CC BY
52
Оригинальная статья
В.В. Софронов1, Н.О. Туаева2, В.Г. Винтер2, В.А. Емикеева1, Д.И. Шегурова1, Е.В. Маврина3
1 Казанский государственный медицинский университет
2 Казанский государственный университет
3 Детская городская клиническая больница № 1, Казань
Изменение содержания ядерной и внеклеточной ДНК у новорождённых с клиническими проявлениями нарушения адаптации в раннем неонатальном периоде
В СТАТЬЕ ПРЕДСТАВЛЕНЫ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПЛОЩАДИ ЯДРА И МЕТАБОЛИЗМА ДНК (УРОВНИ НАКОПЛЕНИЯ ДНК В ЯДРАХ ЛИМФОЦИТОВ, КОНДЕНСАЦИИ ХРОМАТИНА И КОНЦЕНТРАЦИИ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК В ПЛАЗМЕ КРОВИ) У 63 НОВОРОЖДЁННЫХ ДЕТЕЙ С КЛИНИЧЕСКИМИ ПРОЯВЛЕНИЯМИ СРЫВА АДАПТАЦИИ В РАННЕМ НЕОНАТАЛЬНОМ ПЕРИОДЕ, ТАКИМИ КАК ПЕРИНАТАЛЬНАЯ ПАТОЛОГИЯ ЦНС, ВНУТРИУТРОБНАЯ ПНЕВМОНИЯ И ПНЕВМОПАТИЯ. ВО ВСЕХ СЛУЧАЯХ ВЫЯВЛЕНЫ НАРУШЕНИЯ МЕТАБОЛИЗМА ДНК. НАИБОЛЬШИЕ ОТКЛОНЕНИЯ ИССЛЕДОВАННЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ОТ УРОВНЯ КОНТРОЛЬНОЙ ГРУППЫ ЗАФИКСИРОВАНЫ У ДЕТЕЙ С ПНЕВМОПАТИЕЙ. В РАБОТЕ ВЫДВИГАЕТСЯ ПРЕДПОЛОЖЕНИЕ О ЧАСТИЧНОМ ПРОИСХОЖДЕНИИ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК ПЛАЗМЫ КРОВИ ВСЛЕДСТВИЕ ДЕСТРУКЦИИ ЯДЕРНОЙ ДНК ПРИ АПОПТОЗЕ ЛИМФОЦИТОВ И РАССМАТРИВАЕТСЯ ВОЗМОЖНЫЙ МЕХАНИЗМ УЧАСТИЯ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК В ПАТОГЕНЕЗЕ СРЫВА АДАПТАЦИИ В НЕОНАТАЛЬНОМ ПЕРИОДЕ.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ВНЕКЛЕТОЧНАЯ ДНК, ЯДЕРНАЯ ДНК, ВНУТРИУТРОБНАЯ ПНЕВМОНИЯ, ПНЕВМОПАТИЯ.
Одним из направлений в изучении патогенеза расстройств неонатального периода может стать исследование важнейшей молекулы организма человека—ДНК. В последнее время исследуются различные подходы, использующие характеристики внеклеточной ДНК для диагностики и прогноза широкого спектра заболеваний [1-5]. Однако исследования, посвящённые изучению ядерной ДНК у новорождённых единичны, информация в них разноречива, а данных, касающихся наличия и роли внеклеточной ДНК у новорождённых нам не удалось обнаружить [6-8].
Установлено, что в одноимённых структурах клеток различных органов изменения развиваются стереотипно и процесс восстановления клеточных структур после прекращения патогенного воздействия не зависит от характера этиологического фактора [9]. Лимфоцит, будучи центральным звеном иммунной системы, является мигрирующей клеткой и способен отражать изменения, происходящие в организме, вследствие чего именно он выбран нами как объект для изучения ядерной ДНК у новорождённых с клинической картиной срыва адаптации [10]. Данное исследование предполагает установить наличие
Контактная информация:
Туаева Наталья Олеговна, научный сотрудник лаборатории нуклеиновых кислот кафедры биохимии Казанского государственного университета Адрес: 420039, Казань, ул. Х. Туфана, д. 28а/34, тел. 8 (843) 231-52-42 Статья поступила 20.04.2006 г., принята к печати 18.07.2006 г.
