CC BY
37
Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Медицина. - 2012. - Вип. 3, т. 1. - С. 146-151. Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology. Medicine. - 2012. - Vol. 3, N 1. - P. 146-151.
УДК 616-006.04
О. І. Якубець, Д. З. Воробець, З. Д. Воробець
Львівський національний медичний університет ім. Данила Галицького
ОСОБЛИВОСТІ Na+/K+- ТА Н-АТФазних АКТИВНОСТЕЙ ЛІМФОЦИТІВ ПЕРИФЕРИЧНОЇ КРОВІ ЖІНОК, ХВОРИХ НА РАК ЯЄЧНИКА
Вивчено зміни Na/K-АТФазної та Н-АТФазної активностей лімфоцитів периферичної крові жінок, хворих на рак яєчника. Встановлено значне зниження оуабаїн-залежної Na+/K-АТФазної та мітохондріальної Н-АТФазної активностей у лімфоцитах периферичної крові пацієнток, хворих на рак яєчника, порівняно з клінічно здоровими жінками.
О. И. Якубец, Д. З. Воробец, З. Д. Воробец
Львовский национальный медицинский университет им. Данила Галицкого
ОСОБЕННОСТИ Na+/K+- И Н-АТФазных АКТИВНОСТЕЙ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЖЕНЩИН, БОЛЬНЫХ РАКОМ ЯИЧНИКА
Изучены изменения Na/K-АТФазной и Н-АТФазной активностей лимфоцитов периферической крови женщин, больных раком яичника. Показано значительное снижение оуабаин-зависимой Мя/К-АТФазной и митохондриальной Н-АТФазной активностей в лимфоцитах периферической крови пациенток, больных раком яичника, по сравнению с клинически здоровыми женщинами.
O. I. Yakubets, D. Z. Vorobets, Z. D. Vorobets
Danylo Balitsky Lviv National Medical University
FEATURES OF Na+/K- AND Н-АТРазез ACTIVITIES OF PERIPHERAL BLOOD LYMPHOCYTES IN PATIENTS WITH AN OVARIAN CARCINOMA
The changes of Na+/K-ATPase and H+-ATPase enzymatic activities of the peripheral blood lymphocytes in patients with an ovarian carcinoma have been studied. The significant decrease of ouabain-sensitive Na+/K-ATPase and H+-ATPase enzymatic activities in patients with ovarian carcinoma in comparison with the clinically healthy women was shown.
Вступ
Рак яєчника (РЯ) - одна з найпоширеніших онкологічних патологій. Щорічно у світі реєструється понад 200 тисяч нових випадків злоякісних новоутворень яєчника [15; 22]. За даними Національного концерн-реєстру України 2010 року, в Україні показник захворюваності на РЯ коливається в межах 14,7-15,3 випадка на 100 тисяч жіночого населення. Незважаючи на застосування удосконалених підходів до лікування РЯ, в основу яких покладено поєднання хірургічного втручання та хіміотерапії, залишаються нез’ясованими багато питань етіології, патогенезу,
© О. І. Якубець, Д. З. Воробець, З. Д. Воробець, 2012 146
діагностики пухлинного росту. Продукти секреції пухлинних клітин мають пригнічувальну дію на органи та тканини організму. У зв’язку з цим актуальною є проблема дослідження структурно-функціональних змін у різних органах і тканинах онкологічно хворих. У цьому плані одним із найдоступніших об’єктів досліджень є лімфоцити периферичної крові. Внутрішньоклітинний метаболізм лімфоцитів ґрунтується на фізіологічно закріпленій здатності цих клітин швидко реагувати на будь-які зміни гомеостазу організму, а модуляція активності ферментів у лімфоцитах настає значно раніше, ніж змінюються морфологічні показники [3].
Виникнення, перебіг пухлинного росту та його агресивність залежать від порушень внутрішньоклітинних біохімічних процесів, зокрема сигнальних систем [7; 28]. Із позиції сучасної біомембранології відомо, що патогенез багатьох захворювань пов’язаний зі змінами структури та функцій біомембран, у формуванні яких значна роль належить мембранозв’язаним білкам, зокрема інтеральним АТФ-залежним транспортним системам іонів. Na+/K+-АТФаза - маркерний ензим плазматичної мембрани, що здійснює активне трансмембранне перенесення іонів Na+ та K+ і тим самим підтримує їх електрохімічні градієнти, необхідні для нормального функціонування клітини. Ця АТФаза опосередковано бере участь у регуляції експресії генів, проліферації та рості клітин [6; 7; 28]. Порушення іонного гомеостазу (перш за все натрій-калієвого) зумовлює розвиток клітинних патологій, зокрема супроводжується посиленою проліферацією клітин. Численними дослідженнями показано, що активність Na+/K+-АТФази, яка відіграє ключову роль у підтриманні внутрішньоклітинного іонного гомеостазу, осмотичного балансу клітини, трансмембранного потенціалу клітин, змінюється під впливом гормонів, факторів росту, стресу [1; 7; 11; 28].
