CC BY
55
Вісник Дніпропетровського університету. Біологія, медицина. Visnik Dnipropetrovs’kogo universitetu. Seria Biologia, medicina
Visnyk of Dnepropetrovsk University. Biology, medicine. 2013. 4(2)
ISSN 2310-4155
www.medicine.dp.ua
УДК 577.152.3
Властивості Na+, K+-активованої, М^2+-залежної АТФ-гідролази лімфоцитів крові у хворих на реактивний артрит
О.В. Мельник, О.П. Корнійчук, О .І. Першин, З.Д. Воробець
Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького, Львів, Україна
Установлено зміни та проаналізовано кінетичні властивості оуабаїнчутливої Na+, K+-АТФазної активності сапонін-перфорованих лімфоцитів периферичної крові практично здорових осіб і хворих на реактивний артрит (РеА). У лімфоцитах периферичної крові хворих на РеА первинно-активне транспортування іонів Na+, K відбувається повільніше і менш інтенсивно порівняно з практично здоровими донорами, але характеризується приблизно однаковою ємністю з донорами. Константа афінності до АТФ у лімфоцитах периферичної крові хворих на РеА перевищує її значення порівняно з практично здоровими донорами у 2,9 раза. За умов розвитку ревматичної патології в імунокомпетентних клітинах інгібування активності Na+, K-АТФази відбувається не за рахунок зменшення кількості обертів ензиму, а шляхом підвищення спорідненості оуабаїнчутливої Na+, K-АТФази до АТФ. Водночас, М>-2+-зв’язувальна ділянка оуабаїнчутливої Na+, K-АТФази лімфоцитів хворих на РеА залишається нативною. Афінність Na+, K-АТФази лімфоцитів периферичної крові донорів до іонів К перевищує афінність у хворих на РеА у 2,4 раза. Na+, K-АТФаза лімфоцитів периферичної крові хворих на РеА зберігає свої нативні рецепторні властивості: чутливість до інгібування оуабаїном не змінюється. Припускається, що за умов розвитку ревматичної патології вплив на структуру Na+, K+-АТФази здійснюється як із зовнішньоклітинної, так і з цитоплазматичної поверхні мембрани.
Ключові слова: Na+, K+-АТФаза; реактивний артрит; лімфоцити
Properties of Na+,K+-activated, Mg2+-dependent ATP-hydrolyze of blood lymphocytes in patients with теа^^ arthritis
O.V. Melnyk, O.P. Kornijchuk, O.I. Pershyn, Z.D. Vorobets
Danylo Halytski Lviv National Medical University, Lviv, Ukraine
А significant role in the development and course of reactive arthritis (ReA) is played by Г-lymphocytes as their development and systemic manifestations are based on immunological mechanisms. Additionally, the pathogenesis of many diseases is linked to changes in the structure and function of ion-transporting systems. Therefore, the aim of the study was to find out the kinetic properties of АТР-hydrolysis reaction involving Na+,K -ATPase of peripheral blood lymphocytes of healthy individuals and patients with ReA. We used the current methodological approaches to the study of ATPase activity in saponin permeabilized cells. We conducted an analysis of the kinetic properties of ouabainsensitive Na+,K -ATPase activity of saponin-perforated peripheral blood lymphocytes of healthy donors and patients with rheumatoid arthritis (RfiA). We found out that in peripheral blood lymphocytes of patients with ЯеА primary active transport of Na+, K ions is slower and less intensive, though characterised by the same capacity, as in healthy donors. The affinity constant for ATP in peripheral blood lymphocytes in patients with ЯеА is greater by 2.9 times than its value in comparison with healthy donors. We established that in conditions of rheumatic pathology in immunocompetent cells, inhibition of Na+,K -ATPase activity is not caused by reduction of speed of enzyme work, but by increase of affinity of ouabainsensitive Na+,K -ATPase to ATP. At the same time, the Mg2+-binding center of Na+,K -ATPase in patients with ЯеА is endogenous. We also found that affinity Na+,K -ATPase to the ions K+ in peripheral blood lymphocytes of healthy donors is 2.4 times higher than in patients with ЯеА. We observed that Na+,K -ATPase of peripheral blood lymphocytes of patients with ЯеА retains its endogenous receptor properties -sensitivity to ouabain does not change. It is assumed that under conditions of rheumatic pathology the impact on the Na+,K -ATPase structure occurs both externally and on the cytoplasmic membrane surface. The above experimental data can be used for further clarification of the membrane mechanisms of ion exchange in immunocompetent cells of patients suffering from autoimmune diseases.
