CC BY
13
Обоснование назначения человеческого рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора новорожденным с респираторным дистресс-синдромом
М.Г. Пухтинская, В.В. Эстрин
Criteria for the use of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor in neonates with respiratory distress syndrome
M.G. Pukhtinskaya, V.V. Estrin
Ростовский НИИ акушерства и педиатрии
Целью исследования стало определение иммунологических критериев назначения человеческого рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора новорожденным с респираторным дистресс-синдромом, находящимся на искусственной вентиляции легких. У 64 новорожденных при поступлении определяли: уровень гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, фактора роста фибробластов, антиапоптогенного фактора, фактора некроза опухоли, интерлейкинов -6, -8, -4, -1, субпопуляционный состав лимфоцитов. Сделан вывод, что критериями для назначения препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора являются снижение его эндогенного уровня ниже 1556 пкг/мл и увеличение содержания лимфоцитов, находящихся в раннем и позднем апоптозе, более 9,5 и 0,56% соответственно. Необходимо проведение рандомизированных исследований использования у новорожденных человеческого рекомбинантного гранулоцитарного колониестиму-лирующего фактора до развития нейтропении.
Ключевые слова: новорожденный, сепсис, нейтропения, цитокины, апоптоз.
The purpose of the study was to define immunological criteria for the use of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (GCSF) in ventilated newborn babies with respiratory distress syndrome. The levels of GCSF, fibroblast growth factor, anti-apoptogenic factor, tumor necrosis factor, interleukins (IL)-6, IL-8, IL-4, and IL-1, and the subpopulation structure of lymphocytes were determined in 64 neonates on admission. It is concluded that the criteria for the use of GCSF are a less than 1556 pg/ml decrease in its endogenous level and above 9,5 and 0,56% increases in early and late apoptotic lymphocytes, respectively. It is necessary to conduct randomized studies of recombinant human GCSF in the newborn until neutropenia develops.
Key words: neonatal infant, sepsis, neutropenia, cytokines, apoptosis.
Высокий уровень бактериальных осложнений у новорожденных с респираторным дистресс-синдромом, находящихся на искусственной вентиляции легких, определяет необходимость совершенствования методов профилактики и терапии сепсиса [1—3]. Известно, что развитие нейтропении у пациентов с респираторной поддержкой служит ранним симптомом присоединения бактериальных осложнений [4, 5]. В этой связи представляет большой научный и практический интерес использование с целью коррекции нейтропении у новорожденных с респираторным дистресс-синдромом, получающих искусственную вентиляцию легких, человеческого рекомбинантного гранулоцитарного колониести-
© М.Г. Пухтинская, В.В. Эстрин, 2010 Ros Vestn Perinatol Pediat 2010; 5:17-20
Адрес для корреспонденции: Пухтинская Марина Гаевна — к.м.н., ст.н.с.
отдела анестезиологии и реаниматологии Ростовского НИИ акушерства и педиатрии
Эстрин Владимир Владимирович — д.м.н., проф., рук. отдела анестезиологии и реаниматологии 344012 Ростов-на-Дону, ул. Мечникова, д. 43
мулирующего фактора. О его возможном применении впервые сообщили Е. GШan и соавт. в 1994 г. [6]. В этом исследовании снижение числа заболевших сепсисом было достигнуто благодаря способности данного фактора повышать уровень зрелых активных нейтрофилов в периферической крови.
Анализ результатов опубликованных рандомизированных исследований свидетельствует о безопасности использования указанного фактора у новорожденных с респираторным дистресс-синдромом. Однако некоторые исследователи не подтверждают эффективность этого препарата [7—13]. В представленных исследованиях критерием для его назначения новорожденным служило снижение количества ней-трофилов менее 1500 в 1 мм3 [7—13]. Очевидно, что нейтропения такого уровня может ассоциироваться с полным истощением резервов иммунной системы пациента. В этой ситуации назначение человеческого рекомбинантного гранулоцитарного колониестиму-лирующего фактора с целью увеличения количества зрелых активных нейтрофилов может оказаться неэффективным. Кроме того, время ожидания разви-
тия нейтропении остается безвозвратно потерянным. В связи с этим целью настоящего исследования явилось определение иммунологических критериев назначения данного фактора, основанное на изучении иммунопатогенеза развития нейтропении у новорожденных с респираторным дистресс-синдромом, находящихся на искусственной вентиляции легких.
