CC BY
28
Вюник Дшпропетровського унiверситету. Бюлопя, медицина Visnik Dnipropetrovs'kogo universitetu. Seria Biología, medicina Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology, medicine
Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Med. 2014. 5(2), 85-89.
doi:10.15421/021416
ISSN 2310-4155 print ISSN 2312-7295 online
www.medicine.dp.ua
УДК 577.112.85+616-097
Оцшка методiв бюкон'югацп для отримання синтетичних позитивних контролiв для iмуноферментного аналiзу модифжацп «IgM-пастка»
О.Ю. Галин1, Ю.В. Горшунов2
'Нацюналъний mexniHHm утверситет Украти «Кшвсъкий полтехтчнт тститут», Ктв, Украта 2Науково-до^дний та конструкторсъко-технологiчний тститут мюъкого господарства, Кшв, Украта
Запропоновано методолопчний щдхщ до застосування синтетичних позитивних контрол1в в iмуноферментних наборах, побу-дованих за принципом «IgM-пастки», який полягае у використаннi кон'югату нормальних IgM людини та моноклональних антитш до ферменту пероксидази хрону. Для виконання поставленого завдання можливо застосовувати NHS ефiр-малеiмiд-опосередковану кон'югацто, перйодатний i глутаральдегiдний методи бюкон'югацп. Кон'югати нормального IgM людини та моноклональних антитш до пероксидази хрону, отримат за допомогою NHS ефiр-малеiмiд-опосередкованоi кон'югаци та перйодат-ного методу, гомогент за молекулярною масою, натомiсть кон'югат, який синтезуеться глутаральдепдним методом, мiстить що-найменше три групи бiополiмерiв близькоi молекулярноi маси. Синтетичнi позитивнi контролi, отриманi рiзними методами, харак-теризуються вищим титром по^вняно з високотитражною IgM-позитивною сироваткою. Разом iз тим, позитивний контроль, отриманий за допомогою NHS ефiр-малеiмiд-опосередкованоi кон'югаци, характеризуеться найкращим профiлем титрування (повiльнiшим спаданням активностi пiд час iмуноферментного аналiзу при його розведент).
Ключов1 слова: iмуноферментний аналiз; IgM; позитивний контроль; кон'югащя
Evaluation of bio-conjugation methods for obtaining of synthetic positive control for IgM-capture ELISA
O.Y. Galkin1, Y.V. Gorshunov2
'National Technical University of Ukraine "Kyiv Polytechnic Institute", Kyiv, Ukraine 2Research and Technology Institute of Urban Development, Kyiv, Ukraine
The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is the most informative and versatile method of serological diagnostics. The possibility of detecting by ELISA specific antibodies of different classes allow to differentiate primary infectious process and its remission, exacerbation and chronic disease (differential diagnosis). This approach is implemented in the methodology for evaluation of patients for the presence of humoral immune response to TORCH-infections pathogens (toxoplasmosis, rubella, cytomegalovirus, herpes simplex viruses' infections, and some others). Therefore, testing for presence of specific IgG and IgM antibodies against TORCH-infections pathogens in blood serum is an important element of motherhood and childhood protection. The essential problem in the production of IgM-capture ELISA diagnostic kits is obtaining of positive control. The classic version of positive control is human blood serum (plasma) containing specific antibodies. But specific IgM-positive sera are insignificant raw materials. This fact can seriously restrict the production of diagnostic kits, especially in the event of large-scale production. We have suggested the methodological approach to using of synthetic positive controls in IgM-capture ELISA kits based on conjugate of normal human IgM and monoclonal antibodies against horseradish peroxidase. It is found that this task can be fulfilled by means of NHS ester-maleimide-mediated conjugation (by sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-
HaqioHcmbmü mexHWHuü yHieepcumem YKpaïm «KuïecbKuù nonimexmuHm iHcmumym», Knie, Yxpama National Technical University of Ukraine "Kyiv Polytechnic Institute ", Kyiv, Ukraine
Haymeo-öocnidmü ma конструкторсbко-техноnогiцниü iHcmumym мiсbкого господарстeа, Kuïe, YKpaïHa Research and Technology Institute of Urban Development, Kyiv, Ukraine
Tel.: +38-067-2348642. E-mail: [email protected]_
carboxylate), reductive amination-mediated conjugation (by sodium peiiodate) and glutaraldehyde-mediated conjugation. It was found that conjugates of normal human IgM and monoclonal antibodies against horseradish peroxidase obtained using NHS ester-mediated maleimide conjugation and periodate method were similar by molecular weight, whereas conjugate synthesized by glutaraldehyde method comprised at least three types of biopolymers with close molecular weight. It was found that synthetic positive control obtained by different methods was characterized by higher titer compared to IgM-positive high-titer serum. However, positive control obtained by NHS ester-mediated maleim-ide conjugation had the best titration profile characteristics.
