CC BY
28
Применение препарата циклоферон в терапии хронических гастродуоденитов у детей
С. Ю. ЕРМАК', С. А. ЛЯЛИКОВ', М. Г. ЗУБРИЦКИЙ2, О. Н. БОРОДАВКО3
1 УО «Гродненский государственный медицинский университет», Гродно
2 УЗ «Гродненское областное патологоанатомическое бюро», Гродно
3 УЗ «Гродненская областная клиническая больница», Гродно, Беларусь
Cycloferon Therapy of Chronic Gastroduodenitis in Children
S. YU. YERMAK, S. A. LIALIKOV, M. G. ZUBRITSKY, О. N. BORODAVKO
Grodno State Medical University, Grodno, Belarus Grodno Regional Pathoanatomical Bureau, Grodno, Belarus Grodno Regional Clinical Hospital, Grodno, Belarus
В статье дана оценка эффективности применения иммуномодулирующего препарата циклоферон у детей в возрасте от 10 до 16 лет с верифицированным хроническим гастродуоденитом. Показано, что применение циклоферона приводит к достоверному увеличению Т- и В-клеточных популяций в составе слизистык оболочек желудка и двенадцатиперстной кишки, к нормализации количества CDS-лимфоцитов, повышению титра антител класса IgG к вирусам герпеса 1-го и 2-го типа, а также способствует снижению активности воспалительного процесса в слизистых и уменьшению клинических проявлений заболевания.
Ключевые слова: хронический гастродуоденит, вирусная инфекция, слизистая оболочка, местный иммунитет, дети, циклоферон.
The efficiency of immunomodulating therapy with cycloferon in children aged from 10 to 16 years with verified chronic gastroduodenitis was estimated. It was shown that the cycloferon treatment provided reliable increase of T- and B-cellular populations in mucous membranes of the stomach and duodenum, normalization of the number of CD8-lymphocytes, higher titers of IgG antibodies to herpes viruses 1 and 2. It also promoted reduction of inflammation in the mucous membranes along with reduction of the disease clinical signs.
Keywords: chronic gastroduodenitis, virus infection, mucous membrane, local immunity, children, cycloferon.
Введение
Внедрение в педиатрическую гастроэнтерологическую практику многочисленных современных лабораторных и инструментальных методов диагностики существенно расширило представление об этиологических факторах, а также о патогенетических особенностях развития хронических заболеваний верхних отделов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ).
В течение длительного времени считалось, что благодаря воздействию соляной кислоты слизистая оболочка (СО) желудка практически стерильна [1]. Открытие австралийскими учеными микроорганизма Helicobacter pylori (H.pylori) стало переломным моментом во взглядах на природу воспалительных заболеваний верхних отделов желудочно-кишечного тракта [2].
© Коллектив авторов, 2014
Адрес для корреспонденции: 230015, Гродно, ул. Горького, 80. Кафедра клинической лабораторной диагностики, аллергологии и иммунологи УО «Гродненский государственный медицинский университет»
На сегодняшний день общепризнанно, что H.pylori играет важную роль в патогенезе хронического гастрита (ХГ), язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки (ДПК), аденокар-циномы и В-клеточной MALT-лимфомы желудка [3—5].
При углублённом изучении микрофлоры, колонизирующей СО желудка здоровых людей, были обнаружены лактобактерии, стрептококки, стафилококки, грибы рода Candida. Стерильность СО желудка была установлена только у 10% обследованных. При ХГ количество микроорганизмов, колонизирующих СО желудка, возрастает и увеличивается их видовой состав [6].
В последние годы широко обсуждается роль вирусов в этиологии хронических воспалительных заболеваний желудочно-кишечного тракта. В СО желудка и ДПК пациентов с ХГ были обнаружены антигены вируса простого герпеса (ВПГ) 1-го и 2-го типа, вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ), вируса папилломы человека (ВПЧ) высокого канцерогенного риска (16-й, 18-й типы), цитоме-галовируса (ЦМВ) [7—9].
Длительная персистенция вирусной и бактериальной инфекции в организме приводит к снижению специфических и неспецифических факторов иммунологической защиты организма, что требует комплексного подхода в лечении с учётом этиологических и патогенетических особенностей данных инфекций [10].
