CC BY
312
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕРИЛЬНОСТИ ПРЕПАРАТОВ АНТИБИОТИКОВ. ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДА
С.И. Кулешова, С.А. Процак, С.И. Вилкова, Г.Ю. Романюк, Е.Н. Семенова
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России, Москва Kuleshova @regmed. ru
Резюме: В статье рассмотрен вопрос контроля снятия остаточного антимикробного действия антибиотиков при определении стерильности методом мембранной фильтрации. Исследования проведены в рамках валидации теста «Стерильность» в части определения полноты отмывания мембранных фильтров от остаточных количеств антибиотиков с использованием тест - микроорганизмов, рекомендованных Европейкой Фармакопеей 7-го издания. Получены положительные результаты для препаратов антибиотиков групп цефалоспоринов, пенициллинов, аминогликозидов, фторхинолонов; подобраны количества пе-нициллиназы нейтрализующие /3-лактамные антибиотики в процессе тестирования на стерильность их инъекционных лекарственных форм.
Ключевые слова: антибиотики, стерильность, мембранная фильтрация, нейтрализация противомикробных свойств, контроль полноты отмывания мембраны.
STERILITY TESTING OF ANTIBIOTIC PREPARATIONS.
VALIDATION OF THE METHOD S.I. Kuleshova, S.A. Protsak, S.I. Vilkova, G. Y Romanyuk, E.N. Semenova
Abstract: The following article describes the control of removal of residual antimicrobial activity of antibiotics when performing sterility test by membrane filtration method. The research has been carried out as a part of sterility testing validation related to determination of the completeness of membrane filters washing from residual quantities of antibiotics using test organisms recommended by the European Pharmacopoeia. Positive results have been receivedfor antibiotic preparations representing the following groups: cephalosporins, penicillins, aminoglycosides, fluoruquinolones; appropriate quantities of penicillinase neutralizing fi-lactam antibiotics have been selected while performing sterility testing of their parenteral preparations.
Key words: antibiotics, sterility, membrane filtration, neutralization of antimicrobial activity, control of the completeness of membrane filters washing.
Известно, что проверка стерильности препаратов, обладающих антимикробными свойствами, является нелегкой задачей. В настоящее время для контроля стерильности растворимых инъекционных лекарственных средств, обладающих противомикробным действием, фармакопеями всех стран рекомендован метод мембранной фильтрации. Вследствие способности антибиотиков сорбироваться на мембранных фильтрах в ряде случаев просто фильтрация не способна удалить достаточное количество антимикробного средства, чтобы обеспечить рост выживших микроорганизмов. Для минимизации сорбции рекомендовано использовать специальные фильтры для удаления остаточных количеств антибиотиков или их инактивации — промывание, разведение и специфические нейтрализаторы. (1, 2, 3, 4). Поскольку из применяяемых антибиотиков только пенициллины, цефалоспорины и монобактамы могут быть инактивированы в условиях in vitro специфическим ферментом пенициллиназой, для остальных антибиотиков необходимо комбинировать объем промывной жидкости и количество активного вещества, пропускаемого через мембрану. Все используемые способы и их комбинации должны подтверждаться валида-ционными исследованиями, демонстрирующими, что применяемые методы эффективны и позволяют выявлять не только устойчивые микроорганизмы к
испытуемому антибиотику, но и возможное присутствие чувствительных микроорганизмов, что особенно важно при испытании на стерильность инъекционных препаратов антибиотиков широкого спектра действия.
В настоящей работе представлены результаты валидации метода мембранной фильтрации при проведении теста «Стерильность» препаратов антибиотиков, полученные в Лаборатории антибиотиков Испытательного центра экспертизы качества лекарственных средств ФГБУ НЦЭСМП. Исследования проводились с целью установить объем промывной жидкости, количество активного вещества, пропускаемого через мембрану, количество инактиватора, необходимого для нейтрализации каждого конкретного антибиотика. В настоящей работе рассмотрена только часть процедуры теста валидации на стерильность, касающаяся полноты отмывания мембранных фильтров от остаточных количеств антибиотиков.
Испытание проводили методом мембранной фильтрации на приборе «Стеритест Эквинокс» фирмы Миллипор с использованием специальных фильтро-элементов. Эти фильтроэлементы снабжены мембранными фильтрами «Дюрапор» с низкой сорбцией и рекомендованы для испытания на стерильность препаратов антибиотиков. Питательные среды готовили из сухих сред производства фирмы «НппесПа». Жид-
кую тиогликолевую среду — для выявления аэробных и анаэробных бактерий и жидкую соево-казеиновую среду — для выявления грибов. Данные среды по прописям полностью соответствуют средам, рекомендованным для испытания на стерильность ГФ XII, часть 1, ОФС 42-0066-07. Подготовку образцов к анализу также проводили в полном соответствии с ГФ XII, часть 1; при расчете количеств активного вещества, пропускаемого через мембрану, исходили из табл. 31.3. В качестве нейтрализатора для пенициллинов и цефалоспоринов использовали пенициллиназу производства ООО НПФ «БИОКАР», с активностью 106 ЕД на флакон, промывной жидкости — раствор натрия хлорида изотонического 0,9 % стерильного pH 7,0 и растворителя — воду дистиллированную стерильную.
