Продукция прои противовоспалительных цитокинов у больных, перенесших посттравматические операции на селезенке Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

Сер. 11. 2007. Вып. 2

УДК 612. 017: 616.411 - 089.87 И.Е. Павлова

ПРОДУКЦИЯ ПРО- И ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ У БОЛЬНЫХ, ПЕРЕНЕСШИХ ПОСТТРАВМАТИЧЕСКИЕ ОПЕРАЦИИ НА СЕЛЕЗЕНКЕ

Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии, Санкт-Петербург

Известно, что один из периферических органов иммунной системы - селезенка является местом распознавания антигенов, циркулирующих в периферической крови, и развития специфического иммунного ответа [1]. До недавнего времени при травмах селезенки у здоровых лиц ее удаляли, считая, что этот орган не является жизненно важным, а его функции могут частично взять на себя другие периферические органы иммунной системы. Однако оказалось, что спленэктомия является иммунокомпрометирующей операцией и приводит к развитию вторичной иммунной недостаточности, которая может сохраняться на протяжении длительного времени и проявляться умеренным дефицитом иммунокомпетентных клеток [2-5]. В настоящее время установлено, что эффекторные и ре- гуляторные функции иммунной системы опосредованы многочисленными секретируемыми иммунокомпетентными клетками молекулами цитокинов, представляющих собой группу полипептидных медиаторов, участвующих в формировании и регуляции защитных реакций организма [6-8]. Поэтому представляет существенный интерес изучение способности иммунокомпетентных клеток к продукции провоспалительных и противовоспалительных цитокинов у больных, перенесших частичное или радикальное удаление селезенки.

Целью настоящей работы явилось изучение влияния спленэктомии или резекции части органа, выполненных у пациентов в связи с травмой, на продукцию провоспали- тельных (ИНФ-у, ИЛ-ф, ИЛ-6, ИЛ-2, ФНОа) и противовоспалительных (ИЛ-4) цитокинов иммунокомпетентными клетками периферической крови.

Материалы и методы исследования. Обследовано 32 пациента с травмой селезенки, из которых 27 больных перенесли спленэктомию (1-я группа), а пятерым были выполнены органосохраняющие операции селезенки: спленоррафия и аутотрансплантация ткани органа (2-я группа). Возраст обследованных - от 12 до 37 лет. Изучение иммунного статуса проводили через различные сроки - от 1 до 9 лет - после оперативного вмешательства. Ни один из пациентов на момент обследования жалоб не предъявлял, симптомов острого или хронического воспаления у них не выявлено. Результаты, полученные при обследовании больных, перенесших операции на селезенке, сопоставляли с данными контрольной группы, представленной здоровыми жителями Санкт-Петербурга (30 человек).

Для наиболее полной и адекватной оценки цитокинпродуцирующей способности мононуклеаров определяли спонтанную и стимулированную способность лимфоцитов периферической крови к синтезу цитокинов ИНФ-у, ИЛ-10, ИЛ-6, ИЛ-2, ИЛ-4, ФНОа. Для стимуляции продукции ИЛ-10 и ФНОа использовали раствор пирогенала © И.Е. Павлова, 2007

(липополисахарид Pseudomonas aeruginosa - ЛПС) в дозе 0,1 мкг/лунку, для ИНФ-у, ИЛ-6, ИЛ-2, ИЛ-4 - фитогемагглютинин (ФГА) в дозе 10 мкг/2х105 клеток.

Исследование проводили в два этапа. На первом этапе выделенные в стерильных условиях на градиенте плотности «Лимфолит-Н» мононуклеарные клетки в концентрации 2х10 /мл культивировали в течение 24 ч при 37 °С и добавлении 5 % СО2 в 96-луночных иммунологических планшетах. Количество клеток составляло 2x10 на лунку. Для культивирования использовали среду RPMI с добавлением 10 %-ной эмбриональной телячьей сыворотки. Мононуклеары культивировали без индуктора (спонтанная продукция) и с индуктором (стимулированная продукция). Все пробы ставили в триплетах. После завершения культивирования супернатанты клеток отбирали с помощью автоматической пипетки для последующего анализа.

На втором этапе определяли уровень цитокинов в супернатантах клеток. Определение концентрации ИНФ-у, ИЛ-10, ИЛ-6, ИЛ-2, ИЛ-4, ФНОа проводили с помощью стандартного метода твердофазного иммуноферментного анализа, используя специфические тест-системы (фирма «Протеиновый контур»).

Индекс стимуляции, показывающий, во сколько раз усиливается цитокинпродуци- рующая активность клеток в ответ на стимулятор, рассчитывали как отношение стимулированной продукции к спонтанной продукции каждого цитокина.

Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью программы «Microsoft Excel», версия 7.0 для Windows 98. Достоверность различий между сравниваемыми выборками оценивали с использованием параметрического критерия Стьюдента t.