Несмотря на широкий арсенал противовирусных препаратов, лечение герпетической инфекции продолжает оставаться актуальной и весьма трудной задачей.
Современная патогенетическая терапия гер-песвирусных инфекций предусматривает использование средств интерферонозаместительной терапии и применение препаратов, стимулирующих выработку эндогенного интерферона в организме, так называемых индукторов интерферонов.
Наличие широкого спектра фармакологических эффектов позволило препаратам из группы индукторов интерферонов занять достойное место в педиатрической практике. Данная группа препаратов представлена семейством высоко- и низкомолекулярных природных и синтетических соединений, обладающих антивирусным, имму-номодулирующим, противовоспалительным и противоопухолевым спектром действия [11].
Наиболее перспективным и детально изученным представителем индукторов эндогенного интерферона является циклоферон. Циклоферон подавляет репродукцию вирусов, активирует ТЫ-иммунный ответ, стимулирует адаптивный иммунитет, повышает устойчивость организма к вирусным и бактериальным инфекциям, являясь безопасным и эффективным лекарственным средством [12].
Цель настоящего исследования: изучить эффективность иммуномодулирующего препарата циклоферон при лечении детей с хроническим гастродуоденитом.
Материал и методы
На базе Гродненской областной детской клинической больницы обследовано 40 детей (25 мальчиков и 15 девочек). 20 детей (9 мальчиков и 11 девочек) в возрасте от 10 до 16 лет, медиана (Ме) — 14,5 лет, нижняя квартиль (025) — 12 лет, верхняя квартиль (075) — 15 лет с верифицированным диагнозом ХГ составили основную группу.
Представители основной группы принимали препарат циклоферон в таблетках двумя курсами в возрастных дозировках по стандартной схеме (один раз в день в 1, 2, 4, 6, 8, 11, 14, 17, 20, 23-и сутки) с 2-недельным перерывом между курсами.
Перед назначением препарата у родителей было получено информированное добровольное согласие на проведение лечения их детей. Терапия проводилась только в случае клинически стабильного состояния пациентов и при отсутствии соматических заболеваний в состоянии декомпенсации.
Всем пациентам с диагностированной Яру/оп'-инфекци-ей была проведена стандартная трёхкомпонентная эрадика-ционная терапия.
Группа сравнения была сформирована из числа пациентов, госпитализированных в хирургическое отделение, с предварительным диагнозом острый аппендицит, у которых в ходе
предусмотренного протоколом клинического и инструментального обследования, включавшего фиброгастродуодено-скопию, предварительный диагноз был исключен. Критериями включения в группу сравнения было наличие информированного добровольного согласия родителей на проведение обследования их детей, отсутствие эндоскопических и морфологических изменений слизистой желудка и ДПК, а также отсутствие в анамнезе указаний на симптомы хронических заболеваний желудка и ДПК. Всего в эту группу было отобрано 20 детей (16 мальчиков и 4 девочки) в возрасте от 6 до 15 лет (Ме — 10,5 лет, Q25 — 8 лет, Q75 — 14 лет).
Всем представителям основной группы двукратно, до и после лечения, а детям из группы сравнения однократно были проведены фиброгастродуоденоскопия и забор венозной крови. Интервал между первым и вторым обследованием в основной группе составлял 3 месяца.
Фиброгастродуоденоскопия выполнялась на аппарате «Olympus» (Япония) типа Gif P 30 по традиционной методике. В процессе эндоскопического исследования проводили прицельную биопсию СО антрального отдела и тела желудка, а также СО ДПК. Для морфологического исследования парафиновые срезы, окрашивали гематоксилином и эозином. Согласно критериям модифицированной Сиднейской системы, основные морфологические параметры оценивали полуколичественным способом по стандартной визуально-аналоговой шкале как слабые, умеренные и выраженные.
Стрептавидин-биотиновым методом в парафиновых срезах биоптатов с помощью поликлональных кроличьих антител выявляли антигены ВПГ-1, ВПГ-2, с использованием моноклональных мышиных антител («Dako», Дания) — антигены ВЭБ, ЦМВ и вируса папилломы человека (ВПЧ). Продукты иммуногистохимической реакции выявляли по наличию светло-коричневых и тёмно-коричневых гранул в ядрах и цитоплазме клеток. Степень экспрессии антигенов вирусов оценивали полуколичественно: слабая, умеренная и выраженная.
