CC BY
17
А Н 1,150
О
Л 0,950
<и
к 0,750
р
о ^ 0,550
CT
0,350
0,150
-0,050
-0,050 0,150 0,350 0,550 0,750 0,950 1,150
Специфичность
Характеристическая кривая для изучаемых цитокинов у новорожденных при поступлении в отделение с целью прогноза септической инфекции
Построение характеристической кривой позволило установить точку разделения с учетом последствий ложных прогностических решений (чувствительности и 1-специфичности, рисунок). Для Г-КСФ точкой пересечения чувствительности и 1-специфичность в нашем случае оказалась 2 232 пкг/мл. ПЦП теста составила 94 и ПЦО 96 %. Для «сиой» была установлена 7403 пкг/мл с ПЦП 92 и ПЦО 72 %. Для ФРФ при «сиой» 38,11 пкг/мл ПЦП теста составила 100, а ПЦО 72 %.
Таким образом, используя полученные данные, можно прогнозировать развитие септической инфекции у доношенных новорожденных с дыхательными расстройствами с достаточно высокой степенью вероятности при поступлении в отделение интенсивной терапии.
В нашей работе на 3-5 сут лечения в отделении у новорожденных мы наблюдали достоверные различия показателей провоспалительных и регуляторных ци-токинов крови (таблица). У новорожденных, основное заболевание которых не осложнилось присоединением септической инфекции, достоверно выше были концентрации в крови ростовых, пролиферативных факторов (Г-КСФ, ФРФ) и противовоспалительного цитокина - ИЛ4. У детей с сепсисом достоверно более высокой была концентрация провоспалительного ци-токина - ИЛ8. Таким образом, цитокиновый статус доношенных новорожденных с септической инфекцией характеризуется дисбалансом системного воспалительного и системного противовоспалительного ответов. Полученные результаты совпадают с результатами зарубежных и отечественных исследователей. Это позволяет подтвердить ранее сделанные выводы о
том, что системное воспаление регулируется тонкими механизмами взаимодействия про- и противовоспалительных цитокинов [2, 3, 9].
В исходе заболевания анализ результатов исследования показал более глубокий дисбаланс цитокиновой регуляции. Концентрация Г-КСФ, ФРФ sFAS, ИЛ6, ИЛ4, ИЛ^ у новорожденных первой группы оказались достоверно выше по сравнению с детьми, перенесшими септическую инфекцию. Концентрация основного маркера системного воспаления - ИЛ8 значительно превышала таковую у детей второй группы. Важно отметить, что уровень Hniß в крови новорожденных, умерших с основным диагнозом септическая инфекция, в исходе заболевания резко снижался до минимальных цифр, граничащих с чувствительностью тест-системы. Резкое падение концентрации Hniß в крови детей в критическом состоянии может расцениваться как негативный прогностический признак.
Таким образом, из вышеизложенного можно заключить, что у доношенных новорожденных с дыхательными расстройствами, находящихся на ИВЛ, септическая инфекция сопровождается дисбалансом про-и противовоспалительной систем.
Ростовые факторы в детском организме играют решающую роль в поддержании иммунной системы в активном состоянии, способном защитить от инфекции.
Падение концентрации HH1ß в крови новорожденных, состояние которых осложнилось присоединением септической инфекции, имеет отрицательную прогностическую значимость.
Литература
1. Рудное В.А. // Клиническая антимикробная химиотерапия. 2000. Т. 2. № 1. С. 2-7.
2. Rixen D., Siegel I.H., Friedman H.P. // J. Trauma. 1996. Vol. 41. № 4. P. 581-598.
3. Самсыгина Г.А., Баранов А.А. // Педиатрия. 2003. № 56. C. 4-8.
4. Bone B.C., Balk R.A., Cerra F.B. // Crit. Care Med. 1992. Vol. 20. Р. 864-874.
5. RedlH. et al. // Clin. Chem. 1992. Vol. 38. № 5. P. 764-765.
6. Maheshwari A., Christensen R.D., Calhoun D.A. // Pediatrics. 2002. Vol. 109. Р. 64.
7. Bernstein H.M, Calhoun D.A, Christensen R.D. // Curr Opin Pediatr. 2002. Vol. 14. Р. 91-94.
8. Parravicini E. et al. // Transfus. Med. Rev. 2002. Vol. 16. Р. 11-24.
9. Макагон А.В. и др. // Бюл. РАМН. 2005. № 2. С. 42-46.
Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии 25 сентября 2006 г.