V.V. Sofronov1, N.O. Tuaeva2, V.G. Vinter2,
V.A. Emikeeva1, D.I. Shegurova1, E.V. Mavrina3
1 Kazan State Medical University
2 Kazan State University
3 Children's City Clinical Hospital № 1, Kazan
Quantitative parameters of nuclear and free-cell DNA in newborn babies with clinical manifestations of adaptation derangement in early neonatal period
IN THE PAPER WERE PRESENTED THE RESULTS OF AN INVESTIGATION OF THE NUCLEUS AREA AND METABOLISM DNA PARAMETERS (THE LEVEL OF NUCLEAR DNA UPTAKE, THE LEVEL OF A CHROMATIN CONDENSATION AND THE CONCENTRATION OF PLASMA FREE-CELL DNA) IN NEWBORNS WITH CLINICAL MANIFESTATIONS OF ADAPTATION DERANGEMENT (A PERINATAL CNS DAMAGE, AN INTRAUTERINE PNEUMONIA AND A NEONATAL PNEUMOPATHY) IN EARLY NEONATAL PERIOD. IN ALL CASES THE DISORDERS OF A DNA METABOLISM WAS OBTAINED. HOWEVER, THE GREATEST DIVERGENCE OF ALL INVESTIGATED PARAMETERS WAS FOUNDED IN NEWBORNS WITH NEONATAL PNEUMOPATHY. WE MADE THE ASSUMPTION THAT LYMPHOCYTE APOPTOSIS MAY BE PART OF THE REASON FOR THE ORIGIN OF FREE-CELL DNA AND WE PROPOSE THE POSSIBLE MECHANISM OF FREE-CELL DNA SHARING IN PATHOGENESIS OF DERANGEMENT ADAPTATION IN NEONATAL PERIOD.
KEY WORDS: FREE-CELL DNA, NUCLEAR DNA, INTRAUTERINE PNEUMONIA, PNEUMOPATHY.
взаимосвязи между накоплением ДНК внутри клетки и динамикой изменения количества внеклеточной ДНК плазмы крови, что может иметь значение для определения источника внеклеточной ДНК у новорождённых детей.
ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ
Исследования проведены у 63 новорождённых с различными проявлениями срыва адаптации: 18 детей страдали внутриутробной пневмонией (ВУП), у 24 детей в раннем неонатальном периоде развилась клиника пневмопатии, у 21 ребёнка регистрировалась перинатальная патология ЦНС, не осложнённая инфекцией или дыхательными нарушениями. Новорождённые были пациентами отделения реанимации или отделения патологии новорождённых Детской иородской клинической больницы № 1 Казани. Тридцать девять человек были рождены в срок, здоровы и составили контрольную группу (К).
Измерение содержания ДНК в клеточных ядрах. Проведено сканирование 1370 лимфоцитов периферической крови в мазках, окрашенных по Фельгену, с помощью сканирующего микроскопа «Люмам ПМ-11», соединённого через интерфейс И2 с ПК [11]. Измерения проводили в проходящем свете с фильтром 3E11-3 с полосой пропускания 480-560 нм; объектив МИ-90. Использовали следующие параметры измерения: размер зонда 0,05 мм с проекцией на объект равной 0,56 мкм и шагом сканирования 0,5 мкм в гомогенном режиме. Единицы измерения: площадь ядра (ПЯ) выражали в мкм2, среднюю оптическую плотность (СОП) — в БЕЛ*/мкм2. СОП отражает средний уровень конденсации хроматина в ядре клетки и является десятичным логарифмом отношения фонового светового потока к световому потоку ядра клетки. Интегральная оптическая плотность (ИОП) является результатом произведения площади ядра клетки (ПЯ) на СОП и характеризует общее количество ДНК клетки (выражается в БЕЛ).