Мета даної роботи - оцінити функціональний стан Na+/K-АТФази в лімфоцитах периферичної крові клінічно здорових і хворих на рак яєчника жінок.
Матеріал і методи досліджень
Дослідження проводили на лімфоцитах периферичної крові клінічно здорових жінок віком 20-30 років (n = 15) і жінок, хворих на рак яєчника, які перебували на стаціонарному лікуванні у Львівському регіональному онкологічному диспансері (n = 26).
Моноядерні лімфоцити периферичної крові людини виділяли з гепаринізованої свіжоотриманої крові хворих і донорів у градієнті концентрації фікол-тріумбрасту (1,08 г/см3) [10; 19]. Цілісність і життєздатність лімфоцитів, яка в усіх дослідах становила не менше 95 %, оцінювали за забарвленням трипановим синім [5; 10].
Для пермеабілізації мембран лімфоцитів периферичної крові та розкриття латентної Na+/K-АТФазної активності до суспензії лімфоцитів додавали 0,2 % сапонін. Ця методика ґрунтується на роботах, виконаних на лімфоцитах раніше [2; 5; 8; 10]. Сапонін належить до групи речовин амфіфільної природи, що здатні зв’язуватися з мембранними білками гідрофобними зв’язками, одночасно взаємодіючи полярними групами з водою. Це дає змогу молекулам детергенту розпушувати мембрану, водночас не порушуючи структуру та функцію клітини та її транспортувальних систем.
Визначення загальної АТФазної ензиматичної активності лімфоцитів проводили за +37 °С у середовищі інкубації (об’єм - 1 мл) такого складу (мМ): 30 NaCl, 120 KCl, 5 МgСl2, 1,5 АТФ, 1 ЕГТА, 1 NaNО3 (інгібітор мітохондріальної АТФази) [17], 20 HepesTris-буфер 7,4), 0,1 мкМ тапсигаргін (селективний інгібітор Са^Ц^-АТФази ендоплазматичного ретикулуму) [18]. Наявність Са2+-хелатора ЕГТА в середовищі інкубації забезпечувало зв’язування в ньому ендогенних іонів Са2 . Ензиматичну реакцію ініціювали внесенням до інкубаційного середовища аліквоти лімфоцитарної
суміші (100 мкл); кількість білка у пробі не перевищувала 50-100 мкг/мл. Тривалість інкубації - 1-15 хв. Ензиматичну реакцію зупиняли додаванням 1 мл охолодженого стоп-розчину такого складу: 1,5 M натрій ацетат, 3,7 % формальдегід, 14 % етанол, 5 % ТХО (рН = 4,3). Базальну М^-АТФазну активність лімфоцитів тестували в аналогічному середовищі інкубації, але за присутності 1 мМ оуабаїну - селективного інгібітора Na+/K+ -АТФази [2; 5; 10]. Оуабаїнчутливу Na+/K+ -ЛТФазну активність обчислювали за різницею між величиною загальної АТФазної та базальної М^2+-активності.
У дослідах контролем на неензиматичний гідроліз АТФ було стандартне середовище інкубації, яке не містило досліджуваної проби. Як контроль на кількість ендогенного неорганічного фосфору (Р) в лімфоцитарній суміші використовували суспензію лімфоцитів у фізіологічному розчині. Кількість продукту реакції Рі визначали методом W. Rathbun, V. Betlach [27] і виражали у мкмоль Р/хв-мг білка. Вміст білка у лімфоцитарній суміші визначали методом Лоурі [25].
У дослідах використовували реактиви АТФ, Hepes, Tris, оуабаїн, тапсигаргін, ЕГТА (Sigma, США). Інші використані у дослідах реактиви були вітчизняного виробництва (ч. д. а. та х. ч.).