характеристика детей и методы
исследования
С одобрения локального этического комитета и письменного согласия родителей каждого пациента нами было проведено клиническое исследование, в которое вошли 64 новорожденных с респираторным дистресс-синдромом, поступивших в реанимационное отделение в тяжелом состоянии и находившихся на искусственной вентиляции легких. Дети родились в срок гестации 39±2,1 нед, массой тела 3700±565 г, с оценкой по шкале Апгар 3,2±1,6 балла, от матерей в возрасте 26±7,4 года с отягощенным акушерским анамнезом. Тяжесть состояния новорожденных была обусловлена дыхательной недостаточностью: гипоксемия (p02<50 мм рт.ст.), ги-перкапния (рСО2>45 мм рт.ст.), выраженный ацидоз (pH капиллярной крови <7,25). Все дети были переведены на искусственную вентиляцию легких в родильном зале и транспортированы в отделение реанимации в первые часы жизни (3±0,9 ч).
При поступлении, помимо стандартного обследования, у пациентов определяли плазменный уровень интерлейкинов -6, -8, -4, -1, фактора некроза опухоли, эндогенного гранулоцитарного колониестиму-лирующего фактора, фактора роста фибробластов, антиапоптогенного фактора методом иммунофер-ментного анализа на многофункциональном программируемом счетчике для иммунологических исследований с программным обеспечением (Victor, Финляндия). Использовалась тест-система фирмы Cytimmune sciences inc. (США) и Bender MedSystems GmbH (Австрия, Вена). Определяли субпопуляцион-ный состав лимфоцитов крови методом однопараме-трического иммунофенотипирования, используя реагенты фирмы Immunotech Beckman Coulter (США). Кроме того, определяли процентное количество лимфоцитов, находящихся в раннем и позднем апоптозе, с помощью антител к аннексину и прокрашивания пропидием йодида, с учетом результатов на проточном цитометре Beckman Coulter Epics XL (США) при использовании стандартных протоколов. Пул лейкоцитов крови выделяли лизирующим раствором OptiLyse C Beckman Coulter (США) по прилагаемому протоколу.
Ретроспективно все пациенты были разделены на две группы. У 30 детей (1-я группа) на 3—4-е сутки пребывания в отделении в гемограмме наблюдалось снижение абсолютного числа нейтрофилов (<2000 в 1 мм3).
У 34 новорожденных (2-я группа) количество нейтрофилов в периферической крови не снижалось.
Результаты исследования оценивались методом вариационной статистики. Достоверность различия отдельных выборок определялась с использованием непараметрического критерия Вилкоксона. Абсолютный и относительный риск развития неонатально-го сепсиса и летального исхода оценивался методом четырехпольных таблиц. Достоверность полученных результатов определялась критерием Гехана-Вилкок-сона. Достоверность предположений подтверждена посредством использования точного теста Фишера-Ирвина при 5% уровне значимости в отношении двусторонней альтернативы. Статистическая мощность исследования составила 80% (а<0,05). Использовались программы Excel-2000, «Мегастат», Statistica-6.
результаты и обсуждение
У 26 из 30 детей с нейтропенией (1-я группа) на 5-6-е сутки пребывания в отделении был диагностирован неонатальный сепсис. Летальный исход в этой группе был зарегистрирован у 11 новорожденных, из них 8 умерли от неонатального сепсиса. Представленные показатели статистически значимо превышали аналогичные во 2-й группе (р<0,05), где только у 5 из 34 новорожденных респираторный дистресс-синдром осложнился развитием сепсиса. Летальный исход во 2-й группе отмечен у 6 детей, из них от септической инфекции умер 1 ребенок.
В нашем исследовании основанием для постановки клинического диагноза «сепсис» служило сочетание не менее двух симптомов системной воспалительной реакции организма с наличием любого гнойно-воспалительного очага, или с положительной гемокультурой, или с наличием клинических симптомов инфекции [14]. У всех пациентов с неонатальным сепсисом в случае летального исхода клинический диагноз был подтвержден при патологоанатомиче-ском исследовании.