УДК 616.89-008.481-053
ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ РОЛЬ ФАКТОРОВ ПРОЛИФЕРАЦИИ И АЛЬТЕРАЦИИ КЛЕТОК КРОВИ У ДОНОШЕННЫХ НОВОРОЖДЕННЫХ С ДЫХАТЕЛЬНЫМИ РАССТРОЙСТВАМИ
© 2006 г. Е.А. Ефанова
Solving cytocines, defining proliferation and activation of the immune system, have importance for developments of a neutropenia by newborn infants. The Low serum concentrations of these markers (G-CSF, FRF, sFAS) carry disadvantage predictionary nature of neutropenia. The high level of the process apoptosis of blood cells also defines the development neutropenia by newborn.
Доношенные новорожденные с дыхательными тиляции легких и интенсивном лечении в условиях расстройствами (ДР) нуждаются в искусственной вен- реанимационного отделения. Летальность в этих слу-
чаях стабильно высока, несмотря на внедрение современных высоких технологий [1-3]. Основной причиной смерти доношенных новорожденных с ДР являются гнойно-септические осложнения, которые в большинстве случаев сопровождаются развившейся нейтропенией [4]. Являясь основным звеном в защите организма, нейтрофилы обеспечивают невосприимчивость новорожденного ребенка к бактериальной инфекции [5]. Однако при сниженном количестве сег-ментоядерных клеток крови частой находкой у новорожденных может оказаться нейтропения. Низкая концентрация нейтрофилов у детей раннего неона-тального возраста ассоциируется с высокой заболеваемостью сепсисом и смертностью [6]. Б.Ь. Мапгое с соавт. определили нейтропению как единственный наиболее точный прогностический маркер развития гнойно-септических осложнений и нозокомиальных инфекций у новорожденных [7].
В настоящее время ни у кого не вызывает сомнения роль нарушений апоптоза в патогенезе иммунопатологических процессов, в том числе вторичных им-мунодефицитов (ВИД), аутоиммунных и онкологических заболеваний, хронических воспалительных процессов, вирусных и других инфекций [8, 9]. Появилось даже такое понятие, как апоптотические иммунодефицита (АИД), возникающие в результате разрушения естественного развития апоптотического процесса в сторону его подавления или усиления [9].
В последние годы АИД привлекает внимание педиатров [10]. Особенно актуальна эта проблема в нео-натологии, так как АИД встречаются у новорожденных гораздо чаще, чем у взрослых, что обусловлено особенностями их иммунной системы и может быть причиной развития нейтропении. В частности, у новорожденных повышена экспрессия молекул СД95, участвующих в реализации активационного апоптоза зрелых Т-лимфоцитов [11]. Лимфоидные клетки новорожденных значительно более чувствительны к подавлению пролиферативного ответа глюкокортикои-дами, чем клетки взрослых. Для новорожденных характерен также более низкий сывороточный уровень цитокинов, в частности, КСФ, ИФ, ИЛ-1, ИЛ-4, защищающих в норме клетки от избыточного апоптоза [12].
С целью поиска иммунологических маркеров развития нейтропении у доношенных новорожденных с ДР было проведено это исследование с рабочей гипотезой, что процессы апоптоза клеток иммунной системы новорожденного развиваются при недостатке ростовых факторов и других активаторов, препятствующих реализации внутренней программы клеточного самоубийства («пассивный апоптоз», или «апоп-тоз по умолчанию»), свойственный клеткам с высоким уровнем дифференциации в организме новорожденного ребенка [13].
Материалы и методы
В исследование вошли 64 новорожденных с респираторной патологией, вызванной мекониальной аспирацией, поступивших в реанимационное отделение в тяжелом состоянии. Все дети находились на ИВЛ, родились в сроке гестации 39±2,1 недель, с массой тела 3700±565 г, от матерей в возрасте 26±7,4 лет
с отягощенным акушерским анамнезом, с оценкой по Апгар 3,2±1,6 баллов. Тяжесть состояния новорожденных была обусловлена дыхательной недостаточно -стью (гипоксемия рО2 < 50, гиперкапния рСО2 > 45, выраженный ацидоз pH капиллярной крови < 7,25), все дети были переведены на ИВЛ в родильном зале и транспортированы в отделение реанимации в первые часы - дни жизни (3±0,9).
Ретроспективно все дети были разделены на 2 группы. У 32 детей (I группа - с нейтропенией) на 2-3 сут пребывания в отделении в общем анализе крови наблюдалось снижение абсолютного числа ней-трофилов (М < 1800 кл/мм3). Состояние 32 (II группа) детей не осложнилось нейтропенией.