Результати та їх обговорення
Оскільки зміни концентрації іонів Na+ у клітинах можуть характеризувати їх фізіологічний чи патологічний стан [1; 7; 20; 23], нами досліджено активність і деякі кінетичні параметри Na+/K-АТФази в лімфоцитах периферичної крові клінічно здорових жінок і хворих на рак яєчника.
Для встановлення оптимальних умов Mg2+-залежного гідролізу АТФ, який каталізується Na+/K-АТФазою лімфоцитів, досліджували динаміку накопичення продукту АТФ-гідролазної реакції. Для цього суспензію лімфоцитів інкубували у стандартному середовищі інкубації протягом різних проміжків часу (1-15 хв). Дані експериментів показали, що кінетику Na+/K-активованого, Mg2+-залежного гідролізу АТФ сапонін-перфорованими лімфоцитами відображають криві, які мають тенденцію до насичення (рис.).
Аналіз отриманих результатів дозволяє дійти висновку, що кінетика Na+/K -активованого, Mg2+-залежного гідролізу АТФ, каталізованого сапонін-перфорованими лімфоцитами, узгоджується із закономірностями реакції нульового порядку в діапазоні 0-5 хв: у цьому інтервалі часу графік залежності Рі від періоду інкубації практично лінійний. Тому у подальших експериментах тривалість інкубації лімфоцитів і, відповідно, реакції гідролізу АТФ становила 5 хв. В усьому діапазоні часу кількість вивільненого неорганічного фосфору Рі оуабаїнчутливою Na+/K-АТФазою лімфоцитів хворих на РЯ була значно нижчою порівняно з величиною у донорів.
Оскільки протягом 5 хв залежність активності Na+/K-АТФази від часу інкубації практично лінійна, можна розрахувати, що в контрольній групі (клінічно здорові жінки) у пермеабілізованих сапоніном лімфоцитах периферичної крові активність ферменту складає 6,34 ± 0,36 мкмоль Р/хв-мг білка (табл.).
У пацієнток з РЯ ця величина значно менша (4,18 ± 0,12 мкмоль Р/хв-мг білка. Можна стверджувати, що має місце достовірне зниження Na+/K-АТФазної активності лімфоцитів периферичної крові у хворих на РЯ, яке становить 34,1 %.
Зниження Na+/K-АТФазної активності сповільнює транспорт Na+ із клітини, і це спричинює зростання його концентрації у клітині та зростання співвідношення [Na¿]/[K¿]. Останнє спричинює мітогенний ефект [7; 20]. З іншого боку, порушення Na+/K-АТФазної активності лімфоцитів свідчить про зміни функціональної активності 148
імунокомпетентних клітин, що може бути зумовлено певними впливами на мембра-нозв’язаний ензим із боку інших процесів у цих клітинах, а також може опосередковуватись через інші регуляторні механізми клітини (йони Са2+, N0).
20
16
®12
Рч
—•—Ряді —□— Ряд2
ї
/г
р
/
0 5 10 15 20
Час, хв
Рис. Динаміка вивільнення неорганічного фосфору (Р) у процесі гідролізу АТФ у Ма+ІЕ-АТФазній реакції лімфоцитами периферичної крові клінічно здорових жінок (ряд 1) і хворих на рак яєчника (ряд 2)
Таблиця
Ма+ІЕ+- та Д+-АТФазні активності лімфоцитів периферичної крові хворих на рак яєчника та в контролі
Ферменти Активності ферментів
контроль(п=15) хворі до початку лікування (п = 26)
Ма+/К+-АТФаза, мкмоль Р/хвмг білка Н-АТФаза мтохондрій, мкмоль Р/хвмг білка 6,34 ± 0,36 3,61 ± 0,28 4,18 ± 0,14 2,02 ± 0,12
Наші дані погоджуються з такими, де показана позитивна кореляція між пролі-феративною активністю клітин гепатоми, аденокарциноми молочної залози, окоген-ною трансформацією епітелію в культурі клітин нирок і зростанням іонів N0+ у клітині [7; 20; 24; 26]. Крім того, при індукції експериментального раку в дистальному відділі товстої кишки інгібування N0+1К+-АТФазної активності, що спричинює зростання [N0], відбувається задовго до появи гістологічних змін [7; 20]. Д+-АТФазна активність міто-хондрій пермеабілізованих лімфоцитів периферичної крові контрольної групи складала 3,61 ± 0,28, а дослідної - 2,02 ± 0,14 мкмоль Рі/хв-мг білка, тобто знижувалась на 44,1 %.
