CC BY
26ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
О. Г. Смалюх1, С. В. Сур2
РАЗРАБОТКА МЕТОДИК ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ В РАСТИТЕЛЬНОМ ЛЕКАРСТВЕННОМ СРЕДСТВЕ СЕДАВИТ, ТАБЛЕТКАХ
1АО «Галичфарм», г. Львов, Украина 2Корпорация «Артериум», г. Киев, Украина
Выбраны группы биологически активных веществ и разработаны методики для их идентификации и определения в растительном лекарственном средстве Седавит, таблетках. Разработаны методики высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для идентификации полифенольных соединений и количественного определения пиридоксина и никотинамида; газовой хроматографии (ГХ) для идентификации изовалериановой кислоты, спектрофотометрии (СФ) для количественного определения флавоноидов.
Ключевые слова: растительные лекарственные средства, Седавит, идентификация, количественное определение, методики контроля.
ВВЕДЕНИЕ
Растительные лекарственные средства содержат сложный комплекс веществ различных химических классов, при этом в результате воздействия технологических процессов или внутренних ферментативных реакций могут происходить химические преобразования этих веществ. Задача стандартизации лекарственного растительного сырья и лекарственных средств на их основе часто осложняется отсутствием определенных параметров контроля, а уже существующие не пригодны для проверки качественных и количественных характеристик. Целью нашей работы была разработка подхода к стандартизации готового лекарственного средства (ГЛС) на растительной основе, гарантирующего эффективность и безопасность для потребителей, обеспечивающего разработку спецификации и методов контроля качества, пригодных, в том числе, для обнаружения фальсифицированных лекарственных средств [1, 2]. Стандартизация предусматривала следующие взаимосвязанные этапы при фармацевтической разработке продукта:
- выбор индивидуальных соединений, групп биологически активных веществ (БАВ) или маркеров, по которым проводится оценка качества ГЛС;
- выбор методов и разработка методик идентификации и / или определения со-
держания индивидуальных соединений, групп БАВ или маркеров в ГЛС;
- выбор и обоснование критериев для стандартизации с учетом требований фармакопейных монографий, научных литературных данных и особенностей технологии производства.
Рассмотрим каждый из этапов на примере разработки готового лекарственного средства на растительной основе Седавит, таблетки.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом наших исследований было лекарственное средство Седавит, таблетки, активными фармацевтическими ингредиентами которого являются густой экстракт, состоящий из пяти растительных компонентов (корневища с корнями валерианы, плоды боярышника, трава зверобоя, листья мяты перечной, шишки хмеля), витамины - никотинамид (витамин Р) и пиридоксина гидрохлорид (витамин В6).
В работе использовали методы газовой (ГХ) и высокоэффективной жидкостной (ВЭЖХ) хроматографии. Исследования методом ГХ проводили на газовом хроматографе Agilent 6890 N" с пламенно-ионизационным детектором ("Agilent", США). Для ВЭЖХ-исследований использовали жидкостный хроматограф Agilent 1200 с детектором диодная матрица ("Agilent", США). Количественное определение сум-
мы флавоноидов проводили на спектрофотометре Cary 100 («Varían», Австралия). В работе были использованы стандартные образцы хлорогеновой, кофейной, феруло-вой и розмариновой кислот (Fluka), рутин, гиперозид, лютеолин, кверцетин, апигенин (Fluka). Для исследований использовали реактивы, соответствующие требованиям Европейской Фармакопеи (ЕР) и Государственной Фармакопеи Украины (ГФУ). Растворы реактивов готовили согласно требованиям ЕР/ГФУ [3, 4].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выбор индивидуальных соединений, групп БАВ или маркеров. Каждый растительный компонент комплексного экстракта содержит различные классы БАВ, которые по составу и соотношению могут меняться в зависимости от географических и климатических условий произрастания и культивирования, сбора, сушки и т.д. Комплексный экстракт производят, одновременно экстрагируя смесь пяти видов растительного сырья. Это затрудня-
Выбор критериев и методов идентификации и / или определения содержания индивидуальных соединений, групп БАВ или маркеров в ГЛС. При выборе методов контроля необходимо учитывать селективность и чувствительность методик, приемлемость для контроля качества в цепочке ЛРС - жидкий экстракт - густой экстракт - ГЛС. Наиболее подходящими этим требованиям и пригодными для стандартизации растительных
ет разработку стратегии контроля, в том числе качественного или количественного определения биологически активных веществ или веществ-маркеров, присущих для отдельных видов лекарственного растительного сырья (ЛРС), т.к. в экстракте будут присутствовать как общие для разных видов ЛРС, так и характерные для одного вида ЛРС вещества. В связи с этим нами был проведен литературный обзор БАВ исследуемых видов сырья [5-7], в результате которого были выбраны группы веществ, наличие и содержание которых могло бы использоваться для идентификации и количественного определения (результаты обзора представлены в таблице).