Определение концентрации внеклеточной ДНК в плазме крови. Плазму крови (200 мкл) получали по методике, описанной в работе [12]. Депротеинизировали плазму с использованием протеиназы К («Sigma», Германия), фенола, хлороформа и изоамилового спирта («Реахим», Россия), как описано ранее [13]. В качестве флуоресцентного красителя использовали Hoechst 33342 («Aldrich», USA), интенсивность флуоресценции комплекса ДНК-Hoechst измеряли на люминесцентном спектрофотометре Hitachi MPF-4. Концентрацию ДНК определяли по калибровочной кривой изменения флуоресценции в стандартных разведениях, для приготовления которых использовали ДНК эритроцитов цыплят («Reanal», Венгрия).
Статистическая обработка результатов исследования. Для каждой выборки определяли среднее стандартное отклонение, стандартную ошибку среднего. Сравнение выборок проводили, используя критерий Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящей работе исследовали концентрацию внеклеточной ДНК у новорождённых с перинатальной патологией ЦНС, внутриутробной пневмонией и с пневмопатией. Результаты исследования концентрации внеклеточной ДНК представлены на рис. 1А. Из рисунка видно, что во всех группах новорождённых концентрация внеклеточной ДНК в плазме крови достоверно (р < 0,01) превышает этот показатель в контрольной группе (22 ± 2,3 нг/мл). Макси-
мально высокую концентрацию внеклеточной ДНК (51,2 ± 12,2 нг/мл) наблюдали в плазме крови новорождённых с пневмопатией. Высокую по сравнению с контрольной группой концентрацию внеклеточной ДНК (в среднем 47,0 ± 8,6 нг/мл) наблюдали при внутриутробной пневмонии. У новорождённых с перинатальной патологией ЦНС без пневмопатии и внутриутробной пневмонии показатель концентрации ДНК в плазме крови составил 42,2 ± 21,8 нг/мл.
Одним из морфометрических показателей, отражающих различные фазы жизни клетки (от пролиферации до гибели), является показатель площади ядра (ПЯ). Проведённое исследование данного параметра у вышеуказанных групп детей показало, что средняя величина площади ядра понижена при внутриутробной пневмонии и при пневмопатии. При патологии ЦНС не наблюдали достоверного снижения средней площади ядра (табл.).
Параметры цитофотометрических показателей представлены на рис. 1В, 1С. В контрольной группе показатель накопления ДНК (ИОП) в ядрах лимфоцитов составил 6,08 ± 0,069 БЕЛ. Достоверное снижение (р < 0,05) накопления ДНК в ядрах лимфоцитов выявлено при всех иссле-
Рис. 1. Показатели внеклеточной ДНК (А), ядерной ДНК (В) и конденсации хроматина (С) при нарушениях адаптации у новорождённых
I
Ct
80
70
60
50
40
30
20
10
О
0,14
5 °.12
LO
~ 0,10 § 0,08 0,06
Контроль ПП ЦНС
*
-i-
ВУП
п/п
* в
Контроль ПП ЦНС
ВУП
П/П
5
*
2
5
ш
с
О
О
Контроль ПП ЦНС
ВУП
П/П
Примечание:
К — контрольная группа;
ПП ЦНС — перинатальная патология ЦНС; ВУП — внутриутробная пневмония;
П/П — пневмопатия.
* Условная единица БЕЛ получила своё обозначение от первых букв фамилии автора, разработавшего используемый метод (Белан И.Б., сибирское отделение РАМН, Новосибирск).
