CC BY
288
Пролиферативная активность и клеточный цикл лимфоцитов периферической крови (ЛПК) человека в отдалённые сроки после хронического радиационного воздействия
Маркина Т.Н., Аклеев А.В., Веремеева Г.А.
Федеральное государственное учреждение науки Уральский научно-практический центр радиационной медицины Федерального медико-биологического агентства, Челябинск
Сверочные точки клеточного цикла осуществляют контроль генетической стабильности клетки. Воздействие ионизирующей радиации приводит к задержке клеточного цикла и снижению пролиферативной активности облучённых клеток, имеющих разнообразные повреждения ДНК. Ранее в экспериментах на животных при хроническом облучении в диапазоне доз 0,01-
0,5 Гр/сут выявлено угнетение гемопоэза, изменение продолжительности клеточного цикла и пролиферации кроветворных клеток. В настоящей работе отмечено увеличение количества ЛПК с задержкой клеточного цикла у людей в отдалённые сроки (спустя 60 лет) после начала хронического радиационного воздействия (средняя накопленная доза облучения красного костного мозга составила 1,15 Гр). Предполагается, что наблюдаемый эффект может быть связан с нестабильностью генома стволовых кроветворных клеток (СКК). В отдалённые сроки у облучённых людей также отмечено повышение числа пролиферирующих ЛПК.
Ключевые слова: хроническое облучение, пролиферация, клеточный цикл.
В поддержании клеточного гомеостаза определяющую роль играют процессы деления и гибели клеток. Деление клетки контролируется высоко скоординированными механизмами, включающими сверочные точки клеточного цикла [17, 19]. Сверочные точки клеточного цикла осуществляют регуляцию клеточного деления, не допуская пролиферации клеток с поломками ДНК, тем самым контролируют генетическую стабильность. Репарационные процессы, сопряжённые с клеточным циклом (оба процесса р53-зависимые), являются более эффективными при формировании блока клеточного цикла [11, 12, 17].
Основной причиной радиационно-индуцированной задержки клеточного цикла являются двунитевые разрывы (ДНР) ДНК. Параметры клеточного цикла и снижение пролиферации клеток хорошо изучены при остром радиационном воздействии [2, 11, 19]. Влияние хронического радиационного воздействия с низкой мощностью дозы на пролиферацию и клеточный цикл недостаточно изучены. В доступной литературе нет данных о влиянии хронического облучения на сверочные точки клеточного цикла у человека. В экспериментах на мелких лабораторных животных при хроническом у-облучении (0,01-0,5 Гр) выявлено угнетение гемопоэза как в ранние, так и в отдалённые сроки (при больших дозах) [7]. В ранний период в пуле кроветворных клеток красного костного мозга (ККМ) наблюдалось дозозависимое изменение митотического цикла клеток и их пролиферативной активности. Изменение клеточного цикла гранулоцитарных клеток ККМ, как правило, было связано с укорочением времени генерации клеток на 25-35 %. Сокращение продолжительности клеточного цикла происходило, главным образом, за счёт укорочения G1- и S-фаз. В ранние сроки хронического облучения мышей также отмечалось увеличение пролиферативной активности КОЕс и коммитированных предшественников гранулоцитов [7].
Маркина Т.Н.* - мл. научн. сотр.; Аклеев А.В. - д.м.н., профессор, директор; Веремеева Г.А. - научн. сотр., к.б.н. ФГУН УНПЦРМ ФМБА России.
‘Контакты: 454076, Челябинск, ул. Воровского, 68-А. Тел.: (351) 232-79-14; e-mail: tatyana-np@mail.ru.
Анализ данных, полученных при длительном наблюдении за жителями прибрежных сёл р. Теча, подвергшихся хроническому низкоинтенсивному облучению, выявил угнетение гемопо-эза у отдельных лиц в ранние сроки облучения. Наличие стойких выраженных изменений в ге-мопоэзе (цитопения, гипоплазия костного мозга) в сочетании с неврологическими и иммунологическими изменениями позволило диагностировать у лиц, облучённых в дозе 0,7 Гр и более, хроническую лучевую болезнь (ХЛБ). Гибель и задержка дифференцировки гранулоцитарных предшественников на ранних этапах облучения людей были главными причинами ранней лейкопении. По результатам текущих медицинских осмотров у 8 % облучённых жителей прибрежных сёл р. Теча, лейкопения регистрируется и в настоящие время (через 60 лет от начала облучения) [1, 6].