Keywords: Na+,K-ATPase; reactive arthritis; lymphocytes
Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького, вул. Пекарська, 69, 79010, Львів, Україна Danylo Halytskyi Lviv National Medical University, 69 Pekarska str., 79010, Lviv, Ukraine Теї.: +038067-494-31-54. E-mail: [email protected]
Вступ
Реактивний артрит (РеА) є одним із найрозповсюд-женіших запальних аутоімунних захворювань суглобів. Високі показники поширення та захворюваності, схильність до прогресування, розвиток непрацездатності серед осіб середнього віку зумовлюють високу медико-соціальну значимість цієї патології (Berezhnyi et al., 2013; Kovalenko, 2011; Spaska, 2011). РеА - системне захворювання, яке розвивається внаслідок урогеніталь-ної (найчастіше хламідійної), кишкової або носоглоткової інфекції (Zeidler et al., 2004; Hamdulau et al., 2006; Kim ey al., 2009; Kohnke, 2009; Spaska, 2011; Berezhnyi et al., 2013).
Згідно із сучасними уявленнями, значна роль у розвитку та перебігу артритів належить Т-лімфоцитам. В основі РеА та його системних проявів лежать імунологічні механізми (Colmegna and Espinoza, 2005; Leirisalo-Repo, 2005; Leirisalo-Repo and Sieper, 2006; Lychkovska, 2011). Тому актуальними є питання, які стосуються саме імунопатології ревматичних захворювань, їх механізмів виникнення та розвитку.
Патогенез багатьох захворювань пов’язаний зі змінами структури та функцій біомембран, у формуванні яких значна роль належить мембранозв’язаним білкам, зокрема інтегральним АТФ-залежним транспортувальним системам іонів. Na+, К+-АТФаза (ЕС 3.6.1.37) -маркерний ензим плазматичної мембрани, який селективно інгібується оуабаїном, є Са^-незалежною, Na+, K+ -активованою, М§-2+-АТФ-залежною транспортувальною системою, що здійснює активне трансмембранне перенесення іонів Na+, K+ і тим самим підтримує їх електрохімічні градієнти, необхідні для нормального функціонування клітини. Активність Na+, K-АТФази відіграє ключову роль у підтриманні внутрішньоклітинного іонного гомеостазу, осмотичного балансу та трансмембранного потенціалу клітин, змінюється під впливом гормонів, факторів росту та стресу.
Нашими попередніми дослідженнями показано (Melnyk et al., 2011), що у хворих на РеА Na+, K+ -АТФазна активність лімфоцитів периферичної крові істотно відрізняється від контрольної групи, а після проведеного лікування хворих у стаціонарі спостерігається наближення активності Na+, K+-АТФази до ії контрольних значень. На сьогодні нез’ясованими залишаються біохімічні механізми порушення функціональної активності Na+, K+-АТФази у лімфоцитах периферичної крові за умов розвитку автоімунного процесу. Комплексне вивчення функціонування та ролі Na+, K -помпи як системи енергозалежного транспортування іонів Na+, K у регуляції функціональної відповіді клітини (з використанням фізіологічних методів дослідження на цілісних об’ єктах) і ензиматичної активності Na+, K+-АТФази (з використанням біохімічних методів) на одному об’єкті дасть можливість сформувати цілісне уявлення про участь цих систем у підтриманні іонного гомеостазу клітини. З огляду на це, мета цієї роботи - з’ ясувати кінетичні характеристики АТФ-гідролазної реакції за участю Na+, K+ -АТФази сапонін-перфорованих лімфоцитів периферичної крові клінічно здорових осіб і хворих на РеА.
Матеріал і методи досліджень
Дослідження проводили на лімфоцитах периферичної крові донорів і хворих, які перебували на стаціонарному лікуванні у ревматологічному відділенні Львівської обласної клінічної лікарні. Усіх хворих поділено на дві дослідні групи: хворі на РеА до (п = 14) та після проведеного лікування (п = 14). Групу контролю становили практично (клінічно) здорові донори віком 20-30 років (п = 15).