29
ВОПРОСЫ СОВРЕМЕННОЙ ПЕДИАТРИИ/ 2006/ ТОМ 5/ № 6
Оригинальная статья
Группы пациентов Число клеток Площадь ядра (мкм2) КБС (г)
Перинатальная патология ЦНС 101 34,68 ± 1,60(*) -0,500
Внутриутробная пневмония 230 39,78 ± 0,57 (*) -0,050
Пневмопатия 90 32,04 ± 0,79 (*) 0,001
Контрольная группа 432 43,32 ± 0,45 -0,650
Примечание:
* — разница показателей достоверна между группой наблюдения и контрольной группой.
дованных заболеваниях периода новорождённое™: при перинатальном поражении ЦНС ИОП = 4,07 ± 0,11 БЕЛ, при внутриутробной пневмонии ИОП = 4,17 ± 0,07 БЕЛ, у новорождённых е развившейся в раннем неонатальном периоде симптоматикой пневмопатии установлено минимально низкое накопление ядерной ДНК (ИОП = 3,59 ± 0,12 БЕЛ). Самый низкий показатель конденсации хроматина в ядрах лимфоцитов (СОП = 0,101 ± 0,002 БЕЛ/мкм2) наблюдался в группе новорождённых с внутриутробной пневмонией (рис. 1С). В группах с перинатальной патологией ЦНС и пневмопатией также выявлено достоверное снижение показателей СОП (0,122 ± 0,003 и 0,113 ± 0,001 БЕЛ/мкм2, соответственно) по сравнению с контрольной группой (СОП = 0,139 ± 0,002 БЕЛ/мкм2).
Принципиальное значение имеет показатель биологической синхронизации внутриядерных процессов (КБС), отражающий согласованность морфологических и синтетических процессов в ядре клетки и являющийся коэффициентом корреляции между ПЯ и СОП (табл. 1). Значения КБС приближены к показателям контрольной группы (КБС = -0,65) у новорождённых с перинатальной патологией ЦНС (КБС = -0,50). Исчезновение механизма биологической синхронизации (г = -0,05) наблюдалось при одном из самых тяжёлых патологических состояний ново-рождённости — внутриутробной пневмонии. Практически нулевой показатель синхронизации биологических процессов в ядре клетки (КБС = 0,001) наблюдался при пневмопатии.
Полученные результаты свидетельствуют о существенных изменениях показателей клеточной и внеклеточной ДНК, которые сопровождают клиническую картину срыва адаптации в неонатальном периоде и свидетельствуют о метаболическом дисбалансе ДНК. Обращает на себя внимание тот факт, что при наиболее тяжёлых заболеваниях периода новорождённости — внутриутробной пневмонии и пневмопатии — при достоверном снижении величины площади ядра и накопления ядерной ДНК наблюдается достоверное повышение концентрации внеклеточной ДНК в плазме крови (рис. 2). В частности, такой дисбаланс особо выражен в группе с пневмопатией, что наглядно представлено на рис. 2.
Обозначенные выше цитофотометрические изменения при внутриутробной пневмонии и пневмопатии являются отражением процесса самодеструкции клетки — апопто-за, который обусловлен снижением в крови продуктов жизнеобеспечения, в частности, кислорода при гипоксии [14]. Подтверждает эту версию и накопление в кровотоке таких новорождённых большого количества внеклеточной ДНК, источником которой становится не только подвергшиеся апоптозу клетки нервной ткани, но и лимфоциты [3].
Обобщая полученные нами результаты и данные литературы, мы предполагаем, что сценарий развития клинической картины срыва адаптации может разворачиваться с
участием внеклеточной ДНК по схеме, представленной на рис. 3. Долговременная адаптация организма к таким патогенным факторам как гипоксия, токсические, инфекционные и другие агенты, обеспечивается перестройкой клеточных структур, которая начинается с ядра, а именно с репликации ДНК [15]. При комбинированном, экзо- и эндогенном, воздействии на ДНК тропными к ней агентами (ДНК-вирусы, токсины, гипоксия) происходят наиболее тяжёлые формы нарушения репликации ДНК [16], что ведёт к реализации апоптоза и выходу в кровоток апоптотичес-ких продуктов [17]. Эти продукты в норме быстро элиминируются фагоцитирующими клетками и не контактируют с Т и В лимфоцитами [17-19]. В ряде работ показано снижение фагоцитарной функции у новорождённых с перинатальной патологией ЦНС, внутриутробным инфицированием и респираторным дистресс-синдромом [20-22]. Недавно показано, что «перегрузка» фагоцитов компонен-
Рис. 2. Изменения показателей метаболизма ДНК (в %) в сравнении с контрольной группой (100%) при нарушениях адаптации
%
ИОП I I СОП Внеклеточная ДНК
Примечание:
К — контрольная группа;
ПП ЦНС — перинатальная патология ЦНС; ВУП — внутриутробная пневмония;
П/П — пневмопатия.