Keywords: ELISA; IgM; positive control; conjugation Вступ
Лабораторна дагностика - неввд'емна частина клЫ-чного обстеження пащента, адже без даних лабораторного обстеження неможливе не тшьки встановлення кл> шчного дагнозу, а i контроль за ефектившстю та безпе-кою терапевтичних заходiв (Zupanec, 2005). Серед усьо-го комплексу метода ктшчно! лабораторно! дагности-ки важливе мiсце поодають серологiчнi методи, засно-ванi на виявленнi серолопчних маркерiв (ангигенiв, але-ргешв, антитш) iнфекцiйних ^русних, бактерiальних, грибкових i паразитарних) та неiнфекцiйних (у т. ч. ауто-iмунних, алергiчних, ендокринних та онколопчних) за-хворювань. Найшформативтшим унiверсальним та, як наслвдок, поширеним методом серологiчних дослвджень е iмуноферменгний анал1з (1ФА) (Galkin, 2014). Можли-вiсть виявлення за допомогою 1ФА специфiчних ангигiл рiзних клас1в дозволяе диференщювати первинний шфе-кцiйний процес i його ремiсiю, загострення чи хрошза-цш захворювання, тобто проводити диференцiальну дiагностику. Такий тдхвд реал1зуеться у методологй' обстеження пацiентiв на наявтсть гуморально! iмунноl вiдповiдi на збудниюв TORCH-iнфекцiй (токсоплазмоз, краснуха, цитомегалы, шфекцй, викликанi вiрусами простого герпесу, та деяю iншi), яш здатнi внутршньоутро-бно iнфiкувати плвд та спричиняти формування вад роз-витку (Senchuk and Dubossarskaja, 2004). Саме тому тес-тування на наявтсть специфiчних антитш класу IgG та IgM до збудниюв TORCH--шфекщй е важливим елемен-том у систем охорони матерi та дитини.
За наявними л1тературними даними (Holmes et al., 2005; Vazquez et al., 2007; Hunsperger et al., 2009), пере-важна бшьшкть iмуноферментних наборiв для виявлення специфiчних антитiл класу IgM до певних збудник1в iнфекцiйних хвороб у сироватщ (плазмi) кровi людини побудоваш за принципом так звано! «IgM-пастки» (IgM-capture ELISA). Дана модифшащя 1ФА дозволяе на пер-шому етапi зафiксувати на твердiй фазi загальний пул IgM-антитiл (концентрация яких у сироватцi кровi значно менша за вмiст IgG), а на другому - виявити саме спе-цифiчнi IgM. Суттевою проблемою у виробницга подiбного роду дiагностичних наборiв е отримання позитивного контролю (ПК). Класичним варiантом ПК е сироватка (плазма) кровi людини з умютом специфiчних антитiл певного класу. Разом iз тим частота виявлення IgM-позитивних сироваток незначна. Вкрай дефщитний вщповщний бiологiчний матерiал як сировина для отри-мання ПК. Дана обставина може суттево обмежувати ви-робництво дiагностичних наборiв, особливо за умов широкомасштабного виробництва. Ми запропонували методолопчний п|лх|д до використання синтетичних ПК в iмуноферментних наборах, побудованих за принципом «IgM-пастки», який полягае у використант кон'югату
нормальних iмуноглобулiнiв класу IgM i моноклональних антитш ((МкАт) до ферменту пероксидази хрону (ПХ).
Мета роботи - порiвняти рiзнi методи бюкон'югацп для синтезу синтетичних позитивних контрол1в для iмуноферментного анатзу модифшацл «IgM-пастка», заснованi на ощнщ бiохiмiчних та iмунохiмiчних вла-стивостей отримуваних бiокон'югатiв.
Матерiал i методи дослвджень
NHS ефiр-малеlмiд-опосередкована кон'югацiя.