Відповідні діагнози встановлювали на базі загальновизнаних критеріїв. Використано широкий комплекс загальноклінічних, лабораторних, спеціальних ревматологічних, інструментальних, мікробіологічних, імунологічних досліджень з метою виявлення причини розвитку реактивного артриту (Leirisalo-Repo and Sieper, 2006).
Моноядерні лімфоцити периферичної крові людини виділяли з гепаринізованої свіжоотриманої крові хворих і донорів у градієнті концентрації фікол-тріумбрасту (1,08 г/см3) (Boyum, 1968). Цілісність і життєздатність лімфоцитів, яка в усіх дослідах становила не менше 95%, оцінювали за забарвленням трипановим синім (Michell and Shiigi, 1980). Для пермеабілізації мембран лімфоцитів периферичної крові з метою розкриття латентної Na+, K+-АТФазної активності до суспензії лімфоцитів додавали 0,2% сапонін (Fafula et al., 2012). Ця методика ґрунтується на роботах, виконаних на лімфоцитах раніше. Вміст білка у лімфоцитарній суміші визначали методом Лоурі (Lowry et al., 1951).
Визначення загальної АТФазної ензиматичної активності лімфоцитів проводили при 37 °С у
середовищі інкубації (об’ємом 1 мл) такого складу (мМ): 30 NaCl, 120 KCl, 5 Ugd2, 1,5 АТФ, 1 ЕГТА, 1 NaN3 (інгібітор мітохондріальної АТФази) (Fafula et al., 2012), 20 Hepes-Tris-буфер 7,4), 0,1 мкМ тапсигаргін (селективний інгібітор Са2+, Mg2+-АТФази ЕПР) (Fafula et al., 2012). Ензиматичну реакцію ініціювали внесенням до інкубаційного середовища аліквоти лімфоцитарної суміші - 100 мкл (кількість білка у пробі не перевищувала 50-100 мкг/мл). Тривалість інкубації - 1-15 хв. Ензиматичну реакцію зупиняли додаванням 1 мл охолодженого стоп-розчину такого складу: 1,5 M натрій ацетат, 3,7% формальдегід, 14% етанол, 5% ТХО (рН = 4,3). Базальну М?2+-АТФазну активність лімфоцитів тестували в аналогічному середовищі інкубації, але за присутності 1 мМ оуабаїну - селективного інгібітора Na+, K+-АТФази (Han et al., 2006). Оуабаїнчутливу Na+, К+-АТФазну активність обчислювали за різницею між величиною загальної АТФазної та базальної Mg2+ активності.
У дослідах контролем на неензиматичний гідроліз АТФ було стандартне середовище інкубації, яке не містило досліджуваної проби. Як контроль на кількість ендогенного неорганічного фосфору (Р) в лімфоци-тарній суміші використовували суспензію лімфоцитів у фізіологічному розчині. Кількість продукту реакції Рі визначали методом W. Rathbun та V. Betlach (Rathbun and Betlach, 1969) і виражали у мкмоль Р/хв-мг протеїну.
Дослідження кінетичних властивостей ензиматичної реакції Na+, K+-активованої, Mg2+-залежної АТФ-гідролазної реакції проводили у стандартному середовищі інкубації, модифікованому за фізико-
хімічними характеристиками чи складом відвідних компонентів (час інкубації, концентрації АТФ, Na+, K+, оуабаїну). Всі експерименти з вивчення властивостей Na+, К+-АТФазої ферментативної реакції проводили в режимі початкової швидкості V0 (лінійність
накопичення продукту Р у часі).
