CC BY
72
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК 577.3 ББК (Е)28.707.1
Аклеев Александр Васильевич доктор медицинских наук, профессор г. Челябинск Akleev Alexander Vasilievich Doctor of Medical Sciences, Professor Chelyabinsk Пушкарёв Сергей Анатольевич аспирант г. Челябинск Puschkaryov Sergey Anatolievich Post-graduate Chelyabinsk
Роль апоптоза и репарации ДНК в формировании адаптивного ответа у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию Role of Apoptosis and DNA Repair in the Adaptive Response Forming of the Individuals Experienced Chronic Radiation Influence
Используя метод ДНК комет и микроядерный тест, оценивали степень фрагментации ДНК лимфоцитов периферической крови людей, подвергшихся хроническому облучению в результате радиоактивного загрязнения р. Теча. Показано, что случаи повышения радиочувствительности в группе облучённых лиц регистрируются реже, чем в контрольной группе. Выдвинуто предположение о связи такого отклонения со снижением уровня апоптоза под влиянием хронического облучения.
Using Comet assay method and micronucleus test a degree ofDNA fragmentation was estimated in peripheral blood lymphocytes of the individuals experienced chronic
radiation influence as a result of radioactive contamination of the Techa River. It was shown, that the number of cases of induced radiosensitivity in the group of exposed people is larger than the number of such cases in the control group. The interrelation between such deviation and a decreased level of apoptotic cell death was supposed.
Ключевые слова: хроническое облучение, адаптивный ответ, разрывы ДНК, апоптоз.
Key words: chronic radiation treatment, adaptive response, DNA strand breaks, apoptosis.
В настоящее время проблема влияния хронического воздействия низкоинтенсивного излучения, особенно в диапазоне малых доз, на организм человека является особенно актуальной [2]. Открытие таких эффектов малых доз (ЭМД), как адаптивный ответ (АО) и повышение радиочувствительности (ПР) после облучения в малых дозах, эффекта свидетеля и нестабильности генома, заставляет пересмотреть патофизиологические механизмы формирования отдалённых эффектов низкоинтенсивного радиационного воздействия в малых дозах [5, 12]. Предполагается, что в реализации последствий облучения и формировании отдалённых эффектов особое значение имеет состояние клеточных защитных механизмов: систем антиоксидантной защиты, репарации ДНК, регуляции клеточного цикла и апоптоза [1, 6, 7].
Целью данной работы было исследование роли процессов репарации однонитевых и двунитевых разрывов ДНК, а так же апоптоза в формировании адаптивного ответа лимфоцитов периферической крови у лиц, подвергшихся хроническому облучению, в отдалённый период после облучения.
Материалы и методы
Обследовано 50 человек. Из них 27 составили группу лиц, подвергшихся хроническому облучению, 23 - группу сравнения. Первая группа была представлена людьми, проживающими в окрестностях реки Теча, для которых была восстановлена индивидуальная доза облучения красного костного мозга (ККМ) и мягких тканей. В состав группы сравнения входили лица, проживающие на близлежащих территориях, не подвергшихся радиоактивному загрязнению и имеющие сходные социальные условия, а также уровень ме-Вестник ЧГПУ 11'2008 274
дицинского обслуживания с группой облучённых лиц. Сравниваемые группы были сопоставимы по половому (преобладали женщины), национальному (преобладало тюркское население) и возрастному составу. Средний возраст составил 68,1±1,2 года для группы облучённых людей и 69,7±1,7 года для контрольной группы. Группа облучённых лиц сопоставима с контрольной группой по качественному и количественному составу общесоматической патологии. Исследование проводилось через 57-58 лет после начала хронического облучения. Ко времени исследования средние дозы облучения ККМ и мягких тканей в группе облучённых лиц составили 0,74 ± 0,06 Гр и 0,05 ± 0,01 Гр соответственно.
