CC BY
10
УДК 619:616.98:579.843.95-07:57.083.3
Мельник В.В., к. вет. н., доцент (volde-mar@ukr. net) Ткаченко В.В., асистент ® Нацюнальний утверситет 6iopecypcie i природокористування Украши, м. Кигв
ВИГОТОВЛЕННЯ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО СПЕЦИФ1ЧНОГО АНТИГЕНУ Р. MULTOCIDA ДЛЯ ПОСТАНОВКИ 1МУНОФЕРМЕНТНОГО
АНАЛ1ЗУ
У cтаттi наведет результати до^дження щодо метoдie еиготоелення cпецифiчнoгo антигену Р. multocida, а також встановлеш оптимальн титри отриманого антигену для експериментальног постановки iмyнoферментнoгo аналiзy. Доведено, що быьш активним виявився антиген, отриманий методом спиртового осадження, оптимальне розведення якого для постановки 1ФА становило 1:400.
Ключовi слова: Pasteurella multocida, пастерельоз, антиген, iмyнoферментний аналiз.
Вступ. Незважаючи на значну кшькють лжувальних та профшактичних 3aco6iB, етзоотична ситуащя в свт з пастерельозу тварин була i залишаеться досить складною. Серед збудниюв пастерельозу основними е два види бактерш: P.multocida i P .haemolytica. При цьому роль P.multocida у виникненш пастерельозу тварин вивчена досить добре хоча не розроблено методiв швидко! дiагностики останньо!. Саме тому, розвиток промислового тваринництва вимагае оцшки етзоотично! ситуаци шляхом проведення мошторингу iнфекцiйних хвороб тварин i, зокрема, пастерельозу [1, 2].
Безумовно, розвиток сучасно! бютехнологи закономiрно супроводжуеться появою нових методiв щентифжаци чужорiдних бiологiчних агентiв у макрооргашзм^ Так, пошуки простих чутливих методiв виявлення i кiлькiсного визначення антигешв i антитiл без застосування аглютинаци i радiоактивних позначок призвели до розробки твердофазного iмуноферментного аналiзу ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), який ниш е одним iз найбшьш розповсюджених методiв дослiдження [3, 4].
В основi 1ФА лежить специфiчна взаемодiя антитiла i антигену з наступним приеднанням до отриманого комплексу кон'югату (антивидового iмуноглобулiну, позначеного ферментом). Фермент викликае розкладання хромогенного субстрату з утворенням забарвленого продукту [4, 5]. Зважаючи на це, важливим етапом створення 1ФА^агностикуму е виготовлення якiсного специфiчного антигену, що й стало метою проведених дослщжень.
Мета та завдання. Провести дослщження за розробки експериментального зразку антигену для проведення iмуноферментного аналiзу при пастерельозi викликаного P. multocida.
® Мельник В.В., Ткаченко В.В., 2011
Матер1али i методи дослщження. У проведених дослiдженнях при розробщ експериментального зразку антигену для проведения iмуноферментного аналiзу нами був використаний антиген лшополкахаридно! природи. Видшення антигену проводили двома методами - шляхом осадження ПЕГ (полiетиленглiколем) та спиртовим осадженням.
Метод отримання антигену шляхом осадження ПЕГ включав дворазове центрифугування бактершно! суспензи в фiзiологiчному розчинi з наступним ресуспендуванням осаду в карбонатно-бкарбонатному буферному розчинi. Потiм, на льодовш банi, проводили ультразвукову обробку бактершно! суспензи за допомогою апарату УЗДН-2Т при 22000 Hz впродовж 10 хвилин. Суспензш центрифугували 30 хв. при 8000 об/хв. В надосадову рiдину додавали ПЕГ до концентраци 14 % i помiщали на двi доби при постшному помiшуваннi в холодильник (t+4 С). Отриману суспензiю центрифугували, повторно ресуспендували в розчинi ПЕГ i повторювали центрифугування. Осад розчиняли в 10 мл карбонатно-бжарбонатного буферного розчину.
Метод отримання антигену спиртовим осадженням. Для отримання антигену шактивовану в автоклавi суспензiю бактерiальних кл^ин P. multocida осаджували центрифугуванням, ресуспендували осад у фiзiологiчному розчинi i обробляли ультразвуком на льодовiй баш при 22000 Hz упродовж 10 хвилин. В матерiал вносили водонасичений фенол 1:1 i повторно центрифугували (30 хвилин) при 3000 об/хв. Вщбирали верхню водну фазу, додавали до не! 2 об'еми етанолу та витримували впродовж 12 годин для формування осаду. Центрифугуванням вщдшяли осад i розчиняли у невеликому об'eмi карбонатно-бiкарбонатного буферного розчину.
