CC BY
46
Д.И. Шегурова, В.В. Софронов, С.А. Любин, И.В. Маврина, 2013 УДК 616.155.32-053.31
ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ЯДЕРНОЙ ДНК ЛИМФОЦИТОВ И ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК У НОВОРОЖДЕННЫХ РАЗЛИЧНОГО ГЕСТАЦИОННОГО ВОЗРАСТА
дилнА ильдАроВнА ШЕГуроВА, канд. мед. наук, врач отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных ГАуз «Городская детская больница № 1» г. казани, тел. 8-987-281-71-56, e-mail: [email protected] ВАЛЕРИЙ ВИКТОРОВИЧ СОФРОНОВ, докт. мед. наук, профессор кафедры пропедевтики детских болезней и факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета ГБоУ впо «казанский государственный медицинский университет» минздрава россии
СЕРГЕЙ АНАТОЛЬЕВИЧ ЛЮБИН, зав. отделением реанимации и интенсивной терапии новорожденных ГАУз «Городская детская больница № 1» г. казани
ЕЛЕНА ВАСИЛЬЕВНА МАВРИНА, врач отделения патологии новорожденных ГАУз «Городская детская больница № 1» г. казани
Реферат. Статья посвящена изучению особенностей параметров ядерной и внеклеточной ДНК у новорожденных различного гестационного возраста в раннем неонатальном периоде для определения особенностей формирования адаптационных процессов и прогностической значимости. Ключевые слова: ядерная ДНК, внеклеточная ДНК, новорожденные.
PROGNOSTiC SiGNiFiCANCE OF THE NUCLEAR DNA OF LYMPHOCYTES AND EXTRACELLULAR DNA iN NEWBORNS WiTH DiFFERENT GESTATiONAL AGE
DIANA I. SHEGUROVA, VALERY V. SOFRONOV, SERGEY A. LUBIN, ELENA V. MAVRINA
Abstract. Article is devoted to studying of features of parameters of nuclear and extracellular DNA at newborns of various gestational age in the early neonatal period for determination of features of formation of adaptic processes and the prognostic importance.
Key words: nuclear DNA, extracellular DNA, newborns.
Введение. Нуклеиновые кислоты определяют характер адаптационных реакций: РНК формирует механизмы кратковременной адаптации, а ДНК — долгосрочной [1]. С учетом данного положения анализ параметров клеточной и внеклеточной ДНК позволяет определить характер адаптации у новорожденного ребенка в раннем неонатальном периоде.
Все происходящие в организме процессы отражает постоянно мигрирующий лимфоцит [2]. В одноименных структурах клеток различных систем и органов (нервная, иммунная, печень, легкие и др.) изменения развиваются стереотипно, и процесс восстановления клеточных структур после прекращения патогенного воздействия не зависит от этиологического фактора [1].
Работ, посвященных изучению ядерной ДНК и внеклеточной ДНК в педиатрической науке и практике крайне мало. Имеются единичные литературные источники, посвященные исследованию ядерной ДНК у новорожденных [3—8]. Информация, содержащаяся в них, разноречива в силу различных методических подходов с использованием рутинных (качественных и полуколичественных) методов определения нуклеиновой кислоты.
Целью исследования являлось изучение особенностей параметров ядерной и внеклеточной ДНК у новорожденных различного гестационного возраста в раннем неонатальном периоде для определения особенностей формирования адаптационных процессов и прогностичской значимости.
Материал и методы. Под наблюдением находилось 110 новорожденных детей различного гестационного возраста. Все новорожденные были разделены на 5 групп. Первую группу составили 12 новорожденных с гестационным возрастом 31 нед и менее, вторую группу — 14 новорожденных с гестационным возрастом 32—34 нед, третью группу--17 новорожденных
с гестационным возрастом 35—37 нед, четвертую группу — 51 новорожденный с гестационным возрастом 38—42 нед с различной перинатальной патологией. Пятую группу (группу сравнения) составили 16 условно здоровых доношенных новорожденных.