Кроме того, в отдалённые сроки у облучённых людей, проживающих в прибрежных сёлах р. Теча, сохраняется повышенная частота мутаций в гене Т-клеточного рецептора (ТОЯ) [5], а также нестабильных (дицентриков, кольцевых хромосом) и стабильных хромосомных аберраций (транслокаций) [6].
Представлялось интересным оценить особенности клеточного цикла у жителей прибрежных сёл р. Теча в период формирования отдалённых цитопений, когда мощность дозы облучения не превышала допустимой. Единичные экспериментальные данные указывают на снижение пролиферативной активности Т-лимфоцитов мышей в отдалённый период хронического облучения в малых дозах [2].
Таким образом, цель данного исследования - оценить состояние клеточного цикла и пролиферацию лимфоцитов периферической крови человека в отдалённые сроки после хронического радиационного воздействия.
Методы исследования
В результате сброса отходов радиохимического производства ПО «Маяк» в речную систему Теча-Исеть-Тобол с 1950 по 1956 гг., население прибрежных сёл р. Теча (более 30 тыс. человек) подверглось облучению в широком диапазоне доз (максимальная доза облучения ККМ в соответствии с TRDS-2009 достигала 9 Гр) [8]. Наибольшая мощность дозы наблюдалась в первые 6 лет, при этом максимальная эквивалентная доза комбинированного внешнего и внутреннего облучения ККМ достигала 0,4-0,5 Зв/год в сёлах верхнего течения р. Теча. Около 87 % накопленной дозы внутреннего облучения приходилось на долю остеотропного 9^г [5]. Данный факт позволяет рассматривать костную ткань и ККМ в качестве органов-мишеней радиационного воздействия у жителей прибрежных сёл р. Теча.
Состояние клеточного цикла и пролиферативную активность ЛПК оценивали у 136 жителей прибрежных сёл р. Теча, подвергшихся хроническому облучению. Контрольную группу составили 59 человек, проживающих на незагрязнённых территориях и имеющих нормальный клеточный состав крови. Средняя накопленная доза на ККМ в группе облучённых лиц составила 1,15 Гр (максимальные индивидуальные значения достигали 4,46 Гр). Средний возраст в сравниваемых группах, на время обследования, составил 68,8 лет. Группы были сходны по национальному составу и полу. Из исследования исключались лица, принимавшие антибиотики, цитостатики, проходившие рентгеновское обследование в течение последних 6 месяцев. Среди обследованных облучённых людей были выделены 2 подгруппы жителей, которые имели изменения со стороны гемопоэза в ранний и отдалённый периоды от начала облучения (группа лю-
дей, перенесших ХЛБ и группа облучённых людей с лейкопенией). Группа людей, перенесших ХЛБ, включала 31 человека, а группа людей с отдалённой лейкопенией - 30 человек. Критерием отбора людей с лейкопенией было устойчивое снижение абсолютного количества лейкоцитов периферической крови - менее 4,0х109/л.
Объектом исследования были выбраны ЛПК. Это обусловлено доступностью материала, высокой концентрацией клеток (106/л) в периферической крови, синхронностью фаз клеточного цикла (клетки находятся в 00-фазе), а также степенью радиочувствительности, близкой к радиочувствительности стволовых кроветворных клеток (СКК) [9]. ЛПК выделяли по стандартной методике на градиенте фиколл-урографина [10]. Полученную суспензию клеток делили на 5 равных частей, 2 из которых были предназначены для оценки спонтанного (исходного) уровня пролиферирующих клеток и клеток с задержкой клеточного цикла. Следующие 3 части предназначались для анализа исследуемых параметров после инкубации культуры ЛПК. Клетки инкубировали по стандартной методике [3] в культуральной среде с добавлением ФГА. Для оценки пролиферативной активности клеток (доли/процент/ клеток, ответивших на митогенный стимул), культуру лимфоцитов инкубировали при 37 °С 42 часа [20]. Для выявления клеток с задержкой клеточного цикла в сверочной точке G1/S, культуру лимфоцитов инкубировали при 37 °С 24 часа. Еще одну пробирку с культурой ЛПК культивировали 22 часа [20], затем подвергали у-облу-чению в дозе 1 Гр, и снова инкубировали еще 2 часа для накопления клеток с задержкой клеточного цикла.