У детей с нейтропенией (1-я группа) при поступлении в отделение регистрировался статистически значимо более низкий уровень эндогенного грануло-цитарного колониестимулирующего фактора, фактора роста фибробластов и антиапоптогенного фактора по сравнению с новорожденными без нейтропении (2-я группа). Кроме того, у детей 1-й группы определялось статистически значимое повышение уровня стволовых клеток (CD34) и лимфоцитов, готовых к апоптозу (CD95) и находящихся в раннем и позднем апоптозе (табл. 1). Остальные иммунологические показатели у пациентов обеих групп статистически значимо не различались.
Для каждого из представленных критериев была построена характеристическая ROC'-кривая с опре-
* Receiver Operator Characteristic.
Пухтинская М.Г., Эстрин В.В. Обоснование назначения человеческого рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего...
Таблица 1. Иммунологические показатели крови, статистически значимо различающиеся при поступлении у пациентов с развившейся в последующем нейтропенией и без нее
Показатель 1-я группа (медиана) (n=30) 2-я группа (медиана) (n=34) р
CD34, % 0,3 0,1 0,017794
Г-КСФ, пг/мл 995 1600 0,000000
sFas, пг/мл 5927,1 7319,7 0,004788
ФРФ, пг/мл 20,0 34,9 0,029117
СD95, % 9,2 1,9 0,000482
Лимфоциты с маркерами раннего апоптоза, % 13,5 12,3 0,036122
Лимфоциты с маркерами позднего апоптоза, % 1,99 0,3 0,006958
Примечание.* — Здесь и в табл. 2: Г-КСФ — эндогенный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор; sFas — антиапоптоген-ный фактор; ФРФ — фактор роста фибробластов.
делением числового значения (точки «cutoff»), позволяющего диагностировать развитие нейтропении с высокой чувствительностью, специфичностью и точностью. В табл. 2 представлены данные расчета диагностической значимости изучаемых тестов. Полученные результаты подтвердили, что у пациентов с нейтропенией неонатальный сепсис осложнял течение основного заболевания в 5 раз чаще, чем у детей без нейтропении. Кроме того, летальный исход заболевания в этой группе отмечался в 8 раз чаще.
Статистически значимое повышение процентного содержания плюрипотентной гемопоэтической стволовой клетки (CD34) у пациентов 1-й группы не позволяло избежать развития нейтропении. Стволовые клетки не реализовались в зрелые нейтрофилы, возможно, по причине недостаточного синтеза эндогенного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, являющегося физиологическим колоние-образующим регулятором нейтрофилов [9, 10]. Не случайно в нашем исследовании уровень данного фактора у пациентов 1-й группы был почти в 2 раза ниже, чем во 2-й группе.
Полученные результаты подтвердили, что у детей с развившейся в последующем нейтропенией уже при поступлении в отделение превалировали процессы альтерации иммунокомпетентных клеток над процессами пролиферации. Так, плазменный уровень антиапоптогенного фактора и пролиферативного фактора роста фибробластов, участвующих в регуляции процесса естественной гибели клеток [12—15], был статистически значимо ниже в данной группе по сравнению со 2-й группой. На этом фоне вполне закономерным было обнаружение у пациентов 1-й группы высокого процента лимфоцитов, находящихся в раннем и позднем апоптозе.
Таким образом, на основании результатов проведенного исследования было сделано заключение, что развитие нейтропении у новорожденных с респираторной патологией обусловлено дефицитом эндогенного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора при достаточном уровне стволовых клеток (СD34) и увеличением числа лимфоцитов, вступивших в ранний и поздний апоптоз. Снижение уровня эндогенного гранулоцитарного колониестимулирую-
Таблица 2. Диагностическая значимость иммунологических критериев, прогнозирующих развитие нейтропении у новорожденных с респираторным дистресс-синдромом, находящихся на искусственной вентиляции легких (в%)
Показатель/СиЮГ Чувствительность Специфичность Точность ПЦП ПЦО ПЦТ
Г-КСФ/1556 пг/мл 85,1 75,6 79,6 71,8 87,5 84
sFas/5870 пг/мл 69,5 74,4 71,9 74,4 60,4 80
ФРФ/25,7 пг/мл 68 82 74,4 82 61 85
CD95/5,1% 75 68 86,2 79 65 78,5
Лимфоциты с маркерами 94,1 98 85,3 89,1 94,1 86,5
позднего апоптоза/0,56%
Лимфоциты с маркерами 82 93 74 87 72 74
раннего апоптоза/9,59%
Примечание.* — ПЦП — предсказательная ценность позитивного результата теста (чувствительность); ПЦО — предсказательная ценность отрицательного результата теста (специфичность); ПЦТ — предсказательная ценность теста.