Перинатальная патология была представлена следующими заболеваниями: перинатальное поражение центральной нервной системы гипоксического и травматического генеза, гнойно-воспалительные заболевания, пневмопатии, конъюгационная гиперби-лирубинемия.
В качестве субстрата исследования использовалась венозная кровь новорожденных детей. Выделяли лимфоциты стандартным методом A. Boyum [9]. Исследование популяций лимфоцитов проводилось с помощью методов проточной цитофлуориметрии с использованием пропидиума йодида [10]. Концентрацию внеклеточной ДНК определяли с помощью флуоресцентной спектрофотометрии с использованием интеркалирую-щего флуоресцентного зонда Hoechst 33342.
На рис. 1 приведена типичная ДНК-гистограмма [11]. Гистограмма позволяет определить процент клеток, утративших часть ДНК (фракция в зоне с низкой
Апопт. G1 S 02M
200 400 600 800 1000 Интенсивность флуоресценции
Рис. 1. ДНК-гистограмма распределения лимфоцитов периферической крови по интенсивности флуоресценции
интенсивностью флуоресценции, слева от основного пика G1, соответствующего диплоидным клеткам), т.е. гиподиплоидных, что рассматривается как состояние апоптоза [12]. Справа от основного пика G1 (в зоне с повышенной интенсивностью флуоресценции, определяются клетки с удвоенным количеством ядерной ДНК, т.е. тетраплоидные клетки, которые находятся в состоянии пролиферации.
Концентрация внеклеточной ДНК определялась с помощью флуоресцентной спектрофотометрии. На флуоресцентном спектрофотометре Hitachi MPF-4 измерялась интенсивность флуоресценции комплекса ДНК-Hoechst. Концентрацию ДНК определяли по калибровочной кривой изменения флуоресценции в серии двукратных разведений стандартного образца (ДНК эритроцитов цыплят) в TNE-буфере (диапазон разведений от 7,8 до 125 нг/мл). При отработке методики каждый образец депротеинизировался и измерялся в 2—3 повторностях. Для исключения влияния следов
органических растворителей на уровень флуоресценции, во время первого эксперимента ставилась «холостая» проба (не содержащая плазмы крови), с которой проводились те же измерения, а затем измерялся уровень флуоресценции в присутствии Hoechst 33342. При этом в «холостой» пробе флуоресценции не наблюдалось.
Статистическая обработка результатов исследования проведена с помощью табличного редактора Microsoft Excel 2003, Statistica 6.0. Данные, подчиняющиеся закону нормального распределения, представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения. Данные, не подчиняющиеся закону нормального распределения, представляли в виде медианы и крайних значений вариационного ряда. Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием параметрических (критерий Стьюдента) и непараметрических критериев (критерии Манна—Уитни, Ван-дер-Вардена и Краскела—Уоллиса, предусмотренные для сравнения ранжированных значений, с поправкой Бон-феррони для исключения эффекта множественных сравнений). Для оценки связи между признаками применяли коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Уровень статистической значимости (р) считался меньше 0,05.
Для прогнозирования возникновения срыва адаптации и исходов рассчитывался показатель «отношения шансов» по формуле:
OR = (A/B)/(C/D) = (A*D)/(B*C),
где OR (odds ratio) — отношение шансов, А, В, С, D — число событий [13].
Результаты и их обсуждение. На рис. 2 представлены результаты изучения относительного содержания гиподиплоидных и гиперплоидных лимфоцитов у новорожденных различного гестационного возраста.
В группе сравнения, куда входили доношенные новорожденные без клинико-лабораторных признаков осложнений периода адаптации, содержание гиподиплоидных лимфоцитов составило (2,1±0,4)% [(57,8±11,2) клеток/нл)], гиперплоидных лимфоцитов (1,7±0,5)% [(57,9±19,2) клеток/нл].
Группы новорожденных
IГиподиплоидные
□ Гиперплоидные
Рис. 2. Процентное содержание гиподиплоидных и гиперплоидных лимфоцитов в периферической крови новорожденных различного гестационного возраста
Установлена нелинейная зависимость количества определенной популяции лимфоцитов от гестационного возраста.