Рис. 3. Реализация механизма срыва адаптации в раннем неонатальном периоде с участием внеклеточной ДНК
Инфекционные агенты
Нуклеосомы
Снижение
фагоцитарной
активности
Анергия
Активация В-клеток
тами разрушенных клеток может приводить к запуску апоптоза макрофагов [23]. Неспособность фагоцитарного звена иммунной системы новорождённых с нарушениями
адаптации осуществлять удаление апоптозных телец в полной мере возводит нуклеосомальную внеклеточную ДНК в статус антигена, и увеличивает нагрузку на гуморальное звено иммунной системы, приводя к активации В-клеток и выработке антител. Когда доза антигена превышает определённый порог, у зрелых В-клеток (присутствующих у новорождённых в небольших количествах) развивается анергия, а большинство незрелых В-предшест-венников погибает путём апоптоза [24]. Это предположение подтверждается выявлением обратной корреляции между содержанием ядерной ДНК (ИОП) и частотой инфекционных заболеваний на протяжении первого года жизни (г = -0,36; р < 0,05).
ВЫВОДЫ
1. У новорождённых с клинической картиной срыва адаптации в раннем неонатальном периоде наблюдается увеличение количества внеклеточной ДНК в плазме крови.
2. Причиной этого частично является апоптоз лимфоцитов, активированный внутриутробной гипоксией или инфекционными агентами.
3. Установленная разбалансировка метаболизма ДНК может стать основанием для разработки длительной модулирующей терапии, нормализующей метаболизм ДНК и трофические процессы в клетках новорождённых с клиническим проявлением срыва адаптации в раннем неонатальном периоде.
31
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Вознюк И.А., Одинак М.М., Васильева И.Н. и др. Внеклеточная низкомолекулярная фракция ДНК — маркер острого нейронального повреждения при инсульте // Современные подходы к диагностике и лечению нервных и психических заболеваний. Мат. юбил. конф., 14-16.06.2000 посвящённой 140-летию кафедры нервных и душевных болезней. — СПб. — 358 с.
2. Ганнушкина И.В., Фараго М.Л., Антелава И.Н и др. Гемодина-мический эффект плазмы крови // Вестник РАМН. — 1998. — № 15. — С. 16-22.
3. Ганнушкина И.В., Фараго М.Л., Карпухин А.В. и др. Уровень ДНК в плазме крови больных с атеросклеротическим поражением магистральных артерий головы и боковым амниотрофическим склерозом // Бюлл. эксп. биол. — 1997. — № 12. — С. 610-612.
4. Lam N.Y.L., Rainer T.H., Chan L.Y.S. et al. Time Course of Early and Late Changes in Plasma DNA in Trauma Patients // Clin. Chem. — 2003. — V. 49, № 8. — P 1286-1291.
5. Lo D.Y.M., Rainer T.H., Chan L.Y.S. et al. Plasma DNA as a Prognostic Marker in Trauma Patients // Clin. Chem. — 2000. — V. 46, № 3. — P. 319-323.
6. Степанова Е.И., Кочеткова Ю.С., Пахряева Г.Н. Цитофотомет-рическое определение ДНК в лимфоцитах периферической крови новорождённых детей // Педиатрия. — 1982. — № 7. — С. 16-17.