Уявні кінетичні параметри, які характеризують реакцію вивільнення неорганічного фосфору під час Na+, K -активованого, Mg2+-залежного гідролізу АТР -максимальну миттєву швидкість реакції V0, максимальну (платову) кількість утворення продукту реакції Pmax та характеристичний час реакції (період напівнасичення) визначали як описано у статті (Keleti, 1990). Уявні кінетичні параметри, які характеризують Na+, K+-активовану, М?2+-залежну АТР-гідролазну реакцію - константу активації іонами, константу Міхаеліса (КтАТФ) та початкову максимальну швидкість реакції гідролізу АТР визначали методом Лайнуївера - Берка (Keleti, 1990). Отримані концентраційні залежності швидкості ензиматичної реакції від досліджуваних реагентів реакції гідролізу будували в координатах: {1/V від 1/S}, де S - задана концентрація реагенту, а V - швидкість ензиматичного гідролізу АТР при заданій концентрації.
При визначенні ефективності впливу оуабаїну на Na+, K+-АТФазну активність (уявної константи інгібування (І0,5) та коефіцієнта Хілла (пН)) лінеаризовані криві концентраційних залежностей будували у координатах Хілла {lg[(А0-А)/А]; /д/7/}відповідно до емпіричного рівняння Хілла:
lg[('Ао-А)/А/ = -пн lg I0,5 + Пн lg [I], де А0 та А - питома активність ензиму за відсутності та присутності у середовищі інкубації оуабаїну в концентрації І.
Кінетичні та статистичні розрахунки проводили у програмному забезпеченні MS Office. Результати досліджень обробляли загальноприйнятими методами варіаційної статистики з використанням /-критерію Стьюдента. Рівняння прямої лінії, що найкраще апроксимує еспериментальні дані, розраховували із використанням методу найменших квадратів. Абсолютне значення коефіцієнта кореляції становило 0,90-0,99. Достовірність розрахованих параметрів прямої перевіряли за F-критерієм Фішера: достовірною вважали апроксимацію, за якої P < 0,05.
У дослідах використовували реактиви АТФ, Hepes, Tris, оуабаїн, тапсигаргін, ЕГТА (Sigma, США). Інші використані у дослідах реактиви були вітчизняного виробництва кваліфікації' ЧДА та ХЧ.
цього суспензію лімфоцитів інкубували у стандартному середовищі інкубації протягом різних проміжків часу (1-15 хв). Дані експериментів показали, що кінетику Ла+, К -активованого Mg2+-залежного гідролізу АТФ сапонін-перфорованими лімфоцитами віддзеркалюють криві, які мають тенденцію до насичення (рис. 1). Аналіз отриманих результатів дозволяє дійти висновку, що кінетика Ла+, К-активованого, М?2+-залежного гідролізу АТФ, каталізованого сапонін-перфорованими лімфоцитами, узгоджується із закономірностями реакції нульового порядку в діапазоні 0-5 хв: у цьому інтервалі часу графік залежності Р, від періоду інкубації є практично лінійним.
Рис. 1. Динаміка вивільнення неорганічного фосфору (Р) у процесі Na+, K+-активованого, М?2+-залежного гідролізу АТФ сапонін-перфорованими лімфоцитами периферичної крові донорів (1), хворих на РеА до лікування (2) (M ± m, n = 4-6)
Як випливає з рисунка 1, в усьому діапазоні часу кількість вивільненого неорганічного фосфору Рі оуабаїнчутливою Na+, K -АТФазою лімфоцитів хворих на РеА дещо нижча порівняно з величною у донорів. Шляхом лінеаризації отриманих даних у координатах P/t від P обчислено основні кінетичні характеристики реакції Na+, K-активованого, Mg2+-залежного гідролізу АТФ сапонін-перфорованими лімфоцитами (табл. 1).
Таблиця 1
Кінетичні параметри Na+, K+-активованого,
Mg2+-залежного гідролізу АТФ сапонін-перфорованими лімфоцитами периферичної крові донорів і хворих на РеА до проведеного лікування (M ± m, n = 4-6)
Результати та їх обговорення
Із метою вивчення особливостей та механізму роботи Ла+, К-АТФази визначали максимальну миттєву швидкість реакції (¥0), максимальну (платову) кількість утворення продукту реакції (Ртах) та характеристичний час реакції (т) (Кеіей, 1990; БаШа й аі., 2012). Для встановлення цих кінетичних параметрів М^-залежного гідролізу АТФ, який каталізується Ла+, К-АТФазою лімфоцитів, досліджували динаміку накопичення продукту АТФ-гідролазної реакції. Для
Кінетичні параметри Донори РеА
V0, мкмоль PJ хв ■ мг протеїну 6,08 ± 0,45 3,22 ± 0,26*
Pmax, мкмоль Р ¡I мг протеїну 25,0 ± 1,0 28,1 ± 0,1
X, хв. 4,18 ± 0,51 9,40 ± 0,65*
Примітки: У0 - максимальна миттєва швидкість реакції, Ртах - максимальна (платова) кількість продукту реакції, Т - характеристичний час реакції (період напівнасичення); зміни вірогідні стосовно величин у лімфоцитах в осіб групи контролю та хворих на РеА, * - Р < 0,05.