Согласно данным литературы [5-7], в составе БАВ четырёх видов ЛРС (плоды боярышника, трава зверобоя, листья мяты перечной, шишки хмеля) присутствуют фенольные соединения, которые были выбраны для качественных и количественных характеристик. Для доказательства присутствия в ГЛС корневищ с корнями валерианы в качестве маркера выбрали изовалериановую кислоту.
средств являются высокоселективные хро-матографические методы контроля [8].
Для идентификации и количественного определения синтетических компонентов никотинамида (витамин Р) и пиридоксина гидрохлорида (витамин В6) было предложено использование жидкостной хроматографии. Условия проведения анализа позволяют одновременно проводить идентификацию и количественное определение.
Таблица - Биологически активные вещества исследуемых видов сырья
Сырье Состав
Листья мяты перечной Эфирное масло (от 2,40 до 3,75%). Эфирное масло в своей основе состоит из ментола (41-65%), ментона и ментилацетата. Каротин, флавоноиды: апигенин, гесперидин, рутин, хлорогеновая, розмариновая, урсоловая и олеаноловая кислоты; микроэлементы: медь, марганец, стронций и др.
Трава зверобоя Флавоноиды: гиперицин, гиперозид, рутин, кверцитрин, кверцетин, хлорогеновая, кофейная кислоты, дубильные вещества, кумарины, каротиноиды, витамины С и РР.
Плоды боярышника Флавоноиды: кверцетин, гиперозид, рутин и др.; хлорогеновая, кофейная кислоты, гликозиды, каротиноиды, дубильные вещества, жирные масла, сапонины, пектиновые вещества и др.
Корневища с корнями валерианы Эфирное масло (от 0,5 до 2 %), главной частью которого является валериано-борнеоловый эфир, различные органические кислоты: валериановая, изовалериановая, муравьиная, уксусная и др., валепотриаты, алкалоиды: валерин, хатинин и др.
Шишки хмеля Горькие вещества гумулон, лупулон, гумуленовая кислота, изомеры гумулинона, эфирное масло, флавоноиды рутин, кверцитрин, дубильные вещества и др.
Для идентификации фенольных соединений в ГЛС избран метод жидкостной хроматографии. Идентификацию веществ проводили путем сравнения времен удерживания пиков на хроматограм-ме испытуемого раствора с временами удерживания стандартных веществ. При разработке методики в качестве стандартных веществ были использованы образцы хлорогеновой, кофейной, феруловой и розмариновой кислот, рутина, гиперозида, лютеолина, кверцетина, апигенина. Для рутинного контроля были избраны хлоро-геновая, розмариновая, кофейная кислоты и кверцетин как наиболее специфические
представители биологически активных веществ растительных компонентов, входящих в состав лекарственного средства. Хроматографирование проводили на жидкостном хроматографе с УФ-детектором с использованием хроматографической колонки С18; подвижная фаза А: 0,6 г/л раствор натрия дигидрофосфата моногидрат с рН 2,5 (с помощью кислоты фосфорной), подвижная фаза В: ацетонитрил; скорость подвижной фазы - 1,0 мл/мин; детектирование при длине волны 330 нм. Типичные хроматограммы раствора сравнения и испытуемого раствора представлены на рисунках 1.1 и 1.2.
