CC BY
95
терии прорастали на третьи сутки, грибы — на пятые. Поскольку для испытания использовались фильтро-элементы со встроенными мембранами, оценить адсорбцию антибиотиков количественно невозможно, поэтому условия валидации первоначально подбирались с учетом ранее проведенных исследований по адсорбции антибиотиков на нитрат целлюлозных фильтрах.
Результатыисследованийпредставленывтаблице, где приведены количества антибиотика в пересчете на активное вещество, пропущенное через мембрану, общий объем промывной жидкости, количество (3-лактамазы на мл среды (для (З-лактамных антибиотиков). По данным таблицы 1 видно, что антибиотики амикацин, левофлоксацин, капреомицин, линкомицин, фосфомицин в условиях испытания не препятствуют росту чувствительных к ним микроорганизмов, в этом случае не требуется дополнительных мероприятий при проведении теста стерильность и полученные результаты считаются валидными. Обнаружен рост всех используемых тест-микроорганизмов на соответствующих питательных средах. Для изученных (3-лактамных антибиотиков групп цефалоспо-ринов и пенициллинов, в том числе и ингибиторо-защищенных, также получены удовлетворительные результаты, единственное отличие — это добавление пенициллиназы в питательные среды. Валидацион-ные исследования подтверждают, что используемый метод нейтрализации эффективен. Исключение составил антибиотик меропенем, относящийся к группе карбапенемов. По сравнению с пенициллинами и цефалоспоринами меропенем более устойчив к действию бактериальных (3-лактамаз и оказывает бактерицидное действие на широкий спектр грам-положительных, грамотрицательных, аэробных и
ЛИТЕРАТУРА
анаэробных микроорганизмов. В условиях испытания получены неудовлетворительные результаты для всех тест-микроорганизмов, за исключением грибов. При уменьшении количества активного вещества до минимально допустимого 0,15 г и увеличения объема промывной жидкости до максимально допустимого 500 мл рост в тиогликолевой среде отмечен только для бактериальной культуры St. aureus. Учитывая отрицательный результат, необходимо отметить, что в случае меропенема при определении стерильности можно выявлять только устойчивые формы, т.к. остаточные количества антибиотика, адсорбированного фильтром, делают практически невозможным выделение чувствительной к нему микрофлоры, которая может присутствовать в препарате.
Анализ полученных результатов проведенного исследования позволяет сделать следующие выводы:
■ подобраны условия проведения теста стерильности методом мембранной фильтрации для целого ряда антибиотиков различной химической структуры и микробного действия;
■ при оценке полноты отмывания мембраны от антибиотиков и при возможности нейтрализации их остаточных количеств необходимо использовать целый ряд тест-микроорганизмов для подтверждения, что применяемые методы эффективны и позволяют выявлять не только устойчивые микроорганизмы к испытуемому антибиотику, но и возможное присутствие чувствительных микроорганизмов;
■ при получении отрицательных результатов валидации для выявления чувствительных микроорганизмов необходим подбор веществ, способных нейтрализовать остаточные количества антибиотика, адсорбированного на фильтре.
1. Климова Н.Е., Григорьева В.М. «Метод мембранной фильтрации для определения стерильности и микробной обсемененности антибиотиков». Антибиотики, том XXII. 1977.С. 113-116.
2. Быстрова Л.В., Кулешова С.И. «Инактивация препаратов антибиотиков группы цефалоспоринов при испытании на стерильность». X
Российский национальный конгресс «Человек и лекарство».Москва, 2003, с.727-728.
3. ГФ РФXII, часть 1, ОФС 42-0066-07 С. 150-159.
4. Европейская Фармакопея, 7-е издание дополнение 2,монография 2.6.1. «Sterility» 04/2011:2061.
ПРИМЕНЕНИЕ ПОДВИЖНЫХ ФАЗ С ИОН-ПАРНЫМИ РЕАГЕНТАМИ ДЛЯ РАЗДЕЛЕНИЯ СМЕСЕЙ БЕНЗОЙНОЙ И СОРБИНОВОЙ КИСЛОТ
А.С. Осипов1, Е.Б. Нечаева1, О.А. Победин1, JI.A. Трухачёва2
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России, Москва 2Первый московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова, Москва
Osipov @regmed. ru
Резюме: В работе приведены результаты исследования влияния ион-парных реагентов на хроматографирование сорбиновой и бензойной кислот на примере тетрабутиламмония гидрогенсульфата (ТБА) и тетраметиламмония гидрогенсульфата (ТМА). Ион-парный реагент ТБА увеличивает время удерживания и улучшает форму пика сорбиновой кислоты. Наилучшая форма пиков была достигнута с использованием подвижной фазы, содержащей 5мМ ТБА, на колонках Диасфер фенил, Диасфер нитрил и Hypersil ODS. Уменьшение содержания ТБА в подвижной фазе ухудшает хроматографические параметры пика сорбиновой кислоты. Ввод в состав подвижной фазы 10 мМ К2НРО4 (pH 6,0) сокращает коэффициенты ёмкости (времена удерживания) анализируемых кислот. При этом улучшается разрешение компонентов и меняется очерёдность элюирования кислот при хроматографировании их смесей (бензойная кислота элюируется первой).