Синтез кон'югату проводили за допомогою базового методу (Hermanson, 2000) iз власними модиф1кац1ями. На першому етат проводили активац1ю нормального IgM людини NHS ефiр-малеlмiдним зшивальним агентом -
сульфо-сукцишмвдил-4-(№мале1м1дометил) циклогексан-
1-карбоксилату (сульфо-SMCC). Брали 2-3 мл розчину IgM (400-420 мг/мл) у 0,1 М фосфатному буферi з 0,15 М NaCl, рН 7,2 (ФБР). До розчину муноглобулшв додавали 6 мг сульфо-SMCC, розмшували до повного розчинення та витримували упродовж 30 хв за юмнагао! температури. В1дд1лення сульфо-SMCC, що не прореагував, проводили на колонщ 2,5 х 100 см iз сефакрилом S-300, застосовую-чи ФБР. Активоват 1муноглобул1ни елюювали з колонки, розводили до концентрацй' 20 мг/мл та ввдразу використо-вували для синтезу кон'югату.
Кон'югацш активованого IgM та МкАт iз в1днов-леними сульфг1дрильними групами проводили таким чином. Брали розчин МкАт до ПХ iз концентрацieю 5 мг/мл у ФБР iз 10 ммоль/л ЕДТА. До 3 мл розчину МкАт додавали 18 мг меркаптоетиламшу (МЕА), iнкубували 90 хв за температури +37 °С. Для вщдшення редукованих антит1л в1д МЕА, що не вступив у реакцш, застосовували хроматографiчну колонку 1,5 х 40 см iз сефадексом G-25 (Pharmacia Biotech), використовуючи ФБР iз 10 ммоль/л ЕДТА. Елюц1ю редукованих антитш проводили зi швидк1стю 2 мл/хв. Збирали фракцй' об'емом 0,5 мл i вимрювали оптичну густину при 280 нм. Зiбранi фракцй' редукованих МкАт негайно зм1шували з активованими IgM у молярному сшввщношент IgM : МкАт, р1вному 1 : 4. Реакцшну сум1ш витримували 2 години за кiмнатноl температури. Отриманий кон'югат п1ддавали очищению за допомогою iмуноафiиноl хроматографй' на колонщ iз се-фарозою 6-В, на якiй iммобiлiзованi МкАт до ПХ.
Перйодатний метод кон'югаци. Кон'югацш МкАт до ПХ iз нормальним IgM людини зд1йснювали у молярному стввщношент МкАт до IgM 1 : 1 методом перюдатного окислення (Tijssen, 1985) iз власними модифшащями. Для окислення IgM людини (15 мг/мл) брали 0,1 М бшарбонатний буфер, рН 8,3, додаючи такий же об'ем 14 мМ водного розчину перюдату натрш. Сум1ш 1нкубували протягом 2 годин за ммнатно! темпе-ратури. Одержаний таким чином розчин активованого
IgM людини додавали до розчину МкАт, яи попередньо дiалiзували проти 0,1 М карбонатного розчину, рН 9,2. Сумш переносили у хроматографiчну колонку та додавали 1/3 частину сухого сефадексу G-25, iнкубували про-тягом 3 годин за юмнатно! температури. По закшчент шкубацп розчин кон'югату елюювали з колонки та зупи-няли реакщю додаванням 1/20 об'емно! частини водного розчину NaBH4 (5 мг/мл), залишаючи на 30 хв за юмнатно! температури. Пiсля цього ще додавали 3/20 частини розчину борпдриду натрш, шкубували про-тягом 60 хв. Одержаний розчин кон'югату переводили у 0,02 М фосфатний буфер з 0,15 М NaCl шляхом далзу.
Кон'югацiя за допомогою глутарового альдегщу. Синтез кон'югату проводили за допомогою базового дво-хетапного методу (Hermanson, 2000) iз власними модифь кацями. Брали розчин IgM людини з концентращею 10 мг/мл у ФБР, рН 6,8. До розчину iмуноглобулiну додавали глутаровий альдегид до кшцево! концентрацЦ 1% i витримували протягом ночi за к1мнатно1 температури. Очищення активованого iмуноглобулiну ввд надлишку глутарового альдегтду проводили за допомогою гель-фшьтрацп на колонц1 2,5 х 100 см iз сефакрилом S-300, використовуючи ФБР, рН 6,8. Для подальшо! кон'югацц брали розчин МкАт до ПХ у концентрацЦ 10 мг/мл у 0,5 М карбонатному буферному розчит, рН 9,5. Змшували активованi IgM людини iз МкАт у молярному стввщношент 1: 1 та витримували протягом ноч за температури +4 °С. Вщновлення утворених основ Шиффа та iмовiрних слiдiв глутарового альдегтду проводили шляхом додавання NaBH4 (10 мг/мл) та витримування протягом 1,5 години за температури +4 °С. Для вщокремлення iмовiрних нерозчинних форм розчин отриманого кон'югату тддавали центрифугуванню при 10 000 об./хв та очищали на колонц 2,5 х 100 см iз сефакрилом S-300, використовуючи ФБР, рН 7,4.