щего фактора и усиление апоптоза лимфоцитов крови с высокой точностью, чувствительностью и специфичностью прогнозирует развитие нейтропении. Назначать человеческий рекомбинантный грануло-цитарный колониестимулирующий фактор новорожденным с респираторным дистресс-синдромом, находящимся на искусственной вентиляции легких, следует при снижении плазменного уровня указанно-
го фактора ниже 1556 пг/мл и увеличении содержания лимфоцитов, находящихся в раннем и позднем апоп-тозе, более 9,5 и 0,56% соответственно. Необходимо проведение рандомизированных исследований по эффективности и безопасности использования данного препарата у новорожденных с респираторным дистресс-синдромом, получающих искусственную вентиляцию легких, до развития у них нейтропении.
ЛИТЕРАТУРА
1. Антонов А.Г., Володин Н.Н, Гребенников В.А. и др. Принципы ведения новорожденных с респираторным дистресс-синдромом / Метод. рекомендации. М., 2002. С. 14—18.
2. Белушкина Н.Н, Хасан Хамад Али, Северин С.Е. Молекулярные основы апоптоза // Вопр. биол. мед. фарм. химии. 1998. № 4. С. 15—23.
3. Бочоришвили В.Г. Новая иммунологическая концепция сепсиса и ее клиническое значение // Межд. журн. им-мунореабилитации. 1997. № 6. C. 42—51.
4. Галактионов В.Г. Иммунология. М.: Изд-во МГУ, 1998. 479 с.
5. Дементьева Г.М. Пульмонологические проблемы в нео-натологии // Пульмонология. 2002. № 12. C. 6—12.
6. Gillan E.R., Christensen R.D., Yu Suen et al. A randomized, placebo — controlled trial of recombinant human granulocyte colony — stimulating factor administration in newborn infants with presumed sepsis: significant induction of peripheral and bone marrow neutrophilia // Blood. 1994. Vol. 84. P. 1427— 1433.
7. Bronchud M.H., Potter M.R., Morgenstern G. et al. In vitro and in vivo analysis of the effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor in patients // Br. J. Cancer. 1988. Vol. 58. P. 64—69.
8. Cairo M.S., Christensen R, Sender L.S. et al. Results of a phase I/II trial of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in very low birthweight neonates: significant induction of circulatory neutrophils, monocytes,
platelets, and bone marrow neutrophils // Blood. 1995.Vol. 86. P. 2509—2515.
9. Chang Z.S., Zeng L.B, Chang C.S, Qing W.W. Aggregate formation of hepatitis B virus X protein affects cell cycle and apoptosis // World J. Gastroenterol. 2003. Vol. 9. P. 1521—1524.
10. Gessler P., Luders R., Konig S. et al. Neonatal neutropenia in low birthweight premature infants // Am. J. Perinatol. 1995. Vol. 12. P. 34—38.
11. Gillan E.R., Christensen R.D., Yu Suen et al. A randomized, placebo — controlled trial of recombinant human granulocyte colony — stimulating factor administration in newborn infants with presumed sepsis: significant induction of peripheral and bone marrow neutrophilia // Blood. 1994. Vol. 84. P. 1427—1433.
12. Manroea B.L., Weinberg A.G., Rosenfeld C.R., Browne R. The neonatal blood count in health and disease. I. Reference values for neutrophilic cells // J. Pediat. 1979. Vol. 95. P. 89—98.
13. Schibler K, Osbome K, Leung L. et al. A randomized, placebo— controlled trial of granulocyte colony — stimulating factor administration to newborn infants with neutropenia and clinical signs of early — onset sepsis // Pediatrics. 1998. Vol. 102. P. 6—13.
14. Исаков Ю.Ф, Белобородова Н.В. Сепсис у детей. М.: Изд. Мокеев, 2001. C. 44—45.
15. Эстрин В.В., Ефанова Е.А., Пухтинская М.Г. Профилактика и терапия бактериальных осложнений рекомби-нантным гранулоцитарным колониестимулирующим фактором у новорожденных в критических состояниях. Ростов-на-Дону: Изд. Феникс, 2007. С. 64—91.
Поступила 21.01.10