Помимо общеклинических проводились дополнительные исследования по определению концентрации цитокинов крови. Программа обследования включала измерение плазменных уровней интерлейкинов (ИЛ) 1b, ИЛ6, ИЛ8, ИЛ4, фактора некроза опухолей (ФНО), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), растворимого FAS (sFAS), фактора роста фибробластов (ФРФ) методами иммуноферментного анализа. Забор венозной крови осуществляли сразу при поступлении детей в отделение и до начала лекарственной терапии.
Анализ проводился с помощью тест-систем фирмы R&D (США) по прилагаемым инструкциям. Для того чтобы избежать выброса цитокинов лейкоцитами крови ex vivo, мы применяли специально разработанную методику забора материала. В своем выборе мы руководствовались рекомендациями ряда авторов [9] использовать пробирки с антикоагулянтом (лучше ЭДТА), а для быстрого отделения клеток от плазмы сразу центрифугировать при температуре 0-4 °С и, таким образом, максимально избежать секреции цитокинов ex vivo. Поэтому у новорожденных брали 1 мл венозной крови в пробирки Vacutainer для получения плазмы с разделительным гелем и ЭДТА в качестве антикоагулянта (Becton Dickinson, США), центрифугировали 3 мин при 5 000 об/мин при 4 °С, и 100 мкл полученной плазмы использовали для анализа. Оптическую плотность определяли на многофункциональном фотометре «Viktor», Wallak, (Финляндия) при длине волны 450 нм. Анализ результатов проводился автоматически с помощью программы «Viktor-Wal-lak».
Анализ процента клеток, находящихся в раннем апоптозе, проводили с использованием «ANNEXIN V kit» (Caltag, США). Прокрашиванием пропидия йоди-дом ядер клеток крови определяли процент клеток в позднем апоптозе. Субпопуляционный состав лимфоцитов крови методом однопараметрического иммуно-фенотипирования проводили с использованием реагентов фирмы IQProducts (Нидерланды), а также Beckman Coulter (США): фитц-меченые CD 3, CD 4, CD 8, CD 14, CD 19, CD 34, CD 56, CD 69, CD 71, CD 95 моноклональные антитела. Результаты учитывали на проточном цитометре Beckman Coulter Epics XL (США), используя стандартные протоколы. Выделение пула лейкоцитов из крови новорожденных производили с использованием лизирующего раствора OptiLyse C Beckman Coulter (США) по прилагаемому протоколу.
Оксид азота в сыворотке измеряли методом превращения нитратов в нитриты нитрат редуктазой, детекцию нитритов осуществляли реактивом Грисса и оптическую плотность измеряли при 540 нм. Использовали наборы для определения общего оксида азота фирмы R&D (США). Методику осуществляли строго по прилагаемой инструкции.
Статистический анализ полученных эмпирических данных был проведен исходя из того факта, что их распределение отлично от нормального, и поэтому использовались непараметрические методы. Получение оценок описательной статистики сводилось к расчету медиан и интерквартильного размаха. Статистическая обоснованность различия отдельных выборок определялась с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни для несвязанных и критерия Вилкоксона для связанных групп при 5%-м уровне значимости в отношении двухсторонней альтернативы.
В исследовании использовались следующие пакеты прикладных программ: общие статистические показатели определялись с использованием возможностей Excel-2003, а для оценки вида распределения эмпирических данных применялся пакет прикладных программ «Мегастат». Для оценки тестов разделения групп (их диагностической эффективности или дискриминационной способности) проводилось построение характеристических кривых (ROC-кривых). С целью построения ROC-кривых был разработан макрос на языке VBA в среде Excel-2003, что позволило провести оценку зависимости точности, чувствительности и специфичности разделения групп по исследуемому фактору от значения сШой".
Результаты и обсуждение
Анализ полученных результатов показал, что новорожденные с развившейся нейтропенией имели при поступлении достоверно более низкие цифры концентрации Г-КСФ, ИЛ8, sFAS, ФРФ в крови (табл. 1). Концентрации ИЛ1Р, ИЛ6, ИЛ4 и ФНО не имели достоверных различий у детей изучаемых групп.