Ключевые слова: ВЭЖХ, сорбиновая кислота, бензойная кислота.
THE USE OF MOBILE PHASES WITH ION-PAIRING REAGENTS FOR SEPARATION OF MIXTURES OF BENZOIC AND SORBIC ACIDS A.S. Osipov, E.B. Nechaeva, O.A. Pobedin, L.A. Truhacheva
Abstract: The influence of ion - pair reagents on performing chromatography of sorbic and benzoic acids has been studied as exemplified by tetrabutylammonium hydrogen sulfate (TBA) and tetramethylammonium hydrogen sulfate (TMAS). Ion-pair reagent TBA increases the retention time and improves the peak shape of sorbic acid. The best peak shape has been obtained using mobile phase containing 5 mM of TBA in columns Diaspher phenyl, Diaspher nitrite and Hypersil ODS. Decrease in the concentration of TBA in the mobile phase worsens the chromatographic peak parameters of sorbic acid. Adding 10 mM K2HPO4 (pH 6.0) to the mobile phase reduces the capacity factors (retention times) of the analyzed acids. At the same time it improves the resolution of components and changes the order of acids elution when performing chromatography in their mixtures (benzoic acid is eluted first).
Key words: HPLC, sorbic acid, benzoic acid.
Бензойная и сорбиновая кислоты а также их калийные и натриевые соли [1—3] применяются в фармацевтической и пищевой промышленности как антимикробные консерванты. Консерванты описаны в ведущих зарубежных Фармакопеях, однако методики их анализа с помощью ВЭЖХ в них не приведены. Для хроматографирования сорбиновой кислоты наиболее рационально использовать подвижные фазы с кислым значением pH или с ион-парными реагентами [4, 5]. Необходимо отметить, что применение в анализе подвижных фаз с кислым значением pH (0,085%) фосфорная кислота в воде или 25—50мМ фосфатный буферный раствор (pH 3,0) не позволяет разделять бензойную и сорбиновую кислоты на колонках с сорбентами С8 и С18 [5]. С использованием подвижных фаз, содержащих фосфатный буферный раствор (pH 3,0), разделение консервантов возможно только на колонках с фенильными или нитрильными сорбентами [6].
Цель работы: исследовать возможность применения подвижных фаз с ион-парными реагентами для разделения смесей бензойной и сорбиновой кислот. Необходимо отметить, что в продуктах питания в качестве консервантов могут одновременно применяться сорбиновая и бензойная кислоты [7]. При опреде-
лении сорбиновой и бензойной кислот в продуктах питания применяют метод тонкослойной хроматографии или нормально-фазовую ВЭЖХ на колонке, заполненной немодифицированным силикагелем. Подготовка проб основана на извлечении бензойной и сорбиновой кислот из пищевых продуктов перегонкой с паром и/или экстракцией органическими растворителями [7].
Следует отметить, что подавляющее большинство лекарственных препаратов анализируется в условиях обращено-фазовой ВЭЖХ. Кроме того, подготовка проб лекарственных препаратов для нормально-фа-зовой хроматографии в большинстве случаев более трудоёмка. По этой причине экспериментальная часть работы была посвящена разработке хроматографических условий определения сорбиновой и бензойной кислот в условиях обращено-фазовой хроматографии.