Диагностику H.pylori проводили гистологически с использованием окраски полученного материала по Романов-скому-Гимзе.
Методом иммуногистохимического типирования при помощи моноклональных антител («DAKO», Дания) в СО желудка и ДПК определяли выраженность экспрессии CD45, CD3, CD4, CD8 и CD20. Интерпретацию результатов проводили с использованием количественной системы оценки реакции: высчитывали % клеток лимфоидного инфильтрата по отношению к площади стромы. Полученные результаты округлялись до десятков.
В сыворотке крови методом ИФА определяли уровни сывороточных антител классов IgM, IgG к вирусам герпеса 1-го и 2-го типа, а также антител класса IgM, IgG и IgA к капсид-ному антигену (VCA) вируса Эпштейна-Барр с использованием коммерческих тест систем фирм «Euroimmune» (Германия), «Вектор Бест» (Россия) и «Фармлэнд» (Беларусь).
Эффективность терапии у детей основной группы оценивалась по динамике проявлений, рассчитываемой путём вычитания исходных клинических, морфологических, иммунологических изменений и показателей инфицированности СО вирусами и H.pylori (в баллах) из соответственных показателей (в баллах) после окончания лечения циклофероном: (Динамика=Показательпосле лечения — Показательдо лечения).
Полученные результаты были обработаны при помощи программы STATISTICA 10.0 (SN AXAR207F394425FA-Q). &ответствие распределения каждой анализируемой переменной Гаусовскому (нормальному) распределению оценивали c помощью теста Шапиро-Уилка. При сравнении двух зависимых групп пациентов по признакам, имеющим распределение, отличающееся от нормального, использовали критерий Вилкоксона (Z). При сравнении долей (%) использовался метод Фишера (Fisher exact test, two-tailed). Связи между измеряемыми переменными оценивали методом ран-
Таблица 1. Частота клинических проявлений до и после лечения
Показатели До лечения (и=20) После лечения (и=20) р
Боль в животе 15 (75,0%) 6 (30,0%) 0,007
Пальпаторная болезненность 18 (90,0%) 3 (15,0%) 0,0001
Диспептический синдром 15 (75,0%) 5 (25,0%) 0,003
Таблица 2. Динамика морфологических показателей (в баллах) на фоне терапии
Показатели До лечения (и=20) После лечения (и=20) р
Активность воспаления 3,50 (1,50-5,00) 0,00 (0,00-2,50) 0,002
Выраженность воспаления 5,00 (4,00-6,00) 4,00 (4,00-5,00) 0,07
говой корреляции Спирмена (К). Нулевая гипотеза (о нормальности распределения, отсутствии различий между переменными, отсутствии связи между переменными) отвергалась на уровне значимости а=0,05 (р<0,05) для каждого из использованных тестов. Результаты статистического анализа представлены в формате Ме (р25-р75).
Результаты и обсуждение
При исследовании биопсийного материала СО гастродуоденальной области вирусные антигены были выявлены как у пациентов с ХГ, так и у детей из контрольной группы (70 и 50% соответственно, р>0,05).
У пациентов основной группы антигены по видовой принадлежности распределились следующим образом: ВПГ-1 был диагностирован в 9 случаях (45,0%), ВПГ-2 - в 6 (30,0%), ВЭБ - в 5 (25,0%), ВПЧ - в 5 (25,0%), ЦМВ - в 3 (15,0% случаев). Установлена высокая частота сочетания вирусных инфекций в исследуемых отделах. У 6 (30,0%) детей в СО обнаружены антигены только одного из определяемых вирусов, сочетание двух и более вирусов встречалось у 8 (40,0%) обследованных.
В СО желудка и ДПК пациентов из контрольной группы ВПГ-1 был выявлен в 4 (20,0%) случаях, ВПГ-2 - в 4 (20,0%), ВЭБ - в 3 (15,0%), ВПЧ - в 6 (30,0%), ЦМВ был обнаружен только у 1 (5,0%) ребенка. Ассоциации нескольких вирусов были у 6 детей (30,0%) контрольной группы.
Обсеменение СО Н.ру1оп было выявлено у 13 (65,0%) детей основной группы. При этом у 8 (40,0%) пациентов установлено наличие со-четанного бактериально-вирусного инфицирования исследуемых отделов.