Вивчення змін N0+/К-АТФазної активності при патологічних станах викликає значний інтерес дослідників у медико-біологічній практиці [9; 13; 14]. Результати дослідження функціональної активності N0+/К-АТФази лімфоцитів периферичної крові в клінічних дослідженнях украй обмежені, що пояснюється невеликою кількістю біологічного матеріалу, який можна виділити з крові хворих. Зокрема, показано значні порушення механізмів оуабаїнчутливого та оуабаїнрезистентного транспортування моновалентних іонів при багатьох психічних порушеннях [9; 16]. Виявлено достовірне зниження активності N0+/К-АТФази еритроцитів у хворих із миготливою аритмією, шлуночковою та надшлуночковою екстрасистолією, гіпертонією [14]; має місце порушення механізмів роботи N0+/К-АТФази і при інших серцево-судинних захворюваннях. Зниження ензиматичної активності N0+/К-АТФази клітин печінки та головного
мозку має місце у хворих за тривалої дії етанолу [4]. Виявлено значні зміни функціональної активності Ша+/К+ -АТФази лімфоцитів у пацієнтів із маніакально-депресивним психозом [16]. Показано зниження активності базальної АТФази мембран лімфоцитів при лімфомі Ходжкіна [12].
Щодо Н-АТФази, то вона функціонує і як АТФ-синтаза, забезпечуючи спряження в мітохондріях фосфорилювання АДФ із реакціями дихального ланцюга. Пригнічення роботи даної АТФази викликає енергодефіцит у клітині.
Висновки
Виявлено достовірне зниження Ша+/К- та Н-АТФазних активностей у лімфоцитах периферичної крові хворих на рак яєчника на 34,1 та 44,1 % порівняно з практично здоровими донорами. Визначення АТФазних активностей лімфоцитів периферичної крові дає якісну інформаційну оцінку функціонування імунокомпетент-них клітин. її співставлення з іншими фізіологічними та біохімічними характеристиками може мати значення у з’ясуванні механізмів розвитку раку яєчника.
Бібліографічні посилання
1. Болдырев А. А. Ыа+,К+-АТФаза - свойства и биологическая роль // Соросовский образовательный журн. - 1998. - № 4. - С. 2-9.
2. Воробець Д. З. Неплідність та еректильна дисфункція чоловіків: біохімічні та клінічні аспекти / Д. З. Воробець, Н. С. Кочешкова. - Тернопіль : Укрмедкнига, 2008. - 204 с.
3. Давтян Т. К. О взаимоотношении иммунного и адаптивного ответов / Т. К. Давтян, Л. А. Аванесян // Успехи соврем. биол. - 2001. - Т. 121, № 3. - С. 275-286.
4. Дереча Л. М. Стан біологічних мембран та вміст макро- і мікроелементів в організмі тварин і людини при дії етанолу: Автореф. дис. ... канд. біол. наук. - Харків : Харківський держ. мед. ун-т, 2006. - 21 с.
5. Дія квамателу та трензепіну на активність транспортних АТФаз лімфоцитів периферичної крові / О. В. Кімакович, Н. О. Підковка, З. Д Воробець // Практична медицина. - 2004. - Т. 10, № 2. - С. 86-89.
6. Долговременная регуляция Ыа+,К+-насоса в лимфоцитах человека: роль ІАКЗТАТ- и МАР-киназних сигнальных путей / И. А. Карицкая, Н. Д. Аксенов, И. О. Васильева и др. // Цитология. - 2008. - Т. 50, № 4. - С. 329-337.
7. Изоферменты Ыа+,К+-АТРазы и Са+АТРазы в злокачественных образованиях / А. А. Капля, С. В. Хижняк, А. Г. Кудрявцева и др. // Укр. біохім. журн. - 2006. - Т. 78, № 1. - С. 29-42.
8. Кочешкова Н. С. Вплив інгібіторів на Са+залежні та Са+незалежні АТФазні системи сперматозоїдів / Н. С. Кочешкова, З. Д. Воробець, Л. П. Оліферчук // Світ медицини та біології. -
2007. - № 3. - С. 65-70.
9. Мороз О. М. Про доцільність дослідження властивостей еритроцитних йон-транспортуючих систем у психіатрії / О. М. Мороз, І. Й. Влох // Матер. VIII Конгресу світової федерації українських лікарських товариств. - Львів - Трускавець, 2000. - С. 285.