Работа проводилась с использованием хроматографа «Agilent» серия 1100 с диодно-матричным детектором (Agilent Technologies, США). При хроматографирования применяли колонки производства фирм БиоХимМак (Россия) и Agilent Technologies (США). Для хроматографирования использовали стандартные образцы бензойной и сорбиновой кис-
Рис. 1. Хроматограмма разделения модельной смеси органических кислот
Условия анализа: колонка — Нурегяіі ОББ 150х 4,6мм, 5мкм.; скорость потока — 1,0мл/мин; подвижная фаза: метанол—5мМ ТБА в воде (3:7); детектирование при 225нм; 1 — бензойная кислота; 2 — сорбиновая кислота
Рис. 2. Хроматограмма разделения модельной смеси органических кислот
Условия анализа: колонка — Hypersil ODS 150x4,6мм, 5мкм.; скорость потока — 1,0мл/мин; подвижная фаза: метанол—5мМ ТБА ЮмМК2НРО4 (pH 6,0) в воде (3:7); детектирование при 225нм 1 — бензойная кислота; 2 — сорбиновая кислота
лот (Sigma, США). В составе подвижных фаз применяли тетрабутиламмония гидрогенсульфат и тетраме-тиламмония гидрогенсульфат (Merck, Германия)
Влияние ион-парных реагентов на хроматографирование сорбиновой и бензойной кислот изучалось на примере тетрабутиламмония гидрогенсульфата (ТБА). Необходимо отметить, что ТБА наиболее часто применяется в хроматографии в качестве катионного ион-парного реагента. На процесс хроматогафиро-вания изучалось также влияние тетраметиламмония гидрогенсульфата (ТМА). Являясь четвертичными аммониевыми основаниями данные реагенты способны стабилизировать анион кислот с образованием гидрофобного ион-парного комплекса, который способен сорбироваться на хроматографической
колонке. Хроматографирование сорбиновой кислоты исследовалось более детально (таб. 1), бензойная кислота анализировалась только на колонке Hypersil ODS (таб. 2). По причине того, что тестировались хроматографические колонки различной длины (150 и 250 мм) в качестве меры оценки эффективности колонки использовалось число теоретических тарелок на метр колонки (т.т./метр).
При использовании подвижной фазы метанол — вода (3:7) времена удерживания (коэффициенты ёмкости) сорбиновой кислоты незначительные. Эффективность колонки и форма пика недостаточны для выполнения измерений на всех тестированных колонках. Ион-парный реагент ТБА увеличивает время удерживания и улучшает форму пика сорбиновой кислоты. Наилучшая форма пиков была достигнута с использованием подвижной фазы, содержащей 5 мМ ТБА, на колонках Диасфер фенил, Диасфер нитрил и Hypersil ODS. Уменьшение содержания ТБА в подвижной фазе ухудшает хроматографические параметры пика сорбиновой кислоты. При применении подвижной фазы с 2,5 мМ ТБА только для колонки Диасфер Нитрил были получены удовлетворительные результаты хроматографирования (эффективность 7100 т.т., асимметрия пика сорбиновой кислоты 1,15).
Применение в составе подвижной фазы метанола обеспечивает лучшую форму пиков сорбиновой и бензойной кислот. Ввод в состав подвижной фазы 10 мМ К2НРО4 (pH 6,0) сокращает коэффициенты ёмкости (времена удерживания) анализируемых кислот. Необходимо отметить, что при этом улучшается разрешение компонентов и меняется очерёдность элюирования кислот при хроматографировании их смесей (рис. 1 и 2).
Ион-парный реагент ТМА также увеличивает время удерживания и улучшает форму пиков сорбиновой и бензойной кислоты. Однако, при применении подвижной фазы метанол—5мМ ТМА в воде (3:7) не наблюдается разделения сорбиновой и бензойной кислот. В сравнении с подвижной фазой, содержащей метанол—5мМ ТБА, 10 мМ К2НРО4 (pH 6,0), при хроматографировани с подвижной фазой метанол—5мМ ТМА 10 мМ К2НРО4 (pH 6,0) значительно сокращаются коэффициенты ёмкости анализируемых кислот, но при этом также становится возможным разделение сорбиновой и бензойной кислот (таб.1 и 2).
Очерёдность элюирования компонентов смеси аналогично применению подвижной фазы, содержащей метанол—5мМ ТБА, 10 мМ К2НРО4 (pH 6,0) в воде (3:7) (рис. 2).