1ФА модифшаци «IgM-пастка». Моноклональнi антитша, специфiчнi до IgМ людини (Galkin and Dugan, 2009), сорбували в 0,02 М карбонат-бжарбонатному буферi в концентрацЦ 2 мкг/мл на 96-лунковi полюте-роловi планшети для 1ФА високо! сорбцшно! емносп (Suzhou Conrem Biomedical Technology Co., Китай).
Планшет шкубували протягом 12 годин за +4 °С, потм тричi вщмивали 0,02 М фосфатним буферним розчином iз 0,15 М NaCl та 0,2% твш-20 (ФБРТ), витримували у розчинi бичачого сироваткового альбумшу (БСА) (10 мг/мл в ФБР) 1 годину за температури +37 °С. ППсля чотириразового вщмивання ФБРТ лунки планшета запов-нювали 100 мкл розчину кон' югату нормального IgM та МкАт до ПХ у реакцшному буферному розчит (0,05 М трис-HCl буфер, рН 8,0, 0,15 М NaCl, 5 мМ ЕДТА, 0,5 мг/мл БСА, 0,2% твш-20). Планшети шкубували 30 хв за температури +37 °С та вщмивали чотири рази ФСБТ. Псля вщмивання вносили розчин кон'югату рекомбшант-них бшив-антигешв цитомегаловiрусу людини (ЦМВ) та пероксидази хрону (100 мкл/лунку), який шкубували 30 хв за температури +37 °С. Тричi вщмивали ФБРТ i двiчi дистильованою водою, пiсля чого вносили по 100 мкл субстратно-хромогенно! сумiшi (розчин 3,3',5,5'-тетраметилбензидину 0,25 мг/мл у 0,1 М натрш-цитратного буферу, рН 4,5, iз додаванням 10 мкл 33% розчину перекису водню). Реакцию проявляли 20 хв у темнол та зупиняли, додаючи 50 мкл 2 М арчано! кисло-ти. Оптичну густину вимiрювали при 450 нм/620 нм.
Результати та ix обговорення
Грунтуючись на даних iнших авторiв (Harlow and Lane, 1988; Johnstone, 1997; Hermanson, 2000) та власно-му досв1д1 (Galkin, 2010), обрали три принциповi методолопчт подходи до синтезу кон'югат1в формату «антитшо - антитiло», як1 поддавали оц1нц1 для синтезу в1дпов1дного ПК (неспецифiчнi IgM + МкАт до ПХ):
1) NHS ефiр-малеlмiд-опосередкована кон'югаця на приклад1 сукцинiмiдил-4-(N-малеlмiдометил) циклогек-сан-1-карбоксилату (SMCC) як зшивального агента;
2) глутаральдепдний метод; 3) перiодатний метод. Ви-користання вищезазначених методолог^чних прийомiв можливе за таких передумов. NHS ефiр-малеlмiд-опосередкована кон'югац1я можлива за учасп двох бiомолекул, одна з яких мае вiльнi амiногрупи, а друга -вшьт сульфгiдрильнi групи (рис. 1).
!з г?