Таблица 1
Показатели крови новорожденных с ДР, имеющие достоверные различия при поступлении в отделение
Показатель крови I группа (медиана) II группа (медиана) Р
СЭ34, % 0,3 0,1 0,017794
Г-КСФ, пк/мл 995 1600 0,000000
ИЛ 8, пк/мл 277,1 358,05 0,008166
Лейкоциты, абс. • 109 6,0 11,7 0,000003
Юные нейтр., % 0,1 1,0 0,011951
Моноциты, % 6,6 8,5 0,010629
Абс. число нейтрофилов • 109 4,3 7,8 0,001609
зРА8, пк/мл 5927,1 7319,7 0,004788
ФРФ, пк/мл 20,0 34,9 0,029117
N0 25,5 16,5 0,009373
СЭ95 9,2 1,9 0,000482
Апоптоз ранний, % 13,5 12,3 0,036122
Апоптоз поздний, % 1,99 0,3 0,006958
У новорожденных с более низким содержанием Г-КСФ через 3-5 сут развилась нейтропения, и, учитывая тот факт, что Г-КСФ является физиологическим регулятором колониеобразующих единиц нейтрофи-лов, стимулятором их продукции и функции, можно предположить, что нейтропения в данном случае опосредована недостаточностью именно этого фактора.
ИЛ8 относится к классу провоспалительных хемо-кинов и синтезируется преимущественно моноцитами. Его активная форма эффективно активирует нейтро-фильные гранулоциты, повышая хемотаксис и синтез миелопероксидазы, и, таким образом, играя ключевую роль в защите макроорганизма от инфекции. Сниженная концентрация этого цитокина в крови новорожденных с нейтропенией свидетельствует о недостатке факторов костимуляции для пролиферации нейтрофилов и может приводить к пониженному синтезу нейтрофилов.
Содержание пролиферативных факторов или факторов роста - sFAS и ФРФ у детей с развившейся ней-тропенией отмечалось также достоверно ниже по сравнению с новорожденными без нейтропении. Более высокие цифры концентрации антиапоптогенного фактора - растворимого рецептора FAS у новорожденных свидетельствуют о сниженных процессах альтерации клеток у этих детей и вместе с достоверно сниженными показателями раннего и особенно позднего апоптоза говорят о подавлении процессов апоп-тоза у новорожденных с ДР без нейтропении.
У детей с нейтропенией совершенно очевидно превалируют процессы альтерации над процессами пролиферации клеток, что возможно и является причиной развившейся позже нейтропении.
Анализ полученных результатов показал, что новорожденные с развившейся позже нейтропенией имели достоверно более низкие цифры абсолютного числа лейкоцитов, абсолютного числа нейтрофилов, моноцитов и юных нейтрофильных клеток. У этих детей при поступлении не была выявлена нейтропе-ния, однако достоверное падение этих показателей можно расценивать как фактор риска развития гнойно-септических осложнений. Таким образом, не только абсолютную нейтропению, но и снижение концентрации в крови лейкоцитов и нейтрофилов можно считать неблагоприятным прогностическим признаком развития гнойно-септических осложнений и неблагоприятных исходов у новорожденных.
В нашем исследовании у детей первой группы процент плюрипотентной гемопоэтической стволовой клетки достоверно выше по сравнению с новорожденными второй группы. Возможно, этот факт можно объяснить компенсаторным повышенным синтезом гемопоэтических клеток - однако у детей первой группы, несмотря на более высокий уровень CD34, развивалась нейтропения. Субпопуляционный состав лимфоцитов крови по маркерам CD3, CD4, CD8, CD56, CD 19, CD 14, CD69, CD71 не различался у новорожденных изучаемых групп.
Одним из основных факторов, опосредующих и инициирующих процессы апоптоза, является оксид азота. У детей первой группы уровень NO крови достоверно выше, чем в группе здоровых детей и новорожденных без нейтропении. Из наших наблюдений можно предположить, что избыточная продукция NO является
причиной патологических сдвигов в организме ребенка. Помимо участия в образовании токсических продуктов (пероксинитрит, гидроксирадикал), N0 ингиби-рует адгезию лейкоцитов к стенке сосудов, влияет на выработку факторов роста, а также оказывает антими-тотическое и антипролиферативное действие. Таким образом, нами получено подтверждение факта участия молекулы N0 в альтерации нейтрофилов доношенных новорожденных с дыхательными расстройствами.
Клетки с активационным рецептором готовности к апоптозу (СБ95) достоверно выше представлены в группе новорожденных с нейтропенией. Кроме того, клеток, вступивших в ранний апоптоз и имеющих признаки позднего некроза, также достоверно выше у детей с развившейся нейтропенией. Таким образом, можно заключить, что нейтропения у доношенных новорожденных с респираторными расстройствами обусловлена процессами естественной клеточной гибели.
В табл. 2 представлены характеристики диагностической значимости изучаемых тестов для прогноза развития нейтропении у доношенных новорожденных в критических состояниях (ДР) при поступлении в первые сутки заболевания до начала лечения.