7. Сухих Г.П., Мадалински К.И., Ванько Л.В., Сулейманова Н.С. Функциональная активность клеток крови новорождённых // Акуш. и гин. — 1990. — № 1. — С. 40-43.
8. Kerr J.F.R., Searle J., Bishop C.J. Apoptosis // Austr. Radiol. — 1979. — V. 23. — P. 192-201.
9. Саркисов Д.С. Очерки истории общей патологии. — М.: Медицина, 1993. — 486 с.
10. Нарциссов З.П. Прогностические возможности клинической цитохимии / В кн.: Советская педиатрия. Вып. 2. — М.: Медицина, 1984. — С. 267-275.
11. Козинец Г.И., Котельников В.М., (ольдберг В.К. Цитофотометрия гемопоэтических клеток. — Томск: Издательство Томского Университета. — 1986. — 76 с.
12. Вдовиченко К.К., Маркова С.И., Цветкова И.А., Белохвостов А.С. Особенности выявления мутантной формы гена К-ras в плазме крови при некоторых типах онкологических заболеваний //
Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. — 2003. — Т. 2, № 1. — С. 71-75.
13. Tuaeva N.O., Vinter V.G., Belokchvostov A.S. et al. The free-cell DNA in blood plasma of newborn babies with perinatal CNS damage // Clin. Chem. — 2005. — V. 51, № 10. — 21 p.
14. Slavikova M., Miler I. Zveni v jaderku lymfocytu hypotrofykuch novorozencu // Ces. Pediatr. — 1989. — V. 44. — № 1. — P 54-55.
15. Структурные основы адаптации и компенсации нарушенных функций / Руководство под ред. Саркисова Д.С. — M.: Mедицина, 1987. — 448 c.
16. Караулов А.В., Mоcкалева Е.Ю., Радзевич А.Е. и др. Структура ДНК лимфоцитов периферической крови человека и их способность к репарации ДНК при иммунизации и некоторых заболеваниях // Иммунология. — 1991. — № 2. — С. 15-17.
17. Holdenrieder S., Stieber P. Apoptotic markers in cancer // Clin. Biochem. — 2004. — V. 37. — P. 605-617.
18. Lorenz H-M. Herrmann M., Winkler Т. et al. Role of apoptosis in autoimmunity // Apoptosis. — 2000. — V. 5, № 5. — P 443-449.
19. Hupperts B., Kingdom J.C.P Apoptosis in the Trophoblast — Role of Apopotsis in Placenta Morphogenesis // J. Soc. Ginecol. Investig. — 2004. — V. 11. — P. 353-362.
20. Непокульчицкая Н.В., Долгина Е.Н., Самсыгина Г.А. Иммунологическая характеристика детей первых трёх месяцев жизни с внутриутробной и постнатальной инфекцией // Педиатрия. — 1994. — № 6. — С. 23-26.
21. Нестерова И.В., Никулин Л.А., Кокова Л.Н. Диагностика и коррекция дефектов нейтральных гранулоцитов у новорождённых с перинатальным поражением ЦНС // Педиатрия. — 1994. — № 6. — С. 17-20.
22. Володин Н.Н., Дегтярева M^., Дегтярев Д.Н. и др. Особенности иммунологической адаптации у новорождённых детей в норме, при респираторном дистресс-синдроме и при пневмонии бактериальной этиологии // Int. J. of Immunorehabilitation. — 1999. — № 11. — С. 82-91.
23. David S. Pisetsky. The immune response to cell death in SLE // Autoimmun Rev. — 2004. — V. 3. — P 500-504.
24. Таболин В.А., Володин Н.Н., Дегтярева M^. и др. Актуальные вопросы перинатальной иммунологии // Int. J. of Immunorehabilitation. — 1997. — № 6. — С. 112-122.
ВОПРОСЫ СОВРЕМЕННОЙ ПЕДИАТРИИ/ 2006/ TOM 5/ № 6