Результаты и их обсуждение. Полученные при изучении продукциии провоспа- лительных цитокинов иммунокомпетентными клетками результаты весьма различались в группах обследованных. Как видно из данных, представленных в табл. 1, у больных, перенесших спленэктомию, значительно повышена по сравнению с контрольной группой спонтанная продукция ИНФ-у, при этом наблюдается тенденция к снижению стимулированной продукции ИНФ-у мононуклеарами периферической крови. В обеих группах больных наблюдается повышенная спонтанная и стимулированная продукция ИЛ-2, ИЛ-6, ФНОа (см. табл. 1, табл. 2). Следует отметить, что наиболее значимые отклонения от показателей контрольной группы установлены при исследовании спонтанной продукции ИЛ-6. При этом индексы стимуляции для ИНФ-у, ИЛ-6, ФНОа, показывающие, во сколько раз усиливается цитокинпродуцирующая активность клеток в ответ на стимулятор, были значительно снижены. Соотношение спонтанной и стимулированной продукции ИЛ -2 в обследованных группах больных не отличалось от этого в контрольной группе (индекс стимуляции в группах 1 и 2 составил соответственно 1,6±0,9 и 2,1±1,1, в контрольной группе - 1,8±0,8). При изучении продукции ИЛ-1 установлено, что у пациентов как 1-й, так и 2-й группы имеется тенденция к повышению спонтанной продукции, а стимулированная продукция этого цитокина достоверно снижена (см. табл. 2). Индекс стимуляции в обеих группах был существенно снижен по сравнению с контрольной группой и составлял в 1-й группе больных - 1,9±0,9, во 2-й - 2,2±0,87, при нормальных значениях 23,6±1,75.

Выявленные нарушения продукции провоспалительных цитокинов свидетельствуют о том, что у больных, перенесших спленэктомию или операции, следствием которых явилось значительное сокращение ткани селезенки, имеется передсуществующая активация иммунокомпетентных клеток периферической крови, приводящая к усилению их способности спонтанно вырабатывать провоспалительные цитокины (ИНФ-у, ИЛ-1 ИЛ-2,

ИЛ-6, ФНОа). В то же время это сопровождается сниженной реактивностью клеток, что выражается в нарушении способности реагировать усилением выработки цитокинов в ответ на стимуляцию.

Таблица 1

Способность иммунокомпетентных клеток периферической крови к продукции провоспалительных цитокинов ИНФ-у и ИЛ-2*

Группы сравнения Продукция ИНФ-у, пкг/мл Индекс стим. Продукция ИЛ-2, пкг/мл Индекс стим.

Спонт. Стимул. Спонт. Стимул.

Спленэктомия (1), п=27 177,2± 25,0* 224,8 ±98,0 1,47±0,8* 11,3±0,7* 13,7±1,0* 1,6±0,9

Органосохраняющая операция (2), п=5 Не опр. Не опр. Не опр. 15,4± 0,38* 29,1± 2,81* 2,1 ±1,1

Контрольная группа (3), п=10 41,8±16,7 1095±75, 8 35,7±10,8 5,83±0,9 6,9±1,6 1,8±0,8

Р (1-3) <0,05 >0,05 <0,05 <0,05 <0,05 >0,05

Р (2-3) - - - <0,05 <0,05 >0,05

* Здесь и в табл. 2: различие достоверно по сравнению с контрольной группой.

Способность иммунокомпетентных клеток периферической крови к продукции провоспалительных цитокинов ИЛ-1р, ИЛ-6, ФНОа

Таблица 2

Группы сравнения Продукция ИЛ-ip, пкг/мл Индекс стим. Продукция ИЛ-6, пкг/мл Индекс стим. Продукция ФНОа, пкг/мл Индекс стим.

Спонт. Стимул. Спонт. Стимул. Спонт. Стимул.

Спленэктомия (1), п=27 209,7± 46,4 364,5± 52,0* 1,9 ± 0,9* 1032,0 ± 63,2* 1374,4 ± 31,04* 3,7 ± 1,2* 177,5 ± 15,6* 328,1 ± 16,9* 3,9 ±1,7

Органосохраняю-щая операция (2), п =5 101,0± 61,7 221,0± 110,0* 2,2 ± 0,9* 1051,3 ± 273,4* 1477,5 ± 95,20* 4,5 ± 1,6* Не опр. Не опр. Не опр.