До начала лечения дети основной группы чаще всего предъявляли жалобы на боль в животе, отрыжку, тошноту, снижение аппетита (табл. 1). У 90,0% пациентов при глубокой пальпации отмечалась болезненность в эпигастральной и пи-лородуоденальной области. После завершения двух курсов терапии циклофероном дети отмечали улучшение общего самочувствия, значительное уменьшение или ликвидацию болевого и дис-пептического синдромов.
Установлено, что на фоне лечения произошло статистически значимое снижение активности воспалительного процесса, отмечена тенденция к
ВПГ-1 ВПМ ВЭБ ВИЧ ИМ К 11.рц1пп
Частота выявления инфекций в СО пациентов до и после лечения циклофероном, %
достоверному снижению выраженности воспаления в СО желудка и ДПК (табл. 2).
Повторное исследование вирусного инфицирования биоптатов СО выявило снижение частоты обнаружения изучаемых вирусов. После проведённой терапии вирусные антигены были обнаружены у 6 (42,8%) из 14 детей первой группы (по сравнению с исходной частотой р=0,01). ВПГ-1 по-прежнему определялся в СО у 5 (25,0%) детей, ВПГ-2 у 2 (10,0%) пациентов, кроме того, было выявлено по 1 (5,0%) случаю инфицирования слизистых ВЭБ, ЦМВ и ВПЧ (рисунок). Достоверных различий в частоте выявления каждого из анализируемых вирусных антигенов по отдельности не установлено (р>0,05 по сравнению с исходной частотой для каждой пары сравнений).
Эрадикации Н.ру1оп удалось добиться только у 1 пациента. Вероятными причинами таких низких результатов лечения инфекции Н.ру1оп является первичная либо вторичная резистентность данного возбудителя к антибактериальным препаратам, а также внутрисемейное реинфицирование.
После проведённой терапии в слизистых отмечалось существенное снижение степени как суммарной экспрессии вирусных антигенов: до лечения - 4,0 (0-8,5), после лечения - 0 (0-1,0) (р=0,0009), так и достоверное снижение степени экспрессии антигенов ВПГ-1, ВПГ-2, ВЭБ и ВПЧ по отдельности (р<0,05 для каждого из перечисленных вирусов). Статистически значимой разницы в степени экспрессии антигенов ЦМВ
Таблица 3. Изменения иммунологических показателей в СО желудка и ДПК
Показатели
До лечения (n=20)
После лечения (n=20)
Группа сравнения (n=20)
P1—2
P2—3
P1—3
CD45
Тело желудка Антральный отдел ДПК CD3
Тело желудка Антральный отдел ДПК CD4
Тело желудка Антральный отдел ДПК CD8
Тело желудка Антральный отдел ДПК CD20
Тело желудка Антральный отдел ДПК
30,0 (20,0-40,0) 40,0 (30,0-40,0) 40,0 (35,0-40,0)
30,0 (25,0-40,0) 40,0 (30,0-50,0) 40,0 (30,0-45,0)
30,0 (30,0-40,0) 30,0 (30,0-40,0) 30,0 (30,0-45,0)
20,0 (20,0-30,0) 20,0 (20,0-35,0) 20,0 (20,0-30,0)
30,0 (30,0-40,0) 30,0 (30,0-50,0) 30,0 (30,0-40,0)
40,0 (30,0-50,0) 50,0 (40,0-50,0) 45,0 (40,0-50,0)
40,0 (30,0-50,0) 50,0 (40,0-60,0) 50,0 (40,0-60,0)
50,0 (40,0-60,0) 50,0 (40,0-65,0) 55,0 (40,0-70,0)
30,0 (30,0-40,0) 30,0 (25,0-40,0) 30,0 (30,0-40,0)
40,0 (30,0-40,0) 50,0 (30,0-50,0) 40,0 (30,0-50,0)
50,0 (50,0-60,0) 60,0 (55,0-60,0) 50,0 (50,0-60,0)
50,0 (50,0-60,0) 60,0 (50,0-60,0) 60,0 (50,0-60,0)
60,0 (55,0-70,0) 60,0 (55,0-70,0) 60,0 (55,0-70,0)
40,0 (30,0-40,0) 40,0 (30,0-40,0) 40,0 (30,0-40,0)
50,0 (40,0-50,0) 50,0 (40,0-60,0) 50,0 (40,0-50,0)
0,001 0,01 0,01
0,003 0,003 0,01
0,0003 0,0004 0,0006