Значення кінетичних параметрів Ыа+, К-активованого, М^^+-залежного гідролізу АТФ сапонін-перфо-
рованими лімфоцитами донорів і хворих на ревматичне захворювання істотно відрізняються. За відсутності вірогідної різниці величини Pmax гідролізу АТФ сапонін-перфорованими лімфоцитами, виділеними у донорів і хворих на РеА, нами показано, що значення VI) у хворих на ревматичні захворювання істотно відрізняються від контрольної групи. На основі цих даних можна припустити, що у лімфоцитах периферичної крові хворих на РеА транспортування іонів Ыа+ та К відбувається повільніше і менш активно, але характеризується практично однаковою ємністю.
Згідно з результатами каталітичного титрування суспензії лімфоцитів розчином АТФ у діапазоні концентрацій 0,1-2,0 мМ (за сталої концентрації М^:+, 5 мМ) відбувається монотонне збільшення ензиматичної активності оуабаїнчутливої Ыа+, К-АТФази з виходом на плато (рис. 2). Можна бачити, що в усьому діапазоні досліджуваних концентрацій АТФ активність Ыа+, К -АТФази хворих на ревматичне захворювання знижена порівняно із даною величною у донорів.
8
£
*©
Т 6
еї 4
dB
с
£
%
О
О 0.5 1 1,5 2
|ЛТФ|. мМ
Рис. 2. Залежність впливу АТФ на активність оуабаїнчутливої N.а+, К+-АТФази сапонін-перфорованих лімфоцитів периферичної крові донорів (1) і хворих на РеА до лікування (2) (М ± т, п = 4-6)
Для з’ясування можливого механізму зміни ензиматичної активності Ыа+, К-АТФази в імунокомпетентних клітинах хворих на РеА, шляхом лінеаризації отриманих даних у координатах Лайнуївера - Берка, проведено визначення основних кінетичних параметрів Ыа+, К -активованого М?2+-залежного гідролізу АТФ сапонін-перфорованими лімфоцитами периферичної крові донорів і хворих (табл. 2).
Таблиця 2
Кінетичні параметри, які характеризують Ма+, К+-активований М?2+-залежний гідроліз АТФ сапонін-перфорованими лімфоцитами периферичної крові донорів і хворих на РеА від концентрації АТФ
(М ± т п = 4-8)
Кінетичні параметри Донори РеА
Vmax, мкмоль Р/ хв ■ мг протеїну 6,30 ± 0,14 7,76 ± 0,58
Катф, мМ 0,27 ± 0,01 0,79 ± 0,05 *
Примітки: Утах - початкова максимальна активність ензиму, Катф - константа Міхаеліса за АТФ; * - зміни вірогідні стосовно величин у лімфоцитах осіб групи контролю (Р < 0,05).
Величини КАТФ знаходяться в діапазоні концентрацій 10-3 М, що відповідає фізіологічній концентрації MgАТФ у цитоплазмі. Розрахунок кінетичних параметрів оуабаїнчутливої Na+, К-АТФазної активності свідчить, що максимальна швидкість гідролізу АТФ сапонін-перфорованими лімфоцитами периферичної крові донорів і хворих на РеА, визначена за АТФ, практично не відрізняється у нормі та при патології. Водночас константа афінності до АТФ у лімфоцитах периферичної крові хворих на РеА значно зростає (у 2,9 раза порівняно з практично здоровими донорами).