Для оценки пролиферативной активности лимфоцитов периферической крови использовали маркер пролиферации - белок ki-67 [14, 16]. По литературным данным, большинство клеток, подвергшихся воздействию у-излучения, останавливаются в G1- или 02-фазе [17, 19]. Поэтому для исследования клеточного цикла была выбрана первая сверочная точка G1/S, маркером активации которой является белок Chk2 [11, 12, 17, 19].
Белки (ki-67 и Chk2) окрашивали по методике иммунофлюоресцентного окрашивания внутриклеточных белков [14] с применением FITC-меченных моноклональных антител anti-Chk2 (Beckton Dickenson, США) и anti-ki-67 (Beckton Dickenson, США). Анализ проводили на проточном цитофлуориметре серии EPICS XL-MCL (аргоновый лазер 488 нм мощностью 15 мВт). Статистический анализ результатов проводили с использованием пакета программ «Micrsoft Excel» и «Statistica 6.0».
Результаты исследования
Исследование пролиферативной активности ЛПК облучённых людей. Анализ пролиферативной активности ЛПК показал (табл. 1), что в отдалённые сроки от начала облучения у лиц, подвергшихся воздействию ионизирующей радиации, исходный уровень пролиферирующих ЛПК в среднем составил 2,86 %. В группе сравнения данный показатель был равен 2,32 %. Полученные значения пролиферирующих клеток соответствовали описанной в литературных источниках норме [16]. В группе облучённых лиц, перенесших ХЛБ, доля пролиферирующих клеток была выше значений контроля (3,68 %), но не достигала статистической значимости. Тогда как у облучённых людей с лейкопенией доля пролиферирующих клеток была достоверно выше контроля - 4,20 % (p=0,02).
Таблица 1
Доля (%) лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих белок №-67, у облучённых и необлучённых людей
Группы Спонтанный уровень Инкубация 42 часа
М±т М±т
Облучённые люди 2,81±0,33 12,82±0,90
п=88 (0,08-12,62) (2,56-39,82)
Люди, перенесшие ХЛБ 3,68±0,90 13,65±2,51
п=22 (0,22-12,12) (2,56-36,60)
Облучённые люди с лейкопенией 4,20±0,70 15,14±2,0
п=25 (0,08-12,65) (4,08-37,46)
р=0,02 р=0,1
Контроль (необлучённые люди) 2,32±0,65 10,83±1,71
п=20 (0,05-11,83) (0,94-26,42)
Примечание: р - различия с контролем.
После инкубации культуры лимфоцитов с митогеном (ФГА) доля пролиферирующих лимфоцитов увеличилась во всех изучаемых группах. Так, у облучённых людей доля пролиферирующих лимфоцитов составила 12,82 %, а в группе сравнения - 10,83 %. Несмотря на увеличение доли пролиферирующих клеток у людей, перенесших ХЛБ (13,65 %), по сравнению с контролем (10,83 %), достоверных различий отмечено не было. Только у людей с лейкопенией наблюдалась тенденция к увеличению доли пролиферирующих клеток (15,14 %, р=0,1) по сравнению с контролем.
Исследование клеточного цикла облучённых людей. Анализ уровня ЛПК, экспрессирующих белок ОИк2, выявил увеличение доли клеток с блоком клеточного цикла у облучённых людей (0,75 %, р=0,02) по сравнению с контролем (0,40 %). Еще более высокий процент таких клеток был отмечен у облучённых лиц с лейкопенией (1,06 %, р=0,01). Несмотря на превышение доли клеток с блоком клеточного цикла у людей, перенесших ХЛБ (0,71 %), при сравнении с группой контроля достоверных различий не отмечено. Результаты исследования представлены в таблице 2.