A -ОГ при 280 нм Кондуктивысть
l] 1
[ 5
-—4 -
Об'ем, мл
2
1,5
0,5
0
9
Рис. 1. Вщдшення редукованих МкАт до ПХ i за. ппикчв меркаптоетиламiну гель-ф1льтрац1ею на сефадексi G-25 (NHS ефiр-малеlмiд-опосередкована кон'югацiя)
Очевидно, що й IgM людини, й мишачi моноклональнi антит1ла мають вiдповiднi групи, яю можуть бути задiянi у данш методиц1. Глутаровий альдеггд реагуе iз е-
амiногрупами лiзинових залишюв б1лково! молекули. Важливо зазначити, що одночасно перебiгае дек1лька реакций, результатом яких е утворення продукту, що
мстить мпгнпш хlмiчнi зв язки, н1ж у простих основах Шиффа (Негтагеоп, 2000). Потенцтна можливiсть вико-ристання перйодатного методу зумовлена тим, що молекула IgM людини мстить до 12% вуглеводних залишкв (РШрроуюЬ, 1999). Це, у свою чергу, дозволяе проводити модифжащю молекули IgM з утворенням активних альдепдних груп, як1 згодом будуть реагувати з амшогрупами антитш з утворенням основи Шиффа. Альдепдт групи у молекулi IgM утворюються тд час окислювання перiодатом натрш !х вуглеводних компонента, амшогрупи якого попередньо або блоковат 1-фтор-2,4-дин1тробензолом, або протонован1 (Негшагаоп, 2000). Таким чином, нам слад було на практищ ощнити прийняттсть згаданих методик для синтезу бiокон'югатiв формату «антитшо - антитшо».
На рисунку 1 наведено результата ввддшення реду-кованих (одновалентних) МкАт до ПХ i залишкiв меркаптоетиламiну за допомогою гель-фшьтрацй на 1,4
1,2
0,8
сефадека G-25 у процесi отримання кон'югату за допомогою NHS ефiр-малеiмiд-опосередкованого методу. Як видно Í3 хроматограми, редукованi антитiла виходили з колонки у формi чiткого гомогенного за молекулярною масою пiку. МЕА, що не прореагував та який е меншим за своею молекулярною масою, сходив i3 хроматографiчноl колонки дещо пiзнiше. Цiкавими були результата очищення кон'югату, отриманого глутаральдепдним методом, гель-фшьтращею на сефакрилi S-300 (рис. 2). Отриманий кон'югат не був однорвдним за молекулярною масою: у ньому виявлено щонайменше три групи кон'югованих молекул iз близькими молекулярними масами. Аналогiчнi дослвдження з кон'югатом, отриманим за допомогою перйодатного методу, не проводилися, оск1льки попереднi дослвдження вказували на отримання за да-ною методикою кон'югапв однородного складу (Nikolaenko et al., 2005).
I 0,6
0,4
0,2
90
110
130
150 170
Об'ем, мл
190
210
230
Рис. 2. Фшальне очищення кон'югату, отриманого глутаральдегвдним методом, гель-фшьтращею на сефакрил1 8-300
2,5
% 1,5
0,5
—<^БМСС як зшивальний агент
Перйодатний метод
-й- Гпутарапьдегщний метод
-о— Позитивна сироватка
Негативна сироватка
10
20
40 80
Розведення
160
320
0
2
0
Рис. 3. Титрування синтетичних контролiв, отриманих рниими методами
Синтетичнi ПК, отриманi рiзними методами, ощню-вали шляхом ïx титрування в iмуноферментному аналiзi, призначеному для виявлення IgM-антитiл до цитомега-ловiрусу людини. Дане дослвдження проводили порОвня-но з титруванням високотитражно1 сироватки з умiстом IgM, специфiчниx до ЦМВ, а також негативно! сироват-
ки (рис. 3). Найкращим результатом характеризувався ПК, отриманий унаслодок використання SMCC як зши-вального агента (NHS ефiр-малеïмiд-опосередкована кон'югацiя), спадання активносп под час розведення ПК, отриманих шшими методами, водбувалося бшьш штен-сивно. Разом Оз тим, уа варОанти синтезованих ПК ха-
рактеризувалися сприятлившим сигналом у 1ФА, шж високотитражна IgM-позитивна сироватка.
Висновки
Теоретично обгрунтовано методолопчт щдходи до отримання синтетичних позитивних контролш для iмуноферменгноrо аналiзу модифшаци «IgM-пастка»: NHS ефiр-малеlмiд-опосередкована кон'юrацiя на прикладi SMCC як зшивального агента, перйодатний i глутаральдепдний методи бiокон'югацii. Кон'югати нормального IgM людини та МкАт до ПХ, отриманi за допомогою NHS ефiр-малеlмiд-опосередкованоl кон'югаци та перйодатного методу, гомогент за моле-кулярною массою; натомють кон'югат, що синтезуеться глутаральдепдним методом, мктить щонайменше три групи бюполшерш близько! молекулярно! маси. Синтетичнi позитивн контролi, отриманi рiзними методами, характеризуются вищим титром порiвняно з ви-сокотитражною IgM-позитивною сироваткою. Разом iз тим, позитивний контроль, отриманий за допомогою SMCC, характеризуеться найкращим профшем титру-вання (повiльнiшим спаданням активносп в 1ФА тд час його розведення).