Рисунок 1.1 - Типичная хроматограмма раствора сравнения, полученная при идентификации фенольных соединений
Рисунок 1.2 - Типичная хроматограмма испытуемого раствора Седавит, таблеток, полученная при идентификации фенольных соединений
Для идентификации в ГЛС кислоты изо-валериановой, содержащейся в корневищах с корнями валерианы, использовали газовую хроматографию. Идентификацию проводили путем сравнения времени удерживания основного пика на хроматограмме испытуемого раствора с временем удерживания
пика кислоты изовалериановой, которая является специфическим веществом для корневищ с корнями валерианы Хроматогра-фирование проводили на газовом хроматографе с пламенно-ионизационным детектором, используя капиллярную колонку длиной 60 м с внутренним диаметром 0,53 мм,
неподвижной фазой которой является ма-крогол 20000 Р с толщиной слоя 1 мкм; газ-носитель - гелий для хроматографии Р, скорость газа-носителя 5 мл/мин, деление потока 1:1. Типичные хроматограммы раствора сравнения кислоты изовалериановой и испытуемого раствора Седавит, таблеток представлены на рисунках 2.1 и 2.2.
При выборе критериев для количественного определения нужно учитывать содержание БАВ в растительном сырье, в
полупродуктах и особенности технологии. Требования должны отображать реальный уровень БАВ, который характеризует эффективность ГЛС. При этом, если в ГЛС содержится незначительное количество БАВ или маркера, в спецификацию вводятся требования только для идентификации, а в количественных испытаниях определяют сумму БАВ, в этом случае испытания могут быть проведены, например, спектрофотометрическим методом.
ГЦ! А.
а 1
ш- тв' 11- ■ »
»■ >
»
П' 1__<
1 1 * * К 11 к 1» Т1Г
Рисунок 2.1 - Типичная хроматограмма раствора сравнения кислоты изовалериановой,
полученная при ее идентификации
1* та *
ЩН
«И м-
И
«
¡0' 1 —
а 4 1 * 10 а 12 14 16 (ПИ
Рисунок 2.2 - Типичная хроматограмма испытуемого раствора Седавит, таблеток, полученная при идентификации кислоты изовалериановой
В состав Седавит, таблеток входит комплексный экстракт, состоящий из пяти видов ЛРС. Его терапевтическое действие определяет сложный комплекс БАВ, экстрагированных из растительного сырья. В связи с этим нерациональным является определение каждого отдельного компонента хроматографическим методом с последующим суммированием площадей пиков при количественном анализе действующих веществ. Для таких целей достаточно использовать спектрофотометрический метод, которым определяют суммарную оптическую плотность определяемых компонентов в условиях анализа [9]. При выборе стандартного образца для перерас-
чета содержания действующих веществ учитывали его доступность для рутинного контроля, входит ли избранное вещество в определяемую группу соединений, необходимость использования коэффициентов пересчета [9]. В качестве стандартного образца избран рутин, который в условиях анализа дает максимум поглощения при 415 нм и по ходу спектра существенно не отличается от такового для анализируемого раствора. Для рутинного контроля предложено использовать значение показателя поглощения рутина с алюминия хлоридом, что позволило упростить и удешевить методику количественного определения суммы флавоноидов, которые являются
типичной группой для использованных видов ЛРС. Оптическую плотность испытуемого раствора определяли после образования цветного комплекса извлеченных этилацетатом флавоноидов с алюминия хлоридом. В качестве компенсационного раствора использовали исходный раствор (этилацетатное извлечение) без добавления реактива алюминия хлорида, что позволило избежать влияния на результаты анализа сопутствующих веществ, экстрагированных этилацетатом. Параллельно
проводили измерения оптической плотности раствора стандартного образца рутина с алюминия хлоридом, используя в качестве компенсационного раствора исходный раствор стандартного образца рутина без добавления реактива алюминия хлорида.
Типичные дифференциальные спектры поглощения комплекса алюминия хлорида с флавоноидами исследуемого (комплексного экстракта) и стандартного образца рутина представлены на рисунке 3.
Рисунок 3 - Дифференциальные электронные спектры поглощения комплекса алюминия хлорида с флавоноидами исследуемого раствора Седавит, таблеток (1)
и стандартного раствора рутина (2)
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведенной работы предложен алгоритм стандартизации ГЛС растительного происхождения, на примере Седавит, таблеток, который включил условия выбора групп БАВ и маркеров, методик их идентификации и количественного определения, качественных и количественных критериев для оценки ГЛС.
SUMMARY
O. G. Smalyuh, S. V. Sur DEVELOPMENT OF IDENTIFICATION AND QUANTITATIVE DETERMINATION METHODS OF BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES IN HERBAL MEDICINAL PRODUCT SEDAVIT, TABLETS The groups of biologically active substances were selected and methods for their identification and determination in herbal medicinal product Sedavit, tablets were developed. The following procedures have been developed: HPLC procedures for identification of polyphenolic compounds and quantification
of pyridoxine and nicotinamide; gas chromatography procedures for identification of isovaleric acid, spectrophotometry procedures for quantitative determination of flavonoids.