0,0006 0,002 0,0009
0,004 0,08 0,01
0,003 0,0009 0,01
0,008 0,32 0,03
0,01 0,03 0,19
0,10 0,21 0,33
0,008 0,06 0,05
0,00002 0,0001 0,0002
0,00004 0,00006 0,00006
0,000002 0,00001 0,00001
0,0003 0,0005 0,00008
0,00009 0,007 0,002
Таблица 4. Динамика уровня противовирусных антител на фоне терапии
Антитела До лечения После лечения Группа сравнения Pl-2 P2-3 Pl-3
EBV (VCA) Ig G (n=20) 69,15 (27,50-213,0) 117,35 (82,50-169,35) 124,15 (75,25-205,0) 0,55 0,80 0,12
EBV (VCA) IgM (n=15) 10,30 (8,40-13,40) 10,20 (8,89-13,30) 10,30 (8,06-14,75) 0,57 0,78 0,94
EBV (VCA) IgA (n=20) 2,07 (1,87-2,35) 2,06 (1,75-2,52) 2,48 (1,87-2,94) 0,85 0,18 0,44
HSV I-II IgG (n=15) 10,0 (3,10-12,60) 11,50 (2,40-16,00) 10,60 (2,32-13,70) 0,05 0,38 0,86
HSV I-II IgG титр (n=15) 400 (200-800) 800 (200-1600) 400 (100-1600) 0,01 0,63 0,90
HSV I-II IgM 0 0 0 — — —
на фоне проведённой терапии не было установлено (/>>0,05).
При оценке исходного состояния местного иммунитета СО желудка и ДПК у детей основной группы было обнаружено статистически значимое снижение числа клеток, экспрессирующих все анализируемые маркёры (CD45, CD3, CD4, CD8, CD20) по сравнению с представителями группы сравнения (табл. 3). Контрольное исследование после окончания терапии, выявило положительную динамику изученных иммунологических показателей в СО желудка и ДПК.
Установлено, что после проведённой имму-нокоррекции в СО детей произошло достоверное увеличение числа клеток во всех субпопуляциях лимфоцитов, причём наиболее выраженные изменения произошли в Т-клеточном звене. Следует отметить отсутствие статистически значимых различий в количестве CD8+ клеток в СО пациентов, получивших циклоферон, и детей группы сравнения (/>0,05).
При анализе гуморального ответа на вирусную инфекцию было установлено, что специфические антитела класса IgM против вирусов герпеса 1-го и 2-го типа в диагностически значимых титрах не определялись ни у одного ребенка (табл. 4). Следует отметить повышение показателей, характеризующих уровень антител класса
^О к вирусам герпеса 1-го и 2-го типа (р=0,05), а также достоверное увеличение титра к ним (р=0,01). Изменения уровней антител классов ^А, ^М и ^О к капсидному антигену ВЭБ после проведённой терапии были статистически незначимыми (р>0,05). Следует отметить наличие достоверной отрицательной связи между показателями, характеризующими динамику экспрессии ВПГ-1 и динамику титра антител класса ^О к вирусам герпеса 1-го и 2-го типа (Я=-0,52, р=0,04). Вероятно, увеличение в сыворотке крови пациентов титра антител класса ^О к вирусам герпеса после приёма двух курсов циклофе-рона способствовало элиминации вируса ВПГ-1 из слизистых желудка и ДПК.
С помощью корреляционного анализа установлено наличие достоверной зависимости между показателями, характеризующими степень вирусной экспрессии после проведённого лечения, динамикой основных морфологических проявлений в СО. Так, динамика выраженности воспалительного процесса достоверно положительно коррелировала с динамикой экспрессии антигенов ВПГ-1 (Я=0,75; р=0,0001), ВЭБ (Я=0,63; р=0,002) и ВПГ-2 (я=0,48;р=0,03). Динамика активности воспаления была статистически значимо связана с динамикой экспрессии ВПГ-1 (Я=0,50; р=0,02) и ВПГ-2 (Я=0,43; р=0,05).