Бiблiографiчнi посилання
Filippovich, J.B., 1999. Osnovy biohimii [Fundamentals of Biochemistry]. Agar, Moscow (in Russian). Galkin, O.Y., 2010. Approaches to the synthesis of conjugates for enzyme immunoassay test-systems and evaluation of their use for diagnostics of infectious diseases. Ukr. J. Clin. Lab. Med. 5(4), 54-60. Galkin, O.Y., 2014. Parametry bioanalitychnoyi standartyzatsiyi zasobiv dlya serolohichnoyi diahnostyky [Parameters for bioanalytical standardization of medical devises for sero-logical diagnostics]. Materialy IV naukovo-praktychnoyi konferentsiyi "Suchasni dosyahnennya farmatsevtychnoyi tekhnolohiyi" [Proc. 4th Sci. Conf. "Recent advances in pharmaceutical technology"]. Publishing House of the National University of Pharmacy, Kharkov (in Ukrainian). Galkin, O.Y., Dugan, O.M., 2009. Porivnyannya skhem imuni-zatsiyi myshey liniyi Balb/c dlya oderzhannya monoklon-
al'nykh antytil do IgM lyudyny [Comparison of immunization charts of Balb/c mice to produce monoclonal antibodies to human IgM]. Immunol. Allergol. 1, 68-73 (in Ukrainian).
Harlow, E., Lane, D., 1988. Antibodies. A laboratory manual. Cold Spring Harbor, New York.
Hermanson, G.T., 2000. Bioconjugate techniques. Academic Press, San Diego.
Holmes, D.A., Purdy, D.E., Chao, D.Y., Noga, A.J., Chang, G.J., 2005. Comparative analysis of immunoglobulin m (IgM) capture enzyme-linked immunosorbent assay using virus-like particles or virus-infected mouse brain antigens to detect IgM antibody in sera from patients with evident flaviviral infections. J. Clin. Microbiol. 43(7), 3227-3236.
Hunsperger, E.A., Yoksan, S., Buchy, P., Nguyen, V.C., Sekaran, S.D., Enria, D.A., Pelegrino, J.L., Vázquez, S., Art-sob, H., Drebot, M., Gubler, D.J., Halstead, S.B., Guzmán, M.G., Margolis, H.S., Nathanson, C.M., Rizzo, L.N.R., Bes-soff, K.E., Kliks, S., Peeling, R.W., 2009. Evaluation of commercially available anti-dengue virus immunoglobulin M tests. Emerg. Infect. Dis. 15(3), 436-440.
Johnstone, A., 1997. Immunochemistry 2: A practical approach. IRL Press, Oxford.
Nikolaenko, I.V., Galkin, A.J., Raevskaja, G.E., Donskaja, E.S., Kas'janenko, T.V., Tereshhenko, M.I., Spivak, N.J., 2005. Poluchenie monoklonal'nyh antitel k Fc-fragmentu IgG cheloveka i primenenie immunofermentnyh konjugatov na ih osnove [Preparation of monoclonal antibodies to Fc-fragments of human IgG and usage of its conjugates in im-munoassays]. Klinicheskaja Laboratornaja Diagnostika 11, 8-11 (in Russian).
Senchuk, A.J., Dubossarskaja, Z.M., 2004. Perinatal'nye infek-cii. Prakticheskoe posobie [Perinatal infection. A practical guide]. MIA, Moscow (in Russian).
Tijssen, P., 1985. Practice and theory of enzyme immunoassays. Lab. Tech. Biochem. Mol. Biol. 15, 329-384.
Vazquez, S., Hafner, G., Ruiz, D., Calzada, N., Guzman, M.G., 2007. Evaluation of immunoglobulin M and G capture enzyme-linked immunosorbent assay Panbio kits for diagnostic dengue infections. J. Clin. Virol. 39(3), 194-198.
Zupanec, I.A., Misjureva, S.V., Propisnova, V.V., 2005. Klinicheskaja laboratornaja diagnostika: Metody issledo-vanija [Clinical laboratory diagnostics: Research methods]. Publishing House of the National University of Pharmacy, Kharkov (in Russian).
Hadíümna do редкоnегü 15.10.2014