Во II, III и IV группах новорожденных по сравнению со средними показателями содержания гиподиплоидных и гиперплоидных лимфоцитов у детей группы сравнения отмечается достоверное повышение среднего процентного и абсолютного количества гиподиплоидных лимфоцитов в периферической крови. Достоверно (р<0,01) максимальное количество лимфоцитов с гиподиплоидным содержанием ядерной ДНК наблюдались у новорожденных с гестационным возрастом 35—37 нед — (9,1 ±0,8)% [(259,0±47,1) клеток/нл]. У доношенных новорожденных с клинико-лабораторными признаками осложнений периода адаптации гиподиплоидных лимфоцитов в 2,5 раза больше по сравнению с условно здоровыми новорожденными (р<0,01).
Максимальное количество гиперплоидных лимфоцитов отмечается у новорожденных с гестационным возрастом 31 нед и менее. У новорожденных с гестационным возрастом 35—37 нед, наоборот, зафиксировано минимальное процентное и абсолютное содержание лимфоцитов с повышенным количеством ядерной ДНК (р<0,01).
Выявленная нелинейная зависимость содержания гиподиплоидных и гиперплоидных лимфоцитов от сроков гестации может служить отражением изменений интенсивности процессов апоптоза и пролиферации в различные периоды внутриутробного созревания плода: активность апоптоза постепенно нарастает с 28 нед гестации, достигая максимальных значений в период 35—37 нед, после чего, к моменту рождения, постепенно снижается, а интенсивность процессов пролиферации с максимумом в период 31 нед и менее снижается к 35—37 нед гестации и нарастает к моменту рождения.
На рис. 3 представлены результаты исследования содержания гиподиплоидных и гиперплоидных лимфоцитов в зависимости от основного заболевания. Наиболее интенсивно процессы апоптоза протекают
при наличии конъюгационной гипербилирубинемии у доношенных новорожденных и новорожденных со сроком гестации 35—37 нед. При этом варианте осложнения периода адаптации наблюдается достоверно наибольшее количество гиподиплоидных лимфоцитов (максимум зафиксирован у детей со сроком гестации 35—37 нед — (11,8±1,5)%, или [(424,2±113,8) клеток/ нл; р<0,01].
Наименьшее содержание исследуемых клеток было зафиксировано при пневмопатиях у доношенных новорожденных [(1,3±0,4)%, или (30,2±10,2) клеток/нл; р<0,01] и при гнойно-воспалительных заболеваниях у детей со сроком гестации 31 нед и менее [(1,3±0,3)%, или (47,4±11,5) клеток/нл; р<0,01]. При наличии пнев-мопатий или гнойно-воспалительных заболеваний процентное содержание лимфоцитов с гиподиплоид-ным набором ядерной ДНК достоверно повышается с увеличением гестационного возраста, достигая максимального уровня в 35—37 нед, к моменту рождения резко снижается. При перинатальном поражении центральной нервной системы количество гиподиплоидных лимфоцитов достигает максимального уровня уже в 32—34 нед гестации [(8,1±2,3)%, р<0,05].
Абсолютное количество апоптотических лимфоцитов в группе доношенных новорожденных с перинатальным поражением ЦНС [(138,9±32,9) клеток/нл] достоверно (р<0,05) выше по отношению к группе сравнения [(57,8±11,2) клеток/нл]. При пневмопатиях этот параметр имеет достоверно (р<0,01) максимальное значение [(164,9±28,6) клеток/нл] у новорожденных со сроком гестации 32—34 нед.
При гнойно-воспалительных заболеваниях самое большое абсолютное количество апоптотических лимфоцитов зафиксировано у детей с гестационным возрастом 35—37 нед [(231,9±42,1) клеток/нл; р<0,01].
У всех недоношенных новорожденных (I, II, III группы) при любом осложнении течения периода адаптации процентное количество гиперплоидных лимфоцитов возрастает по сравнению с количеством этих клеток в группе сравнения (табл. 1).
g12
■fr s
* 10
><
л
I d § 8
с
с s
9
6 -
о. а>
2
ID О
о н
о а.