Из вышеизложенного можно сделать следующие выводы. Нейтропения у доношенных новорожденных с ДР опосредуется недостаточным синтезом антиапоп-тогенных ростовых пролиферативных факторов -Г-КСФ, ФРФ, Нейтропения у доношенных но-
ворожденных с респираторными расстройствами обусловлена процессами естественной клеточной гибели. Недостаток в крови ИЛ8, который является основным активационным и пролиферативным хемокином для нейтрофилов, также приводит к нейтропении. Несмотря на достоверно более низкие цифры содержания в крови лейкоцитов, нейтрофилов, моноцитов у детей с нейтропенией, костномозговые резервы достаточны для повышенного синтеза гемопоэтической стволовой клетки. Основным механизмом альтерации иммуно-компетентных клеток крови новорожденных является естественная клеточная гибель. Избыточная продукция N0 приводит к нейтропении у новорожденных. Тесты, характеризующие ранний и поздний апоптоз, являются наиболее чувствительными и специфичными для прогноза развития нейтропении у новорожденных.
Таблица 2
Характеристика диагностической значимости тестов, используемых для прогноза развития нейтропении у доношенных новорожденных
Интерлей-кин/Cutoff Чувствительность, % Специфичность, % Точность, % ПЦП, % ПЦО, % ПЦТ, %
Г-КСФ/ 1556 пкг/мл 85,1 75,6 79,6 71,8 87,5 84
sFAS/ 5870 пкг/мл 69,5 74,4 71,9 74,4 60,4 80
ФРФ/ 25,7 пкг/мл 68 82 74,4 82 61 85
ИЛ8/ 355 пкг/мл 78 82 80 82 61 85,9
NO/20,1 Мкмоль/л 68 84 84 69 75 86,6
CD95/ 5,0 % 75 99 86,2 79 85 88,5
Апоптоз поздний/ 0,56 % 94,1 98 85,3 89,1 94,1 86,5
Апоптоз ранний/ 9,59 % 82 93 74 87 72 74
Литература
1. Антонов А.Г. и др. // Метод. рекомендации. М., 2002. С. 14-18.
2. Антонов А.Г. и др. // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2005. Т. 4. № 5-6. С. 113-115.
3. Дементьева Г.М., Рюмина И.И., Кушнарева М.В. // Пульмонология. 2002. № 12. C. 6-12.
4. Володин Н.Н., Дегтярева М.В. Справочник по иммунотерапии. СПб., 2002. C. 25, 28, 29.
5. Christensen R.D. Hematologic Problems of the Neonate. Philadelphia, 2000. P. 117-136.
6. Rodwell R.L. et al. // Pediatr. Inf. Dis. J. 1993. Vol. 12. P. 372-376.
7. Manroe B.L. et al. // J. Pediatr. 1979. Vol. 95. P. 89-98.
8. Рева Г.В., Матеева Н.Ю., Петрова Н.А. // Int. J. Interore-hab. 2001. Vol. 3. № 1. Р. 82.
9. Чередеев А.Н., Ковальчук Л.В. // Клин. лаборат. диагн. 1997. № 7. С. 31-35.
10. Железнякова Г.Ф. и др. // Иммунопатология, аллергия, инфектология. 2000. № 4. С. 87-90.
11. Baran J. et al. // Infect. Immun. 2001. Vol. 69. № 3. P. 1287-1297.
12. Володин Н.Н. и др. // Int. J. on Immunolrehabililation. 2000. Vol. 2. № 1. Р. 175-185.
13. Nagata S. // Cell. 1997. Vol. 88. P. 355-365.
25 сентября 2006 г.
Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии
УДК 612.017 1:616.9+612-053.31
РОЛЬ ИНТЕРЛЕЙКИНОВ ПРИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У ДЕТЕЙ ПЕРВЫХ МЕСЯЦЕВ ЖИЗНИ
© 2006 г. Л.В. Кравченко
Clinical and laboratory examination of the 32 newborn with risk of an intrauterin infection were done. A cytomegaloviral infection (CMVI) was determined in 20 newborns and besides the manifestation of the diseаse came in age 1 or 3 monthes. Hard form of the CMVI and mortal result were absent among ill children.This fact was accounted for effective of infectious protection and was displayed by the significant increase a level of the IL-2, IL-4 in cord blood in group children with CMV I.
Врожденная цитомегаловирусная инфекция в большинстве случаев протекает субклинически, и только у 5-10 % детей при рождении обнаруживаются признаки заболевания. Клиническая диагностика ци-томегалии затруднена в связи с выраженным поли-
морфизмом заболевания [1]. Дети, инфицированные цитомегаловирусами, даже при отсутствии у них клинических проявлений, нуждаются в длительном наблюдении. Цитомегаловирусная инфекция, протекающая бессимптомно для матери, нередко вызывает