Используя щелочной [14] и нейтральный [13] варианты метода ДНК-комет, оценивали уровень фрагментации ДНК, а следовательно количество одно- и двунитевых разрывов ДНК лимфоцитов периферической крови в исходной пробе, а также на различных этапах инкубации ФГА-стимулированных клеток. Критериями оценки состояния ДНК в клетке являлись длина хвоста кометы, доля мигрировавшей ДНК и интегральный показатель - момент хвоста. Для оценки эффективности репарации сопоставлялись между собой средние величины моментов хвоста после 24 ч. инкубации (или через 4 ч. после облучения в дозе 0,05 Гр), уровни непосредственно после облучения в дозе 1 Гр, а также 2 ч. и 24 ч. спустя. Апоптотическими считались кометы, доля мигрировавшей ДНК в которых превышала 40 %. Наличие у человека АО или ПР определяли по результатам микроядерного теста сравнивая уровни микроядер после облучения в дозе 1 Гр в пробе, предварительно облучённой в дозе 0,05 Гр, и в пробе, не подвергавшейся предварительному облучению. Сопоставление величин оцениваемых параметров комет, частот апоптоза и средних уровней микроядер производилось с использованием критерия Уилкоксона-Манна [3,10]. Определяя наличие у обследованного человека АО или ПР с помощью микроядерного теста, частоты клеток с микроядрами сравнивали при помощи критерия Пирсона (Хи-квадрат) [3,10]. Критерий Хи-квадрат использовался и при сопоставлении групп друг с другом по количеству случаев АО или ПР.
Результаты и обсуждение
Согласно полученным результатам, среднее количество клеток с микроядрами после облучения лимфоцитов в дозе 1 Гр в группе подвергшихся хроническому облучению лиц было повышено, по сравнению с аналогичным показателем в контроле (табл. 1).
Таблица 1
Средние количества клеток с микроядрами (на 1000 клеток) при различных вариантах облучения лимфоцитов
Группа Значение Исходный уровень Облучение 1 Гр Облучение 0,05Гр +1 Гр
Облучённые N-16 среднее 21,94 ±2,85 164,13 ± 7,44 р*=0,045 165,63 ± 8,01
о 11,64 30,38 32,70
max 48,00 224,00 217,00
min 7,00 118,00 114,00
медиана 21,5 161 168,5
Контроль N=10 среднее 15,10 ±3,06 141,20 ± 5,34 р**=0,041 157,50 ±9,47
а 9,86 17,24 30,56
max 40,00 168,00 200,00
min 4,00 114,00 87,00
медиана 13 139,5 160
р* - достоверность отличия от контрольной группы
р** _ достоверность отличия от показателя без адаптирующего облучения
Отличия от контроля по уровню микроядер отсутствуют при условии предварительного облучения клеток в дозе 0,05 Гр. При этом в группе облучённых людей не выявлено отличий между количествами клеток с микроядрами в пробе, облучённой в дозе 1 Гр, и пробе, подвергшейся такому же воздействию после предварительного облучения в дозе 0,05 Гр, тогда как в контроле предварительное облучение приводит к повышению количества клеток с микроядрами (табл. 1). Следовательно, повышенная радиочувствительность лимфоцитов периферической крови у лиц, подвергшихся хроническому облучению сочетается с отсутствием у них изменений радиочувствительности клеток под воздействием дозы 0,05 Гр. Можно предполагать, что именно с такой разницей реакции на
предварительное облучение и связано наблюдаемое в группе облучённых лиц при использовании микроядерного теста отсутствие случаев ПР (табл. 2).
Таблица 2
Реакции, выявленные с использованием микроядерного теста
Реакция Контроль N=10 Облучённые N=16
абс. % абс. %
АО 1 10,0 0 0,0
НДА 2 20,0 9 56,3
НДПР 3 30,0 7 43,8
ПР 4 40,0 0 0,0 р*=0,006
АО - адаптивный ответ; НДА - статистически недостоверный адаптивный ответ; НДПР - статистически недостоверное повышение радиочувствительности; ПР - повышение радиочувствительности; р* - достоверность отличия от контрольной группы
Особенностью обследованной группы лиц, подвергшихся хроническому облучению, является сниженный, по сравнению с аналогичным показателем в контрольной группе, исходный уровень апоптоза по критерию ДР ДНК. Сниженные уровни данного показателя отмечаются и после 24 ч. инкубации, и непосредственно после облучения в дозе 1 Гр (рис. 1).
Рис. 1. Уровни апоптоза по критерию ДР ДНК
Предположение о наличии угнетающего действия хронического облучения на способность клеток к гибели по механизму апоптоза было высказано рядом авторов, сообщавших об угнетении р53-зависимого апоптоза под влиянием хронического облучения [4, 11, 15].