Таблица 2
Доля (%) лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих белок СИк2, у облучённых и необлучённых людей
Исследуемые группы Исходный уровень Инкубация 24 ч Инкубация 22 ч + облучение + инкубация 2 ч
М±т М±т М±т
Облучённые люди 0,75±0,09 2,87±0,43 3,08±0,28
п=136 (0-6,37) р=0,02 (0,27-17,80) (0,14-16,75)
Люди, перенесшие ХЛБ 0,71±0,20 2,90±0,51 2,82±0,42
п=31 (0,03-5,42) (0,36-11,36) (0,14-9,64)
Облучённые люди 1,06±0,23 4,12±0,75 2,94±0,56
с лейкопенией п=30 (0,04-5,82) р=0,01 (0,29-17,0) (0,54-11,38)
Контроль 0,40±0,05 3,19±0,48 3,36±0,52
(необлучённые люди) п=59 (0-1,65) (0,15-13,12) (0,22-15,84)
Примечание: р - различия с контролем.
После стимуляции клеток к делению и инкубации отмечено увеличение количества клеток с блоком G1/S в среднем на 2,5 %, но достоверных различий при сравнении всех групп облучённых людей (перенесших ХЛБ и имеющих лейкопению) с группой контроля получено не было. Аналогично, не выявлено различий между группами облучённых людей (перенесших ХЛБ и имеющих лейкопению) и контрольной группой после стандартного дополнительного у-облуче-ния культуры лимфоцитов в дозе 1 Г р.
Проведённый статистический анализ зависимости «доза-эффект» как у облучённых людей с лейкопенией и перенесших ХЛБ, так и у облучённых лиц с нормальными показателями крови, не выявил линейной зависимости между дозой облучения ККМ и изучаемыми параметрами.
Зависимость абсолютного количества лейкоцитов периферической крови облучённых людей от пролиферативной активности и состояния клеточного цикла. Проведённый корреляционный анализ не выявил зависимости между абсолютным количеством лейкоцитов периферической крови и абсолютным количеством спонтанно пролиферирующих лимфоцитов в группе всех облучённых лиц (г=0,006; p=0,9). Отмечена положительная линейная зависимость между абсолютным количеством лейкоцитов периферической крови у облучённых людей и абсолютным количеством пролиферирующих лимфоцитов после их инкубации с ФГА (г=0,25; p=0,02) (рис. 1).
§
Абсолютное количество пролиферирующих ЛПК (109/л) после инкубации с ФГА
Рис. 1. Зависимость абсолютного количества лейкоцитов периферической крови облучённых людей в отдалённый период (от начала облучения) от абсолютного количества пролиферирующих ЛПК (109/л) после инкубации с ФГА.
У людей с лейкопенией корреляционный анализ не выявил зависимости абсолютного количества лейкоцитов от абсолютного количества пролиферирующих лимфоцитов (г=0,3; p=0,2). Также не обнаружено зависимости между абсолютным количеством пролиферирующих лимфоцитов и абсолютным количеством лейкоцитов периферической крови облучённых людей, перенесших ХЛБ (г=0,4; p=0,2).
Корреляционный анализ также не позволил отметить зависимости абсолютного количества лейкоцитов периферической крови от абсолютного количества ЛПК с задержкой клеточного цикла у всех облучённых людей (r=0,06; p=0,4), у лиц, перенесших ХЛБ (r=0,1; p=0,5), и у облучённых людей с лейкопенией (r=0,1; p=0,6).
Обсуждение
Исследование ЛПК, экспрессирующих белок Chk2, у облучённых людей в отдалённый период от начала воздействия ионизирующего излучения, позволило отметить увеличение доли клеток с блоком клеточного цикла, которое, вероятно, является результатом повреждения ДНК. Наибольшее количество клеток с задержкой клеточного цикла наблюдалось у людей с отдалённой лейкопенией.
Увеличение доли клеток с повреждением ДНК (оцененное по уровню белка Chk2) у облучённых людей в отдалённый период после начала облучения может свидетельствовать о нестабильности генома кроветворных клеток, включая СКК. Это предположение подтверждается данными in vitro, полученными в культурах клеток, свидетельствующими о радиационно-индуцированной нестабильности генома, возникающей у потомков облучённых клеток в отдалённые сроки после радиационного воздействия [4, 15]. В пользу этого предположения свидетельствуют ранее полученные результаты по оценке уровня нестабильных геномных мутации и хромосомных аберраций у хронически облучённых жителей прибрежных сёл р. Теча. Как отмечалось выше, в этих исследованиях было показано увеличение уровня мутаций в гене Тр53 [5], соматических мутаций (TCR) [5], хромосомных аберраций [6] у облучённых людей в отдалённый период от начала облучения.