При інтерпретації отриманих даних з урахуванням кінетичних параметрів, визначених за АТФ, ми дійшли висновку, що за умов розвитку ревматичної патології в імунокомпетентних клітинах інгібування активності досліджуваної ензиматичної системи відбувається не за рахунок зменшення числа обертів ензиму, а за рахунок підвищення спорідненості оуабаїнчутливої Na+, К -АТФази до АТФ. Оскільки центр гідролізу АТФ локалізований на цитоплазматичній поверхні мембрани, ми припускаємо, що однією з можливих причин конкурентного інгібування ензиму може бути вплив на ензим з боку інших патологічних змін і процесів у лімфоцитах, які мають місце при ревматичній патології. Під час запалення або дії цитотоксичних факторів у позаклітинному оточенні можуть створюватися високі локальні концентрації АТФ (Bodin and Burlstock, 2001). Можливо, такі зміни концентрацій АТФ і ведуть до зростання спорідненості оуабаїнчутливої Na+, К -АТФази до АТФ.
При вивченні впливу різних концентрацій іонів Na+, К (мМ/мМ) на питому ензиматичну активність оуабаїнчутливої Na+, К-АТФази частину KCl в інкубаційному середовищі ізотонічно замінювали на NaCl (сумарна концентрація Na+ + К = 150 мМ). Графік залежності Na+, К+-АТФази лімфоцитів периферичної крові донорів і хворих на РА та АСА має типовий куполоподібний вигляд (рис. 3). Оптимальним для функціонування ензиму є співвідношення іонів 125 К : 25 Na+. У разі відсутності одного з іонів в інкубаційному середовищі Na+, К-АТФаза не тестується.
Графіки залежності оуабаїнчутливої Na+, К -АТФазної активності лімфоцитів периферичної крові донорів і хворих на РеА від співідношення іонів Na+ і К (за ізотонічних умов Na+ + К = 150 мМ) у висхідній частині калієвої компоненти кривих лінеаризовано у координатах Лайнуївера - Берка.
Розрахунок кінетичних параметрів оуабаїнчутливої Na+, К-АТФазної активності свідчить, що початкова максимальна швидкість гідролізу АТФ сапонін-перфорованими лімфоцитами периферичної крові донорів і хворих та РеА, визначена за К, і уявна константа активації іонами К+ у лімфоцитах периферичної крові хворих на РеА вірогідно відрізняються порівняно з практично здоровими донорами. Це відповідає змішаному типу інгібування ензиму.
Інтерпретуючи отримані дані з урахуванням кінетичних параметрів, визначених за К+, ми дійшли висновку, що за умов розвитку ревматичної патології в імуноком-петентних клітинах інгібування активності досліджуваної ензиматичної системи відбувається внаслідок зменшення числа обертів ензиму. Можна припустити,
що зниження величини ¥тах може бути пов’язане зі зменшенням Ла+/К електрохімічного градієнта цитоплазматичної мембрани лімфоцитів, зниженням кількості транспортувальних одиниць (зменшення їх експресії у мембрані) або зменшенням кількості обертів ензиму. Зниження величини уявної константи активації КК+ за умов ревматичної патології вказує на збільшення спорідненості Ла+, К -АТФази до іонів калію. Подібні результати отримані дослідниками для Н/К+-АТФази парієтальних клітин при розвитку експериментальної виразки шлунка (8йоска й аі., 2010). Враховуючи те, що центр спорідненості до іонів К локалізований на зовнішньоклітинній поверхні мембрани, ми припускаємо, що зміни афінності до іонів К+ (і відповідно інгібування ензиматичної активності Ла+, К -АТФази) спричинені також позаклітинними впливами на структуру мембрани.