Таким образом, хроматографирование с подвижными фазами, содержащими катионные ион-парные реагенты позволяет разделять сорбиновую и бензойные кислоты. При этом хроматографические
пики кислот имеют правильную форму. Наилучшее разделение сорбиновой и бензойной кислот было достигнуто с использованием подвижной фазы 5мМ ТБА, 10 мМ К2НРО4 (pH 6,0) в воде (3:7)
Таблица 1. Хроматографирование сорбиновой кислоты с ион-парными реагентами
Коэффи- Эффективность Асимме-
Условия хроматографии: колонка, подвижная фаза, скорость потока циент колонки трия
ёмкости (в т.т/метр.) пика
Диасфер-110-С18 150x4,6мм; метанол—вода (3:7), 1 мл/мин 0,98 2220 0,64
Zorbax Eclipse XDB — С18 150x4,6мм; метанол—вода (3:7), 1 мл/мин 0,88 2566 0,71
Диасфер-110-фенил 150x4,6мм; метанол—вода (3:7), 1мл/мин 0,07 4046 0,70
Диасфер-110-нитрил 250х 4,0мм; метанол—вода (3:7), 0,8мл/мин 0,15 2076 0,62
Диасфер- 110-С18 150x4,6мм; метанол-5мМТБА ЮмМ ЮНР04(pH 6,0) вводе (3:7), 1 мл/мин 8,57 50066 0,72
Диасфер-110-фенил 150х 4,6мм; метанол - 5мМ ТБА ЮмМ К2НР04 (pH 6,0) вводе (3:7), 1 мл/ 5,59 52666 1,13
Диасфер -110-нитрил 250x4,0мм; метанол-5мМ ТБА ЮмМ К2НРО4 (pH 6,0) в воде (3:7), 0,8мл/ 1,07 30280 1,22
Диасфер-110-фенил 150x4,6мм; метанол-2,5мМ ТБА ЮмМ К2НРО4 (pH 6,0) в воде (3:7), 1 мл/ 5,19 16166 0,81
Диасфер -110-нитрил 250x4,0мм; метанол-2,5мМ ТБА ЮмМ К2НРО4 (pH 6,0) в воде (3:7), 0,8 мл/мин 0,81 28400 1,15
Hypersil ODS 150x4,6мм ацетонитрил—5мМ ТБАвводе (3:7), 1,0мл/мин 2,33 60360 1,75
Hypersil ODS 150x4,6мм метанол—5мМ ТБАв воде (3:7), 1,0 мл/мин 9,43 54560 1,03
Hypersil ODS 150x4,6мм метанол-5мМ ТБА ЮмМ К2НРО4 (pH 6,0) в воде (3:7), 1,0 мл/мин 5,19 48766 1,086
Hypersil ODS 150x4,6мм метанол—5мМ ТМА в воде (3:7), 1,0мл/мин 9,36 24793 0,86
Hypersil ODS 150x4,6мм метанол-5мМ ТМА ЮмМ ЮНР04 (pH 6,0) в воде (3:7), 1,0 мл/мин 1,05 17633 1,25
Таблица 2. Хроматографирование бензойной кислоты с ион-парными реагентами
Условия хроматографии: колонка, подвижная фаза, скорость потока Коэффициент ёмкости Эффективность колонки (в т.т/метр.) Асимметрия пика
НурегеП 008 150x4,6мм ацетонитрил—5мМ ТБА вводе (3:7), 1,0 мл/мин 2,43 61773 1,71
НурегеП 008 150x4,6мм метанол—5мМ ТБАв воде (3:7), 1,0 мл/мин 10,00 53626 1,06
НурегеП 008 150x4,6мм метанол—5мМ ТБА ЮмМ ЮНР04(рН 6,0) в воде (3:7), 1,0 мл/мин 4,25 47586 1,02
НурегеП 008 150x4,6мм метанол— 5мМТМАвводе (3:7), 1,0мл/мин 9,23 22646 0,91
НурегеЦ 008 150x4,6мм метанол— 5мМТМАвводе (4:6), 1,0мл/мин 4,04 21273 0,86
Нурегей 008 150x4,6мм метанол—5мМ ТМА ЮмМ К2НРО4 (pH 6,0) в воде (3:7), 1,0 мл/мин 0,79 15133 1,08
ЛИТЕРАТУРА
1. British Pharmacopoeia 2009. Monograph: Potassium Sorbate.
2. The United States Pharmacopoeia 35 - National Formulary 30. Monograph: Sodium Benzoate.
3. The United States Pharmacopoeia 35 - National Formulary 30. Monograph: Potassium Benzoate.
4. Музычка E.A., Осипов A.C. Применение ион - парной хроматогафии для анализа сорбиновой кислоты.//Тез. Докл. XVII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». М. 2010. С. 685.
5. Музычка Е.А., Осипов А.С. Применение высокоэффективной жид-
костной хроматогафии для анализа сорбиновой кислоты.// Тез. Докл. XVII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». М. 2010. С. 685.
6. Осипов А.С., Нечаева Е.Б. Применение капроновой и циклогексан-карбоновой кислот для анализа бензойной и сорбиновой кислот.// Ведомости НЦЭСМП, 2012, №1. С. 15-18.
7. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов. //под ред. И.М. Скурихина, В.А. Тутельяна. М.: Медицина, 1998. С.330-337.