Keywords: herbal medicinal products, Sedavit, identification, quantitative determination, control methods.
ЛИТЕРАТУРА
1. Сур, С. В. Методология оценки качества растительных лекарственных средств на основании результатов, полученных с помощью современных аналитических методов / С. В. Сур // Фармацевтический журнал. - 2002. - № 6. - С. 64 - 71.
2. Guidelines for the assessment of herbal medicines / WHO Expert Committee on Specification for Pharmaceutical Preparation. - Thirty-fourth Report. - Geneva: World Health Organization, 1996. - (WHO Technical Report Series, No. 863).
3. Державна Фармакопея Укра'ши / Державне тдприемство «Науково-ек-спертний фармакопейний центр». - 1-е вид. - Доповнення 2. - Харюв: Державне
тдприемство „Науково-експертний фар-макопейний центр", 2008. - 620 с.
4. Державна Фармакопея Украши / Державне тдприемство «Науково-екс-пертний фармакопейний центр». - 1-е вид.
- Харюв: Р1РЕГ, 2001. - 556 с.
5. Растительные лекарственные средства / Н. П. Максютина [и др.] // К.: Здоров'я, 1985. - 280 с.
6. Муравьева, Д. А. Фармакогнозия / Д. А. Муравьева. - Москва.: Медицина, 1981.
- 656 с.
7. Фармацевтическая энциклопедия Украины / Голова ред. ради В. П. Черних. -2-е изд. - К.: «МОР1ОН», 2010. - 1632 с.
8. Сур, С. В. Проблемы и перспективы разработки и внедрения современных ле-
карственных средств растительного происхождения / С. В. Сур, О. М. Гриценко // Лки Украши. - 2002. - № 4. - С. 47-49.
9. Гризодуб, А. И. Особенности фармакопейных подходов к количественному определению лекарственного растительного сырья и суммарных фитопрепаратов / А. И. Гризодуб, О. А. Евтифеева, К. И. Проскурина // ФАРМАКОМ. - 2012. - №6. - С. 7-30.
Адрес для корреспонденции:
Украина,
г. Львов, ул. Опрышковськая 6/8, ПАО «Галичфарм», e-mail: [email protected], Смалюх О. Г.
Поступила 03.11.2014 г.
Н. Е. Блажеевский, О. И. Коретник
ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ D(+)-БИОТИНА
В ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВАХ В ВИДЕ СООТВЕТСТВУЮЩЕГО
СУЛЬФОКСИДА
Национальный фармацевтический университет, г. Харьков, Украина
Разработана методика количественного определения d(+)-биотина в таблетках ВОЛВИТ® 5 мг методом постояннотоковой полярографии на ртутном капельном электроде в виде соответствующего сульфоксида d(+)-биотина, полученного посредством действия гидропероксомоносульфата калия в кислой среде. На фоне 0,25 моль/л НрО4 (рН 1,4) градуировочный график сохраняет линейный характер: I = 1,15*104с + 0,63, г=0,996. Исследовано влияние вспомогательных веществ, а также массы образца на определение d(+)-биотина разработанной методикой. При определении d(+)-биотина в таблетках по 5мг RSD<3%, 6=1,3% (п=5, Р=0,95%). Предел обнаружения (LOD) и предел количественного определения ^Оф) равны 1,1х10~5 и 3,6х 10-5 моль/л соответственно.
Ключевые слова: d(+)-Биотин, гидропероксомоносульфат калия, полярография, определение, таблетки.
ВВЕДЕНИЕ
^(+)-Биотин (Витамин Н) по химическому строению является гексагидро-2-1Н-тиено[3,4^]-имидазол-4-пентановой кислотой - соединение, содержащее конденсированную гетероциклическую систему имидазолового и тиофенового колец с остатком н-валериановой кислоты (рисунок 1). Благодаря наличию трех асимметричных атомов углерода возможно существование 8 оптических изомеров биотина и четырех рацематов. Однако биологиче-
скую активность имеет только природный ^(+)-биотин.
О
Рисунок 1 - Структурная формула ^(+)-биотина