Несмотря на достоверное увеличение доли клеток с блоком клеточного цикла (исходном уровне) у облучённых людей, после митогенной стимуляции культуры лимфоцитов и мито-генной стимуляции совместно с облучением, доля клеток с блоком G1/S оставалась на уровне контрольных значений. Данный факт позволяет сделать заключение о нормализации процессов репарации у облучённых людей.
Исследование пролиферативной активности ЛПК облучённых людей в отдалённые сроки от начала облучения не выявило количественных изменений пролиферирующих клеток при сравнении со значениями у необлучённых людей. Однако значимое увеличение доли пролиферирующих ЛПК было отмечено у облучённых людей с лейкопенией. Тенденция к увеличению клеток, экспрессирующих белок ki-67, у облучённых людей с лейкопенией сохранилась после инкубации культуры лимфоцитов с ФГА. Вероятно, увеличение доли пролиферирующих кроветворных клеток обусловлено компенсаторными реакциями организма в ответ на снижение количества форменных элементов крови.
Обнаружена зависимость между абсолютным количеством лейкоцитов периферической крови облучённых людей и абсолютным количеством клеток, ответивших на митогенную стимуляцию делением (пролиферативный потенциал). Этот факт позволяет предположить, что абсолютное количество лейкоцитов крови у хронически облучённых людей зависит от пролиферативного потенциала СКК. Однако, у людей с лейкопенией такой зависимости не наблюдалось,
что позволяет предположить снижение пролиферативного потенциала кроветворных клеток у этих лиц.
Проведённый статистический анализ зависимости «доза-эффект» у облучённых людей с отдалённой лейкопенией, и у людей, перенесших ХЛБ, а также у облучённых людей с нормальными показателями крови не выявил корреляции между дозой облучения ККМ и изучаемыми параметрами.
Таким образом, данные, полученные в результате проведённого исследования, позволяют предположить, что увеличение доли клеток с блоком клеточного цикла и их элиминация могут быть одной из причин развития лейкопении (вследствие возникающего дефицита клеток). Также увеличение пролиферативной активности ЛПК повышает вероятность малигнизации клеток и, как следствие, повышает риск развития лейкозов.
Выводы
1. В отдалённые сроки после хронического радиационного воздействия у облучённых жителей прибрежных сёл р. Теча (средняя накопленная доза облучения ККМ составила 1,15 Гр) выявлено увеличение относительного количества лимфоцитов периферической крови с задержкой клеточного цикла на стадии G1/S.
2. Наибольшее увеличение относительного количества лимфоцитов периферической крови с задержкой клеточного цикла отмечено у облучённых людей с лейкопенией в отдалённые сроки после хронического радиационного воздействия.
3. У облучённых людей с лейкопенией в отдалённые сроки после хронического радиационного воздействия отмечено увеличение спонтанно пролиферирующих лимфоцитов периферической крови.
Литература
1. Аклеев А.В., Варфоломеева Т.А. Состояние гемопоэза в условиях многолетнего облучения костного
мозга у жителей прибрежных сёл р. Теча //Радиационная биология. Радиоэкология. 2007. Т. 47, № 3.
С. 307-321.
2. Жербин Е.А., Чухловин А.Б. Радиационная гематология. М.: Медицина, 1989. 176 с.
3. Клаус Д. Лимфоциты. Методы. М.: Мир, 1990. 377 с.
4. Мазурик В.К., Михайлов В.Ф. Радиационно-индуцируемая нестабильность генома: феномен, молекулярные механизмы, патогенетическое значение //Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. Т. 41, № 3. С. 272-289.
5. Медико-биологические и экологические последствия радиоактивного загрязнения реки Теча /Под ред. А.В.Аклеева, М.Ф.Киселева. М., 2001. 532 с.
6. Медико-биологические эффекты хронического радиационного воздействия /Под. ред. А.В.Аклеева. Челябинск: Изд-во Фрегат, 2005. Т. 1. 380 с.
7. Муксинова К.Н., Мушкачева Г.С. Клеточные и молекулярные основы перестройки кроветворения при длительном радиационном воздействии /Под. ред. А.К.Гуськовой. М.: Энергоатомиздат, 1990. 153 с.