с
у Группы новорожденных
IППЦНС □ Пневмопатии ■ ГВЗ □ КГБ йГр.сравн.
Рис. 3. Процентное количество гиподиплоидных лимфоцитов в периферической крови новорожденных в зависимости от гестационного возраста и основного заболевания
Содержание гиперплоидных лимфоцитов в периферической крови новорожденных различного гестационного возраста в зависимости от основного заболевания (%)
Изучаемый параметр Группа I, п=12 Группа II, п=14 Группа III, п=17 Группа IV, п=51 Группа V, п=16 Р
Группа сравнения — — — — 1,7±0,5
Перинатальное поражение центральной нервной системы 3,4±0,3 2,1±0,2 5,8±0,8 1,5±0,2 — Р2-6<0,05 Р4.6<0,01
Пневмопатии 3,4±0,5 2,2±0,4 3,4±0,6 0,9±0,2 — Р2-6<0,05 Р4.6<0,05
Гнойно-воспалительные заболевания 9,0±1,1 18,3±1,8 5,0±0,9 4,2±0,7 Р2-6<0,01 Р3-6<0,01 Р«<0,01 Р5.6<0,05
Конъюгационная гипербилирубинемия — — 0,6±0,2 1,3±0,2 — Р4-5<0,05
*р — достоверность различий с показателями группы сравнения.
В I и II группах новорожденных уровень гиперплоидных лимфоцитов резко повышен у детей с гнойно-воспалительными заболеваниями (максимальный уровень зафиксирован у новорожденных со сроком гестации 32—34 нед — [(18,3±1,8)%; р<0,01]. У детей со сроком гестации 35—37 нед самое большое содержание пролиферирующих лимфоцитов отмечалось у детей с перинатальным поражением центральной нервной системы [(5,8±0,8)%, р<0,05].
На рис. 4 представлены результаты исследования внеклеточной ДНК. В группе сравнения концентрация внеклеточной ДНК варьировала в пределах от 9,2 до 55,5 нг/мл со средним значением 22,5 нг/мл (медиана). Максимальный уровень концентрации внеклеточной ДНК (медиана 68,7 нг/мл) зафиксирован во II группе детей со сроком гестации 32—34 нед.
В каждой группе детей исследовалась зависимость концентрации внеклеточной ДНК от конкретных видов осложнений периода адаптации новорожденных (табл. 2).
Достоверных различий в концентрации внеклеточной ДНК в зависимости от перинатальной патологии в исследуемых группах с помощью используемых статистических критериев обнаружить не удалось из-за широкого варьирования индивидуальных показателей концентрации внеклеточной ДНК.
При всех видах осложнений периода адаптации уровень внеклеточной ДНК повышается по сравнению с детьми группы сравнения с максимальным значением во II группе (новорожденные с гестационным возрастом 32—34 нед).
Для прогнозирования возникновения срыва адаптации в неонатальном периоде рассчитывалось отношение шансов (табл. 3).
Согласно формуле расчета отношения шансов, получается, что у новорожденных с уровнем гиподипло-идных лимфоцитов 4% и более вероятность возникновения перинатальной патологии выше в 5,6 раз.
В первых двух группах новорожденных детей со сроками гестации 31 нед и менее и 32—34 нед можно
Рис. 4. Концентрации внеклеточной ДНК в исследуемых группах новорожденных (нг/мл, Ме)
Т а б л и ц а 3
Таблица сопряженности двух признаков — наличия срыва адаптации и процентного содержания
гиподиплоидных клеток
Концентрации внеклеточной ДНК (нг/мл, Ме) в плазме крови новорожденных детей исследуемых групп в зависимости от варианта осложнений периода адаптации
Основная перинатальная патология Группа I Группа II Группа III Группа IV Группа V
Группа сравнения 22,5
Перинатальное поражение центральной нервной системы 42,0 (38—44) 65,5 (55—120) 62,0 (60—308) 56,5 (50—426) —
Пневмопатии 54,3 (50,6—58) 81,1 (40—267) 47,1 (34,5—869) 66,0 (60—708) —
Гнойно-воспалительные заболевания 50,5 (34,4—58) 80,9 (68—326) 36,5 (30—297) 44,2 (41,4—832) —
Конъюгационная гипербилирубинемия — — 273 (55,2—1193) 154 (30,5—412) —
Процентное содержание гиподиплоидных клеток Новорожденные со срывом адаптации, чел. Новорожденные без срыва адаптации, чел.