0 25 50 75 100 125 150 lNa1-MM
1 І І І І І Ь
150 125 100 75 50 25 0 (К+Ь мМ
Рис. 3. Вплив зміни співідношення іонів Na+ і K+
(за ізотонічних умов Na+ + K+ = 150 мМ) на активність оуабаїнчутливої Na+, K+-АТФази сапонін-перфорова-них лімфоцитів периферичної крові донорів (1) і хворих на РеА (2) (M ± m, n = 4; за 100 % прийнято ензиматичну активність за оптимального співвідношення іонів Na+ і K+)
Na+, K-активована Mg2+-залежна АТФаза, яка поєднує транспортно-гідролітичну та рецепторну функції, специфічно взаємодіючи з екзогенними інгібіторами -серцевими глікозидами або їх ендогенними аналогами (Kaplia et al., 2006; Valente et al., 2003). Кардіоактивний стероїд оуабаїн належить до високоселективного інгібітора Na+, K-АТФази. Оуабаїн зв’язується з ензимом із зовнішнього боку цитоплазматичної мембрани. Вважають, що оуабаїн блокує ензим у конформації P-E2, гальмуючи у такий спосіб перехід ензиму в інший конформаційний стан P-Ej. Оуабаїн в інтервалі концентрацій 10-6 - 10-3 М дозозалежно пригнічує оуабаїнчутливу Na+, K-АТФазну активність лімфоцитів периферичної крові донорів і хворих на ревматичні захворювання (рис. 4). Характер інгібування оуабаїном для ензиму у нормі та при патології однаковий. Для з’ясування параметрів інгібування Na+, K+-
АТФази оуабаїном проведено лінеаризацію концентраційних кривих у координатах Хілла. Параметри інгібування відповідали високочутливому до оуабаїну фенотипу Ыа+, К-АТФази, який визначається подібністю структури рецепторної ділянки і є характерним для всіх ізоензимів Ыа+, К-АТФази у людини (Карііа еі аі., 2006).
Таблиця 3
Кінетичні параметри, які характеризують Na+, К-активований, М?2+-залежний гідроліз АТФ сапонін-перфорованими лімфоцитами периферичної крові донорів і хворих на РеА від зміни співідношення іонів N. і К (за ізотонічних умов Ыа+ + К = 150 мМ, М ± т, п = 4-8)
Кінетичні параметри Донори РеА
Vmax, мкмоль Р J хв ■ мг протеїну 7,74 ± 0,29 5,62 ± 0,26*
КК+, мМ 66,8 ± 3,4 27,6 ± 2,28*
Примітки: Утах - початкова максимальна активність ензиму, КК+ - уявна константа активації іонами К; * - зміни вірогідні стосовно величин у лімфоцитах осіб групи контролю (Р < 0,05).
Значення уявної константи інгібування оуабаїном і коефіцієнт Хілла в лімфоцитах периферичної крові донорів і хворих на РеА вірогідно не відрізняються. Отже, Ыа+, К-АТФаза лімфоцитів периферичної крові хворих на РеА зберігає свої нативні рецепторні властивості - чутливість до інгібування оуабаїном не змінюється. Збереження нативних рецепторних властивостей Ыа+, К-АТФази до оуабаїну показано у клітинах карциноми товстої кишки людини (Карііа еі аі., 2007). Іншими дослідниками показано, що має місце зміна кінетики зв’язування оуабаїну з Ыа+, К -АТФазою лімфоцитів у хворих на мігрень, і це може бути корисним інструментом у діагностиці мігрені (8саггопе еі аі., 2007).
-6 -5 -4 -З
їй [уабаїн], М
Рис. 4. Інгібування оуабаїном Иа+, К-АТФазної активності сапонін-перфорованих лімфоцитів периферичної крові донорів (1) та хворих на РеА (2)
(М ± т, п = 6)
За 100% прийнято ензиматичну активність Ла+, К+-АТФази за відсутності в інкубаційному середовищі оуабаїну.
Висновки
У лімфоцитах периферичної крові хворих на РеА первинно-активне транспортування іонів Na+, K відбувається повільніше і менш інтенсивно порівняно зі здоровими донорами, але характеризується практично однаковою ємністю з донорами. За умов розвитку ревматичної патології константа афінності Na+, K-АТФази до АТФ у лімфоцитах периферичної крові хворих на РеА зростає порівняно з практично здоровими донорами. Водночас, Mg2+-зв’язувальна ділянка оуабаїнчутливої Na+, K-АТФази лімфоцитів хворих на РеА залишається нативною. Відмічається також зниження афінності Na+, K-АТФази лімфоцитів периферичної крові до іонів К і збереження рецепторних властивостей до оуабаїну у хворих на РеА. Наведені експериментальні дані можуть бути використані для подальшого з’ ясування мембранних механізмів іонного обміну в імунокомпетентних клітинах при автоімунних захворюваннях.