Матерiал, отриманий обома методами, застосовували в якостi антигену при проведенш 1ФА. Для постановки 1ФА з даними серiями антигену використовували кон'югат на основi рекомбiнантного бшка G Streptococcus spp. у розведенш 1:50000, а також позитивнi та негативш на пастерельоз, викликаний P. multocida, сироватки кров1
Результати дослщжень та 'ix аналiз. Для створення якiсного експериментального антигену з метою проведення iмуноферментного аналiзу нами був обраний антиген, який володie високою активнiстю та специфiчнiстю. При проведенш дослщжень iз бактершно! суспензи двома методами нами було видшено антиген лшополкахаридно! природи.
З метою оцшки якостi антигену, отриманого осадженням ПЕГ, сорбували послiдовнi розведення цього антигену на полiстироловi планшети та ставили 1ФА iз позитивними та негативними на пастерельоз, викликаний P. multocida, сироватками кров1 Як показали результати проведених дослщжень, оптимальним розведення антигену ще! сери е розведення 1:250, оскшьки при подальшому зниженнi концентраци антигену рiзко знижуеться оптична густина позитивно! сироватки. При розведеннi цього виду антигену до 1:400 окремi позитивш сироватки кровi дають сумшвш результати (табл. 1).
Таблиця 1
Результати титрування антигену, отриманого шляхом осадження ПЕГ, _для визначення оптимального розведення у тест-системi_
Оптична густина (ОГ) при 450/620 нм у розведенш
1стинно позитивш сироватки № 1:100 1:150 1:200 1:250 1:300 1:350 1:400
1 2,127 1,951 1,637 1,533 1,211 0,845 0,415
2 1,954 1,745 1,562 1,465 1,099 0,624 0,322
3 2,011 1,811 1,475 1,192 0,612 0,317 0,187
1стинно негативш сироватки 1 0,541 0,373 0,164 0,056 0,38 0,030 0,027
2 0,321 0,286 0,109 0,052 0,044 0,021 0,020
3 0,456 0,269 0,125 0,048 0,41 0,030 0,030
Разом з тим, результати титрування антигену, отриманого спиртовим осадженням, вказують на те, що оптимальне розведення для антигену ще! серп
-♦- Позитивна сироватка -■- Негативна сироватка
Рис.1. Результати титрування антигену, отриманого спиртовим осадженням, для визначення оптимального розведення при постановщ 1ФА
Саме при такому розведенш найвищий коефщент сшввщношення мiж значеннями оптично! густини позитивно! та негативно! до Pasteurella тыЬо^а сироваток кров1 При подальшому розведенш антигену рiзко знижуеться значення оптично! густини позитивно! сироватки.
Висновки
Отже, проведеними дослiдженнями було встановлено, що бiльш активним, в порiвняннi з осадженням ПЕГ, виявився антиген, отриманий методом спиртового осадження. Оптимальне розведення такого антигену для постановки 1ФА становило 1:400.
Перспективою подальших дослщжень е використання отриманих антигешв для дослщження сироваток кровi в 1ФА з метою виявлення антитш до P. multocida, а також створення iмуноферментноl тест-системи, яка може бути використана в якост основного серолопчного тесту при мошторингу пастерельозу рiзних видiв тварин.
Л^ература
1.Adlam C. Pasteurella and Pasteurellosis / C. Adlam, J.M. Ritter - London: Academic Press, 1989. - 262 р.
2.Основш шфекцшш хвороби свиней у сучасних умовах в Укра!ш / [М.В. Бабкш, Е.В. Прохорятова, Н.В. Явшков, О.В. Угодовський] // Ветеринарна медицина. - 2005. - Вип. 85, Т. 1. - С. 98 - 101.
3.Новые методы иммуноанализа: перевод с английского / М. Тертон, Д.Р. Бархем, К.А. Колкотт и др. - М.: Мир, 1991. - 280 с.
4.Теория и практика иммуноферментного анализа / Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. - М.: Высшая школа. - 1991. - 288 с.
5.Синицин В.А. 1муноферментний метод у ветеринарнш медицин / В.А. Синицин // Науковий вкник Нащонального аграрного ушверситету. - 2001. - № 36. - С. 123 - 125.
Summary
Melnyk V.V., candidate of veterinary science, associate professor Tkachenko V.V., assistant National University of Life and Environmental Sciences of Ukraine, Kiev PRODUCTION OF EXPERIMENTAL SPECIFIC ANTIGEN FOR STAGING R.
MULTOCIDA ELISA ANALYSIS
In the articles resulted research results are in relation to the methods of making specific the antigen of P. multocida, and also the optimum titles of the got antigens are set for creation of ELISA. It is rotined that an antigen, got the method of the alcoholic besieging the optimum breeding of which for raising of ELISA was 1:400, appeared more active.
Key words: Pasteurella multocida, pasterelosis, antigen ELISA.
Рецензент - д.вет.н., проф. Гуфрш Д.Ф.