Контрольная группа (3), п=10 32,3± 14,1 764,6± 105,0 23,6 ± 1,8 51,0 ± 15,5 1063,6 ± 68,80 50,1 ± 20,7 43,6 ± 23,0 1099,5 ± 197,1 53,7 ± 12,1

Р (1-3)~ - <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05

Р (2-3) - <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 - - -

Изучение продукции иммунокомпетентными клетками периферической крови противовоспалительного цитокина - ИЛ-4 (табл. 3) у больных, перенесших посттравматические операции на селезенке, показало, что как после спленэктомии, так и после органосохраняющих операций наблюдается значительное снижение как спонтанной, так и стимулированной способности иммунокомпетентных клеток продуцировать ИЛ-4. Соотношение спонтанной и стимулированной продукции ИЛ-4 в обследованных группах больных при этом не отличалось от контрольных значений (индекс стимуляции в 1-й и 2-й группах больных составил соответственно 2,1±0,9 и 1,7±1,1, в контрольной группе - 2,8±0,6).

Способность иммунокомпетентных клеток периферической крови к продукции противовоспалительного цитокина ИЛ-4

_Таблица 3

Группы сравнения Продукция ИЛ-4, пкг/мл Индекс стим.

Спонтанная Стимулированная

Спленэктомия (1), n=27 16,3±0,6 34,0±3,03 2,1±0,9

Органосохраняющая операция (2), n=5 22,0±0,5 38,0±1,03 1,7±1,1

Контрольная группа (3), n=10 56,2±17,9 127,22±28,7 2,8±0,6

p (1-3) <0,05 <0,05 >0,05

р (2-3) <0,05 <0,05 >0,05

Таким образом, нами установлено, что удаление или уменьшение количества ткани селезенки в результате травмы этого органа и последующего оперативного лечения приводит к целому ряду нарушений цитокинпродуцирующей способности иммунокомпетентных клеток периферической крови. Повышенная способность клеток иммунной системы спонтанно продуцировать провоспалительные цитокины сопровождается сниженной реактивностью этих клеток, что выражается в нарушении их способности реагировать усилением выработки цитокинов в ответ на неспецифический стимул. При этом способность иммунокомпетентных клеток периферической крови продуцировать противовоспалительные цитокины как спонтанно, так и после стимуляции значительно снижена.

Дисбаланс цитокинпродуцирующей способности иммунокомпетентных клеток периферической крови, развивающийся после операций, приводящих к сокращению ткани селезенки, и сохраняющийся на протяжении длительного времени (до 9 лет), несомненно, оказывает существенное влияние на эффекторные и регуляторные функции клеток иммунной системы и приводит к развитию вторичной иммунной недостаточности.

Summary

Pavlova l.E. Production of pro- and antiinflammatory cytokines in patients, who underwent surgical operations on spleen after trauma.

The capacity of immunocompetent cells to produce proinflammatoty and anti-inflammatory cytokines in patients, who underwent surgical operations on spleen, is studied. It is shown, that the decrease of splenic tissue as a result of its traumatic lesion and surgical treatment leads to the development of dysbalance of cytokine- producing ability of peripheral blood immunocompetent cells. Increased capacity of cells to spontaneously produce proinflammatory cytokines is accompanied by decreased reactivity of these cells, which manifests as disturbed ability to react by increase of synthesis of above mentioned cytokines as a response to non-specific stimuli. At the same time, capacity of peripheral blood mononuclear cells to produce antiinflammatory cytokines both spontaneously and after stimuli, is significantly decreased.

Key words: splenectomy, cytokines.

Литература

1. Кашкин К.П. Иммунная система: морфофункциональная организация периферических лимфоидных органов // Мед. иммунол. 1999. Т. 1. № 1-2. С. 11-16. 2. Павлова И.Е., Орлов М.Н., Бубнова Л.Н., Кар- гин В.Д.Влияние радикальных и органосберегающих операций, выполненных на селезенке, на иммунный

статус пациентов // Матер. науч.-практич. конф. «Актуальные вопросы гематологии и трансфузио- логии». СПб., 2002. С. 256.

3. Шапкин Ю.Г., Киричук В.Ф., Масляков В.В. Иммунный статус в отдаленном периоде у пациентов, оперированных по поводу повреждений селезенки // Хирургия: Журн. им. Н.И. Пирогова. 2006. № 2. С. 14-17.

4. Hathaway J., Harley R., Self S. Immunologycal function in posttraumatic splenosis // J. Clin. Immunol. Immunopathol. 1995. Vol. 74. № 2. P. 143-150.

5. Hansen K., SingerD.B. Asplenic-hyposplenic overwhelming sepsis: postsplenectomy sepsis revisited // Pediatr. Dev. Pathol. 2001. Vol. 4. № 2. P. 105-121.

6. Тотолян А.А., Фрейдлин И.С. Клетки иммунной системы. Т. III-IV. СПб., 2001. 390 с.

7. КозловВ.А. Некоторые аспекты проблемы цитокинов // Цитокины и воспаление. 2002. Т. 1 № 1-2. С. 5-8.

8. СимбирцевА.С. Цитокины - новая система регуляции защитных реакций организма // Там же. С. 9-16.

Статья принята к печати 21 февраля 2007 г.

6