Ещё одним возможным объяснением сниженного уровня апоптоза, выявленного с использованием метода ДНК-комет, может быть незавершённый характер апоптотической гибели части клеток, когда гибель клетки, начавшаяся как апоптоз, завершается гибелью по пути некроза из-за истощения энергетических ресурсов [8, 9].
Отсутствие отличий между группами по частоте апоптоза при использовании щелочного варианта метода комет может указывать на связь этих отличий с количеством комет, соответствующих терминальным стадиям апоптоза. Поскольку в случае использования щелочного варианта метода такие клетки могут выпадать из анализа [8, 9].
При использовании обоих вариантов метода достоверных отличий уровня апоптоза в клетках, подвергшихся предварительному облучению в дозе 0,05 Гр, от уровня данного показателя в клетках, не подвергавшихся предварительному облучению, не было выявлено ни в группе облучённых лиц, ни в контрольной группе. Однако, учитывая выявленное в данной работе снижение уровня апоп-тоза у лиц, подвергшихся хроническому облучению, нельзя исключить участия апоптотической гибели лимфоцитов в формировании наблюдаемых отличий между группой облучённых лиц и контролем по частоте ПР.
При анализе степени фрагментации ДНК было показано, что исходное количество ДР, а также уровни данного показателя после первых суток инкубации у подвергшихся хроническому облучению людей достоверно снижены, по сравнению с аналогичными показателями в контроле, так же, как это было отмечено и для частоты апоптоза. Отмечено, что в обеих группах имеет место увеличение количества ДР в ходе 48 ч. инкубации, наблюдаемое и в отсутствие предварительного облучения лимфоцитов, и при наличии такого воздействия. Таким же образом в ходе инкубации повышается уровень апоптоза. Сходство
этих изменений указывает на то, что увеличение количества ДР может являться следствием гибели инкубируемых клеток по механизму апоптоза. При этом не было выявлено отличий между группами по эффективности процессов репарации ДР и ОР, а также отличий по чувствительности данных процессов к влиянию предварительного облучения в дозе 0,05 Гр. Поскольку, как показали результаты исследования, величины момента хвоста, выявленные при использовании как нейтрального, так и щелочного вариантов метода комет, после 24 ч. инкубации, непосредственно после облучения в дозе 1 Гр и 2 ч. спустя не отличаются друг от друга как в группе облучённых, так и в контрольной группе, независимо от наличия предварительного воздействия на клетки в дозе 0,05 Гр.
Таким образом, существенного вклада процессов репарации одно- и дву-нитевых повреждений ДНК в формирование АО или ПР у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию на ККМ в диапазоне доз от 0,21 Гр до 1,42 Гр и мягких тканей (в диапазоне от 0,006 Гр до 0,144 Гр), выявлено не было.
Библиографический список
1. Бондарчук, И. А. Анализ роли репарации ДНК, регуляции клеточного цикла и апоптоза в радиационно-индуцированном адаптивном ответе клеток млекопитающих // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2003. - Т. 43.
- № 1. - С. 19-28.
2. Кудряшов, Ю. Б. Радиационная биофизика (ионизирующие излучения).
- М. : ФИЗМАТЛИТ. - 2004. - 448 с.
3. Лакин, Г. Ф. Биометрия. - М. : Высшая школа. - 1990. - 350 с.
4. Миль, Е. М., Мышлякова, О. В., Бурлакова, Е. Б. Р53 при низкоинтенсивных воздействиях физической и химической природы (ионизирующее излучение и антиоксидант) // Биофизика. - 2005. - Т. 50. - Вып. 1. - С. 75-79.
5. Пелевина, И. И. и др. Реакция популяции клеток на облучение в малых дозах // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2003. - Т. 43.
- № 2. - С. 161-166.
6. Пелевина, И. И. и др. Феномен повышения радиочувствительности после облучения лимфоцитов в малых адаптирующих дозах // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2000. - Т. 40. - № 5. - С. 544-548.
7. Серебряный, А. М. и др. О новом механизме формирования адаптивного ответа // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2004. - Т. 44. - № 6. - С. 653-656.
8. Тронов, В. А. и др. Механизм радиационной гибели лимфоцитов периферической крови человека, оцениваемой методом ДНК-комет // Биофизика.
- 1998. - Т. 43. - № 1. - С. 115-124.