8. Ретроспективная оценка и мониторинг индивидуальных доз внутреннего облучения от долгоживущих радионуклидов у населения Уральского региона. Ретроспективная оценка поступления 90Sr и 137Cs в организм жителей прибрежных сёл реки Теча. Отчет НИР /УНПЦРМ; Инв. № 293. Челябинск, 2009. 70 с.
9. Севанькаев А.В. Дозовая зависимость выхода аберраций хромосом в культуре лимфоцитов человека после у-облучения в высоких дозах //Радиобиология. 1984. Т. 24, № 6. С. 67-69.
10. Хейфец Л.Б., Абалакин В.А. Разделение форменных элементов крови человека в градиенте плотности верографин-фиколл //Лабораторное дело. 1973. № 10. С. 579-581.
11. Bartek J., Lukas J. Chk1 and Chk2 kinases in checkpoint control and cancer //Cancer cell. 2003. N. 3. P. 421-429.
12. Chu-Xia Deng. Survey and summary BRCA1: cell cycle checkpoint, genetic instability, DNA damage response and cancer evolution //Nucleic Acids Research. 2006. V. 34. P. 1416-1426.
13. Kadhim M.A., Lorimore S.A., Hepburn M.D. et al. Alpha-particle-induced chromosomal instability in human bone marrow cells //Lancet. 1994. V. 344. P. 987-988.
14. Kubbutat M.H., Key G., Duchrow M., Schluter C., Flad H.D., Gerdes J. Epitope analysis of antibodies recognising the cell proliferation associated nuclear antigen previously defined by the antibody Ki-67 (Ki-67 protein) //J. Clin. Pathol. 1994. V. 47, N 6. P. 524-528.
15. Little J.B. Radiation-induced genomic instability //Int. J. Radiat. Biol. 1998. V. 74, N 6. P. 663-671.
16. Lopez F., Belloc F., Lacombe F., Dumain P., Reiffers J., Bernard P., Boisseau M.R. Modalities of synthesis of Ki67 antigen during the stimulation of lymphocytes //Cytometry. 1991. V.12. P. 42-49.
17. Nyberg K.A., Michelson Rh.J., Putnam C.W., Weinert T.A. Toward maintaining the genome: DNA Damage and Replication Checkpoints //Annual Review of Genetics. 2002. V. 36. P. 617-656.
18. Prussin C., Metcalfe D. Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directry conjugated anti-cytokine antibodies //Immunol. Meth. 1995. N 188. P. 117-128.
19. Zhou B.B., Elledge S.J. The DNA damage response: putting checkpoints in perspective //Nature. 2000. N 408. P. 433-439.
20. IAEA. International Atomic Energy Agency Technical Reports Series No. 405.Cytogenetic Analysis for Radiation Dose Assessment: A Manual. 2001. P. 10-12.
Proliferative activity and cell cycle of peripheral blood lymphocytes (PBL) at late time after chronic radiation exposure in man
Markina T.N., Akleyev A.V., Veremeyeva G.A.
Federal State Institution of Science Urals Research Center for Radiation Medicine of the Federal Medical-Biological Agency (FSIS URCRM FMBA of Russia), Chelyabinsk
Cell cycle check-points exert control over the cell’s genetic stability. Exposure to ionizing radiation leads to a delay in cell cycle and reduction in proliferative activity of irradiated cells with various DNA injuries. Previous studies on animals involving chronic exposure in the range of 0.01-0.5 Gy/day revealed inhibition of hemopoiesis, changes in cell cycle duration and proliferation of hemopoietic cells. The present study showed an increase in the number of peripheral blood leucocytes with delayed cell cycle in exposed persons 60 years after the onset of chronic exposure (average cumulative dose to red bone marrow was 1.15 Gy). It is assumed that the effect observed can be associated with genomic instability of hemopoietic stem cells (HSC). Increased numbers of proliferating PBL were also noted in exposed individuals at late time after radiation exposure.
Key words: chronic exposure, proliferation, cell cycle.
Markina T.N.* - Researcher; Akleyev A.V. - MD, Prof., Director; Veremeyeva G.A. - Research Assistant, C. Sci., Biol. FSIS URCRM FMBA of Russia.
‘Contacts: Russia, 454076, Chelyabinsk, Vorovsky St., 68^. Tel.: (351) 232-79-14; e-mail: tatyana-np@mail.ru.