Не было обнаружено существенной зависимости между степенью экспрессии ВПЧ и ЦМВ и динамикой плазмоцитарной и нейтрофильной инфильтрации слизистых исследуемых отделов (во всех случаях р>0,05). Таким образом, снижение экспрессии вирусных антигенов в клетках СО сопровождалось положительной морфологической динамикой. Полученные данные могут свидетельствовать о патогенетической роли ВПГ-1, ВПГ-2 и ВЭБ в развитии хронического воспаления слизистой желудка и ДПК.
В свою очередь, динамика вирусного инфицирования достоверно отрицательно коррелировала с динамикой лимфоцитарной инфильтрации слизистых: ВПГ-1 с CD3+ (R=-0,47; />=0,03), ВЭБ с CD45+ (R=-0,56; /=0,009), ВПЧ с CD 45+ (R=-0,53; /=0,01). Вероятно, увеличение популяций лимфоцитов в СО на фоне проводимого лечения привело к снижению частоты обнаружения вирусных антигенов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Щербаков П.Л, Корсунский А.А., Исаков В.А. Болезни органов пищеварения у детей при хеликобактериозе. М.: Медицинское информационное агенство, 2011; 10—17.
2. Warren J.R., Marshall ¿./.Unidentified curved bacilli in the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration. Lancet 1983; 1: 1311—1315.
3. Correa P., Piazuelo M.B. Helicobacter pylori infection and gastric Adenocarcinoma. US Gastroenterol Hepatol Rev 2011; 7: 1: 59—64.
4. Marnelli A., Bautista-Quach et al. Gastrointestinal lymphomas: morphology, immunophenotype and molecular features. J Gastrointest Oncol 2012; 3: 3: 209—225.
5. Pietroiusti А, Luzzi I, Gomez M./., Magrini A. Helicobacter pylori duodenal colonization is a strong risk factor for the development of duodenal ulcer. Aliment Pharmacol Ther 2005; 21: 7: 909—915.
6. Циммерман Я.С. Проблема хронического гастрита. Гастроэнтерология: руководство. М.: 2013; 2: 52—77.
7. Нелюбин В Н., Мудров В.П., Сепиашвили Р.И. Особенности инфицирования барьерных тканей. Аллергол иммунол 2010; 11: 2: 98—102.
Заключение
Применение иммуномодулирующего препарата циклоферон у детей, страдающих хроническими гастродуоденитами, приводит к достоверному увеличению Т- и В-клеточных популяций в слизистых оболочках желудка и двенадцатиперстной кишки, нормализации количества цитотоксических лимфоцитов, повышению титра антител класса ^О к вирусам герпеса 1-го и 2-го типа и, тем самым, способствует элиминации вирусов. В результате этого происходит снижение выраженности и активности воспалительного процесса в слизистых и уменьшение клинических проявлений заболевания.
Наличие статистически значимой связи между показателями, характеризующими редукцию экспрессии вирусных антигенов, и динамикой выраженности морфологических проявлений в слизистой оболочке желудка и ДПК подтверждает этиопатогенетическую роль герпесвирусных инфекций, прежде всего герпеса 1-го и 2-го типа в развитии хронического гастрита и дуоденита.
8. Крулевский В.А., Петровский А.Н., Аничков В Н., Новикова В Н. Хронический гастрит и герпетические инфекции у лиц разного возраста. Архив патол 2010; 72: 1: 33-35.
9. Каткова Н.Ю., Жукова Е.А., Шабунина Е.И., Видманова Т.А. и др. Динамика клинико-морфологических и микробиологических изменений при хроническом гастродуодените у детей. Практ мед 2012; 6: 61: 86-89.
10. Романова Е.И., Красавцев Е.Л. Герпетическая инфекция, вызванная вирусами ВПГ-1 и ВПГ-2: Пособие. Минск: Зималетто, 2012; 36.
11. Исаков В.А. и др. Индукторы интерферонов - эффективные препараты для терапии вирусных инфекций. Герпесвирусные инфекции человека: руководство для врачей / Под ред. В. А. Исакова. СПб.: 2013; 12: 588-640.
12. Ершов Ф.И., Романцов М.Г, Мельникова И.Ю. Антивирусные препараты в практике педиатра: справ. практикующего врача. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013; 30-49.