9. Тронов, В. А. и др. ДНК-кометы как маркер клеточной гибели // Биофизика. - 1999. - Т. 44. - № 2. - С. 288-295.
10. Юнкеров, В. И., Григорьев, С. Г. Математико-статистическая обработка данных медицинских исследований. - СПб. : ВМедА, 2002. - 266 с.
11. Enns, L., Low-Dose Radiation Hypersensitivity Is Associated With p53-Dependent Apoptosis // Molecular Cancer Research. - 2004. - № 2 (10).
- P. 557-566.
12. Mothersill, C., Seymour, C., Radiation-induced bystander effects and adaptive responses - the Yin and Yang of low dose radiobiology? // Mutation research. - 2004. - V. 568. - P. 121-128.
13. Oliv, P. L., Wlode, K. D., Banath, J. P. DNA double-strand breaks measured in individual cell subjected to gell electrophoresis. // Cancer research. - 1991. -V. 51. - P. 4671-4676.
14. Singh, N. P. et al. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells // Experimental Cell Research. - 1988. - V. 175. - № 1.
- P. 184-191.
15. Takahashi, A. Preirradiation at a low dose-rate blunted p53 response // J. Radiation Research. - 2002. - V. 43. - P. 1-9.
Bibliography
1. Bondarchuk, I. A. Analysis of DNA Repair Role, Regulation of a Cellular Cycle and Apoptosis in the Radiation-Induced Adaptive Response of Mammalian Cells // Radiation Biology. Radioecology. - 2003. - V. 43. - № 1. - P. 19-28.
2. Kudryashov, Ju. B. Radiation Biophysics (Ionizing Radiations). - M. : PHISMATLIT. - 2004. - 448 p.
3. Lakin, G. F. Biometrics. - M. : Higher School. - 1990. - 350 p.
4. Mil\ E. M., Myshlyakova, O. V., Burlakova, E. B. Р53 at Low-Intensity Influences of the Physical and Chemical Nature (Ionizing Radiation and Antioxidant) // Biophysics. - 2005. - V. 50. - № 1. - P. 75-79.
5. Mothersill, C., Seymour, C., Radiation-Induced Bystander Effects and Adaptive Responses - the Yin and Yang of Low Dose Radiobiology? // Mutation Research. - 2004. - V. 568. - P. 121-128.
6. Oliv, P. L., Wlode, K. D., Banath, J. P. DNA Double-strand Breaks Measured in Individual Cell Subjected to Gell Electrophoresis. // Cancer Research. - 1991.
- V. 51. - P. 4671-4676.
7. Pelevina, I. I., et al. Reaction of Cells Population to Small Dozes Irradiation // Radiation Biology. Radioecology. - 2003. - V. 43. - № 2. - P. 161-166.
8. Pelevina, I. I., et al. The Phenomenon of Radiosensitivity Increase after Irradiation of Lymphocytes in Small Adapting Dozes // Radiation Biology. Radioecology. - 2000. - V. 40. - № 5. - P. 544-548.
9. Serebryany, A. M., et al. About the New Mechanism of Adaptive Вестник ЧГПУ 11'2008 280
Response Formation // Radiation Biology. Radioecology. - 2004. - T. 44. -№ 6. - P. 653-656.
10. Singh, N. P. et al. A Simple Technique for Quantitation of Low Levels of DNA Damage in Individual Cells // Experimental Cell Research. - 1988. - V. 175.
- № 1. - P. 184-191.
11. Takahashi, A. Preirradiation at a Low Dose-Rate Blunted P53 Response // J. Radiation Research. - 2002. - V. 43. - P. 1-9.
12. Tronov, V. A., et al. The Mechanism of Radiation Destruction of a Person's Peripheral Blood Lymphocytes estimated by Comet Assay Method // Biophisics.
- 1998. - V. 43. - № 1. - P. 115-124.
13. Tronov, V. A., et al. Comet Assay as a Marker of Cellular Destruction // Biophysics. - 1999. - V. 44. - № 2. - P. 288-295.
14. Enns, L., Low-Dose Radiation Hypersensitivity Is Associated With p53-Dependent Apoptosis // Molecular Cancer Research. - 2004. - № 2 (10).
- P. 557-566.
15. Yunkerov, V. I., Grigorev, S. G. Mathematic-Statistical Processing of Medical Research Data. - SPb. : MMedA. - 2002. - 266 p.