Менее 4% А=38 В=12
Более или равно 4% С=54 D=3
выделить два вида исходов течения периода новорожденное™: благоприятный и неблагоприятный (ин-валидизация и смерть). В последних трех исследуемых группах все исходы являлись благоприятными.
Из табл. 4 следует, что у новорожденных с уровнем процентного содержания гиперплоидных лимфоцитов 3,4% и более шансы на благоприятный исход срыва адаптации больше в 2,3 раза, чем у новорожденных с содержанием гиперплоидных лимфоцитов менее 3,4%.
У недоношенных новорожденных I и II групп в зависимости от исхода были зафиксированы следующие значения относительного содержания гиподиплоидных и гиперплоидных лимфоцитов и коэффициента отношения их абсолютных содержаний (к), (табл. 5).
Как видно из табл. 5, процентное содержание гиподиплоидных лимфоцитов не влияет на исход течения периода ранней неонатальной адаптации. Их среднее значение у недоношенных детей с гестационным возрастом 34 нед и менее при любом исходе одинаково и составляет 4%. Благоприятный исход наблюдался у недоношенных, у которых уровень гиперплоидных лимфоцитов превышал норму (1,7%) более чем в полтора раза (2,8%) и коэффициент к (3,1) был больше
в 3 раза, чем у условно здоровых доношенных новорожденных (1,0).
Нами предлагается алгоритм прогнозирования течения периода ранней неонатальной адаптации (рис. 5). На рисунке представлен алгоритм прогнозирования течения периода ранней неонатальной адаптации. Согласно алгоритму, при срыве адаптации, сопровождающейся увеличением концентрации внеклеточной ДНК и повышением уровня гиподиплоидных лимфоцитов, благоприятным прогностическим критерием служит активизация пролиферации клеток — повышение уровня гиперплоидных лимфоцитов. По нашим данным, такие пациенты были более чувствительны к терапии и быстрее выздоравливали. В случае же наличия перинатальной патологии на фоне недостаточного уровня процессов пролиферации (повышение концентрации внеклеточной ДНК, гиподиплоидных лимфоцитов, снижение гиперплоидных лимфоцитов), пациенты были резистентны к проводимой терапии, заболевание быстро прогрессировало, имело торпидное течение.
Таким образом, параметры нуклеиновых кислот могут считаться одними из критериев для оценки характера адаптации новорожденных различного
Т а б л и ц а 4
Таблица сопряженности двух признаков — исходов и процентного содержания гиперплоидных клеток
Процентное содержание гиперплоидных лимфоцитов Количество детей с благоприятным исходом Количество детей с неблагоприятным исходом
3,4% и более А=6 В=1
Менее 3,4% С=36 D=14
Т а б л и ц а 5
Параметры ядерной ДНК у новорожденных I и II групп в зависимости от исхода течения периода
ранней неонатальной адаптации
Параметры Благоприятный (выздоровление) Неблагоприятный (инвалидизация и/или смерть)
Гиподиплоидные лимфоциты, % 4,0±0,8 4,0±1,0
Гиперплоидные лимфоциты, % 2,8±0,9 1,8±0,4
Коэффициент к 3,1±1,3 2,1±1,7
Новорожденный ребенок с клинической картиной срыва адаптации
Параметры нуклеиновых кислот
■ Уровень внеклеточной ДНК от 170 до 400 нг/мл -Уровень гиподиплоидных лимфоцитов от 4% (115 кл/нл) до 12,5% (340 кл/нл) - Уровень гиперплоидных лимфоцитов от 3,4% (115 кл/нл) до 8,5% (220 кл/нл)
ZUZ
\ /
Заключение:
Срыв адаптации с
благоприятным прогнозом
(выздоровление)
/ \
■ Уровень внеклеточной ДНК от 170 до 400 нг/мл
- Уровень гиподиплоидных лимфоцитов от 4% (115 кл/нл) до 12,5% (340 кл/нл)
- Уровень гиперплоидных лимфоцитов менее 3,4% (115 кл/нл)
ZUZ
\ /
Заключение:
Срыв адаптации с
неблагоприятным прогнозом
(инвалидизация, смерть)
/ \
Рис. 5. Алгоритм прогнозирования течения периода ранней неонатальной адаптации на основании оценки параметров содержания нуклеиновых кислот
гестационного возраста и позволяют прогнозировать особенности течения неонатального периода в клинической практике.