Бібліографічні посилання
Berezhnyi, V.V., Marushko, T.V., Marushko, J.V., 2013. Clinical reumatology. Kyiv (in Ukrainian).
Bodin, P., Burnstock, G., 2001. Purinergic signalling: ATPase.
Neurochem. Res. 26(15), 959-969.
Boyum, A., 1968. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21(97), 77-79.
Colmegna, I., Espinoza, L., 2005. Recent edvances in reactive arthritis. Curr. Reumatol. Rep. 7(3), 201-207.
Fafula, R.V., Efremova, U.P., Lychkovska, N.E., Vorobets, Z.D., 2012. Kinetic properties of Na+,K-activated, Mg2+-dependent ATP-hydrolysis of blood lymphocytes in patients with rheumatoid arthritis and ankylosing spondyloarthritis. Ukr. Biochem. J. 84(3), 44-54 (in Ukrainian).
Hamdulau, S.S., Glynne, S.J., Keat, A., 2006. When is arthritis reactive? Posgrad. Med J. 82(969), 446-453.
Kaplya, A.A., Kudryavceva, A.G., Gorchev, V.F., Osinsky, D.C., Hizhnyak, S.V., 2006. Determination of Na+,K-ATPase activity in human colorectal carcinoma. Ukr. Biochem. J. 78(2), 142-148 (in Ukrainian).
Кеіей, Т., 1990. General of enzymatic kinetics. Mir, Мoscow (in Russian).
Kim, P.S., Klausmeier, T.L., Orr, D.P., 2009. Reactive arthritis. Therapia 11(41), 38-44.
Kohnke, S.J., 2004. Reactive arthritis. A clinical approach. Orthop. Nurs. 23(4), 274-280.
Kovalenko, V.M., 2011. Optimisation of swelling and inflammatory joint syndromes’ triatmeny in patients with reumatic joint deseases. Ukr. Rheumat. J. 44(2), 74-78 (in Ukrainian).
Leirisalo-Repo, M., 2005. Reactive arthritis. Scand. J. Rheumatol. 34(4), 251-259.
Leirisalo-Repo, M., Sieper, J., 2006. Reactive arthritis: Epidemiology, clinical features, and treatment. Spondylites and the spondyloarthropathies. Philadelphia, Mosby Elsevier, 53-64.
Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., 1951. Protein measurement wirh the folin phenolreagent. J. Biol. Chem. 193(1), 265-275.
Lychkovska, N., Fafula, R., Efremova, U., Vorobets, Z.D., 2011. A study of Na+,K+-ATPase and arginase activity in peripheral blood lymphocytes in patient with rheumatic diseases. Annales Universitatis Mariae Curie-Sklowowska 24(1), 171-177.
Melnyk, O.V., Lychkovska, N.E., Kornijchuk, O.P., Vorobets, Z.D., 2012. ATP-hydrolase lymphocytes of peripheral blood activities in patient with reactive arthritis. Bukov. Med. Vis-nyk 16(3), 50-53.
Mishell, B.B., Shiigi, S.M., 1980. Selected methods in cellular immunology. W.H. Freeman & Co, San Francisko.
Rathbun, W., Betlach, V., 1969. Estimation of enzymically produced orthophosphate in the presence of cysteine and adenosine triphosphate. Anal. Biochem. 28, 436-447.
Spaska, G.O., 2011. Reactive arthritis: Modern look on the problem. Ukr. Med. Chasopys 6(86), 82-88 (in Ukrainian).
Scarrone, S., Podesta, M., Cupello, A., Finocchi, C., Frassoni, F., 2007. Abnormalities of Na/K-ATPase in migraine aura. Cephalalgia 27(2), 128-132.
Tian, J., Cai, T., Yuan, Z., Wang, H., Lui, L., 2006. Binding of Src to Na+/K+ -ATPase form a functional signaling complex. Mol. Biol. Cell. 17, 317-326.
Valente, R.C., Capella, L.S., Monteiro, R.Q., 2003. Mechanism of ouabain toxicity. Faseb. J. 17(12), 1700-1702.
Zeidler, H., Kuipers, J., Kohler, L., 2004. Chlamidia-induced arthritis. Curr. Opin. Reumatol. 16(4), 380-392.
Надійшла до редколегії 15.11.2013