10. Підковка Н. О. Дослідження деяких властивостей АТФаз у лімфоцитах крові людини / Н. О. Підковка, З. Д Воробець, А. Б. Зіменковський // Експерим. та клін. фізіол. і біохім. -2002. - Т. 7, № 1. - С. 38-41.
11. Федорова М. З. Метод комплексного исследования геометрии, площади поверхности, резервных возможностей мембраны и осморегуляции лейкоцитов крови / М. З. Федорова, В. Н. Левин // Клин. лаб. диагностика. - 1997. - № 11. - С. 44-46.
12. Характер липид-белковых взаимоотношений в мембранах лимфоцитов при лимфоме Ходжкина / П. А. Казарян, С. С. Дагбашян, А. А. Пепанян, А. А. Асоян // Онкогематология. -
2008. - Т. 10, № 3.
13. Шкаволяк А. В. Дослідження Na-транспортуючих систем в діагностиці іонних мембранопа-тій (Огляд) / А. В. Шкаволяк, Н. М. Гринчишин // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2000. - № 4. - С. 63-66.
14. Шумова Н. В. Натрійуретичний гормон та калій-натрієвий обмін при порушеннях ритму серця у хворих на хронічну ішемічну хворобу серця: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. -2002. - 19 с.
15. Abdollahi T. Potential for TRAIL as a therapeutic agent in ovarian cancer // Vitam. Horm. - 2004. -Vol. 67. - P. 347-364.
16. Altered in vitro adaptive responses of lymphocyte Na+ K+-ATPase in patients with manic depressive psychosis / J. Wood, C. E. Smith, E. E. Clarke et al. // J. Affective Disorders. - 1991. - Vol. 21, is. 3. - P. 199-206.
17. ATP synthesis by FoFj-ATP-synthase independent of noncatalytic nucleotide binding sites and insensitive to azide inhibition / D. Bald, T. Amano, E. Muneyuki et al. // J. Biol. Chem - 1998. -Vol. 273, N 2. - P. 865-870.
18. Bassani R. A. Inhibition of the sarcoplasmic reticulum Ca2+ pump with thapsigargin to estimate the contribution of Na+-Ca2+ exchange to ventricular myocyte relaxation / R. A. Bassani, J. W. Bassani // Braz. J. Med. Biol. Res. - 2003. - Vol. 36, N 12. - P. 1717-1723.
19. Boyum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood // Scand. J. Clin. Lab. Invest. - 1968. - Vol. 21, Suppl. 97. - P. 77-79.
20. Correlation of malignancy with the intracellular Na+:K+ ratio in human thyroid tumors / I. Nagy, G. Lustyik, G. Lukacs et al. // Cancer Res. - 1983. - Vol. 43. - P. 5395-5402.
21. Davies R. J. Inhibition of the Na+,K+-ATPase pump during induction of experimental colon cancer / R. J. Davies, G. I. Sandle, S. M. Thompson // Cancer Biochem. Biophis. - 1991. - Vol. 12, N 2. -P. 81-94.
22. Global cancer statistics, 2002 / D. M. Parkin, F. Bray, J. Ferlay, P. Pisani // CA Cancer J. Clin. -2005. - Vol. 55. - P. 74-108.
23. Na effects on mitochondrial respiration and oxidative phosphorylation in diabetic hearts / A. Babsky, Nic. Doliba, Nat. Doliba et al. // Experimental Biology and Medicine. - 2001. - Vol. 226, N 6. -P. 543-551.
24. Na-Æ-ATPase regulates tight junction permeability throught occluding phosphorylation in pancreatic epithelial cells / S. A. Rajasekaran, S. P. Barwe, G. Gopal et al. // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver. Physiol. - 2007. - Vol. 292, N 1. - P. 124-133.
25. Protein measurement with the Folin phenolreagent / O. H. Lowry, N. J., A. L. Farr et al. // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol. 193. - P. 265-275.
26. Rajasekaran S. A. Na,K-ATPase and epithelial tight junctions / S. A. Rajasekaran, A. K. Rajasekaran // Front Biosci. - 2009. - Vol. 14. - P. 2130-2148.
27. Rathbun W. Estimation of enzymically produced orthophosphate in the presence of cysteine and adenosine triphosphate / W. Rathbun, V. Betlach // Anal. Biochem. - 1969. - Vol. 28. - P. 436-447.
28. Xie Z. Na+/K+-ATPase as a signal transducer / Z. Xie, A. Askari // Eur. J. Biochem. - 2002. -Vol. 269. - P. 2434-2439.
Надійшла до редколегії 26.03.2012