ЛИТЕРАТУРА
1. СаРкисов, Д.С. Очерки истории общей патологии / Д.С. Саркисов. — М.: Медицина, 1993.
2. Нарциссов, Р.П. Диагностические и прогностические возможности клинической цитохимии в педиатрии (лекция) / Р.П. Нарциссов // Вестник Гиппократа. — Р н/Дону, 1998. — № 1. — С.10—26.
3. Талаев, В.Ю. Отклонения в ходе беременности и клиническое состояние новорожденных с повышенной чувствительностью Т-лимфоцитов к индуцированному активацией
апоптозу / В.Ю. Талаев, Е.Б. Талаева, И.Е. Лебедева [и др.] // Иммунология. — 1999. — № 6. — С.46—49.
4. Талаев, В.Ю. Повышенная чувствительность Т-лимфоцитов части новорожденных к активационному апоптозу. Связь с заболеваниями матери и ребенка / В.Ю. Талаев, Е.Б. Талаева, И.Е. Лебедева [и др.] // Нижегородский мед. журнал. — 1999. — № 2. — С.13—18.
5. Талаев, В.Ю. Связь патологии беременности с характером ответа на активацию Т-лимфоцитов пуповинной крови новорожденных / В.Ю. Талаев, И.Е. Лебедева, Е.Б. Талаева // Педиатрия. — 1999. — № 5. — С.110—111.
6. Софронов, В.В. Изменение содержания ядерной и внеклеточной ДНК у новорожденных с клиническими проявлениями нарушения адаптации в раннем неонатальном периоде / В.В. Софронов, Н.О. Туаева, В.Г. Винтер [и др.]
// Вопросы современной педиатрии. — 2006. — № 5 (6). — С.28—31.
7. Туаева, Н.О. Внеклеточная ДНК в кровотоке человека. Биологическая роль внеклеточной ДНК / Н.О. Туаева, З.И. Абрамова, Д.М. Мустафина // Ученые записки Казанского университета. — 2008. — Вып. 150 (2). — С.59—70. — (Сер. Естественные науки).
8. Громада, Н.Е. Цитокиновый профиль и количественное значение ДНК в ядрах лимфоцитов периферической крови у новорожденных с гипоксическим перинатальным поражением центральной нервной системы. / Н.Е. Громада // Цитокины и воспаление. — 2008. — Т. 7, № 3. — С.14—18.
9. Boyum, A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow / A. Boyum // Scand. J. Clin. Lab. Investig. — 1968. — 21 (Suppl. 97). — Р1—9.
10. Nicoletti, I. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry / I. Nicoletti, G. Migliorati, M.C. Pagliacci [et al.] // J. Immunol. Methods. — 1991. — Vol. 139. — P.271—280
11. Mannheim, B. Apoptosis and cell proliferation. 2nd ed. /
B. Mannheim // GmbH: Biochemica. — 1998. — P.143.
12. Mac Closkey, T.W. Use of flow cytometric assay to quantitate apoptosis in human lymphocytes. / T.W. Mac Closkey, N. Oyaizi, M. Coronezi [et al.] // Clin. Immunol. Immunopathol. — 2004. — Vol. 71. — P.14—18
13. Бабич, П.Н. Применение современных статистических методов в практике клинических исследований. Сообщение третье. Отношение шансов: понятие, вычисление и интерпретация./ П.Н. Бабич, А.В. Чубенко, С.Н. Лапач // Укра'шський медичний часопис. — 2005. — № 2. —
C.113—119.
