. Among the studied pollutants minimal toxicity of mineral oil and drilling fluid based on mineral oil was detected.
Key words: biotests, soil, toxic effect, invert emulsion drilling fluids.
Сведения об авторах
Плешакова Екатерина Владимировна, докт. биол. наук, профессор каф. биохимии и биофизики биологического ф-та Саратовского гос. ун-та им. Н.Г. Чернышевского. Тел.: 8(8452) 50-38-58; e-mail: plekat@rambler.ru. Беляков Андрей Юрьевич, аспирант каф. биохимии и биофизики биологического ф-та Саратовского гос. ун-та им. Н.Г. Чернышевского. Тел.: 8(8452) 50-38-58; e-mail: beland89@mail.ru.