Были исследованы инъекционные препараты антибиотиков различной химической структуры: це-фалоспорины (цефуроксим, цефамандол, цефтриак-сон, цефоперазон, цефтаролин, цефепим), амино-гликозиды (амикацин), карбапенемы (меропенем), фосфомицин, фторхинолоны (левофлоксацин), по-
липептиды (капреомицин), линкозамиды (линкоми-цин), пенициллины (ампициллин и оксациллин), в том числе и ингибиторозащищенные пенициллины (амоксициллин + клавулановая кислота; пипера-циллин + тазобактам), карбапенемы (меропенем). В скобках приведены международные непатентованные названия антибиотиков. От серии каждого препарата отбирали по 20 флаконов! 10 флаконов для контроля на бактерии, 10 — на грибы. Полноту отмывания мембраны от остаточных количеств антибиотика определяли с помощью тест-микроорганизмов, рекомендованных Европейской Фармакопеей 7.2 издания, Bacillus subtilis АТСС 6633, Clostrdium sporogenes АТСС 19404, Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027, Staphylococcus aureus АТСС 6538, Aspergillus brasiliensis (niger) ATCC 16404, Candida albicans ATCC 10231. В 100 мл среды вносили от 10 до 100 КОЕ. Количество микроорганизмов устанавливали по стандарту мутности, аттестованному ГИСК им. Л.А Тарасеви-ча, с последующим прямым посевом в агар на чашках Петри. Результат считался положительным, если бак-
Таблица 1. Результаты анализа контроля полноты отмывания фильтров «Дюрапор» при определении стерильности препаратов антибиотиков методом мембранной фильтрации на приборе «Стеритест Эквинокс»
о о ё ё х ь * A S a i Тест-микрооганизмы, используемые для контроля полноты отмывания мембраны от остаточных количеств антибиотика
1 lit я и о и X у I& ^ * 2 S Тиогликолевая среда Соево-казеиновая среда
jj л о ю 1 М 0 _г S 2 2 м IS S, 1 g а м Э * m а> и 1 5 1° & * 1 vg О ё а S3 = 1 о 5 «| Bacillus subtilis АТСС 6633 Clostrdium sporogene АТСС 19404 Pseudo- monas aeruginosa АТСС 9027 Staphyloco-cus aureus ATCC 6538 Aspergillus brasiliensis (niger) ATCC 16404 Candida albicans ATCC 10231 Bacillus subtilis ATCC 6633
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Амикацин 500 300 Н/П + + + + + + +
Цефуро-ксим 500 300 100 + + + + + + +
Цефамандол 500 300 100 + + + + + + +
Цефтриак-сон 500 300 100 + + + + + + +
Цефопера-зон 500 300 100 + + + + + + +
Цефепим 500 300 100 + + + + + + +
Цефтаролин 500 300 100 + + + + + + +
Меропенем 500 300 100 - - - - - - -
150 500 100 - - - + + + +
Фосфомицин 500 300 Н/П + + + + + + +
Левофлокса-цин 500 300 Н/П + + + + + + +
Капреомицин 500 300 Н/П + + + + + + +
Линкомицин 500 300 Н/П + + + + + + +
Амоксицил-лин+ клавулано-вая кислота 500 300 100 + + + + + + +
Пипера цил-лин + тазобактам 500 300 100 + + + + Н/П Н/П +
Ампицил-лин + оксациллин 500 300 100 + + + + + + +
ПРИМЕЧАНИЕ: Н/П — не применяли, (+) — наличие роста тест-микроорганизмов, ( — ) — отсутствие роста тест-микроорганизмов
терии прорастали на третьи сутки, грибы — на пятые. Поскольку для испытания использовались фильтро-элементы со встроенными мембранами, оценить адсорбцию антибиотиков количественно невозможно, поэтому условия валидации первоначально подбирались с учетом ранее проведенных исследований по адсорбции антибиотиков на нитрат целлюлозных фильтрах.
Результатыисследованийпредставленывтаблице, где приведены количества антибиотика в пересчете на активное вещество, пропущенное через мембрану, общий объем промывной жидкости, количество (3-лактамазы на мл среды (для (З-лактамных антибиотиков). По данным таблицы 1 видно, что антибиотики амикацин, левофлоксацин, капреомицин, линкомицин, фосфомицин в условиях испытания не препятствуют росту чувствительных к ним микроорганизмов, в этом случае не требуется дополнительных мероприятий при проведении теста стерильность и полученные результаты считаются валидными. Обнаружен рост всех используемых тест-микроорганизмов на соответствующих питательных средах. Для изученных (3-лактамных антибиотиков групп цефалоспо-ринов и пенициллинов, в том числе и ингибиторо-защищенных, также получены удовлетворительные результаты, единственное отличие — это добавление пенициллиназы в питательные среды. Валидацион-ные исследования подтверждают, что используемый метод нейтрализации эффективен. Исключение составил антибиотик меропенем, относящийся к группе карбапенемов. По сравнению с пенициллинами и цефалоспоринами меропенем более устойчив к действию бактериальных (3-лактамаз и оказывает бактерицидное действие на широкий спектр грам-положительных, грамотрицательных, аэробных и
ЛИТЕРАТУРА
анаэробных микроорганизмов. В условиях испытания получены неудовлетворительные результаты для всех тест-микроорганизмов, за исключением грибов. При уменьшении количества активного вещества до минимально допустимого 0,15 г и увеличения объема промывной жидкости до максимально допустимого 500 мл рост в тиогликолевой среде отмечен только для бактериальной культуры St. aureus. Учитывая отрицательный результат, необходимо отметить, что в случае меропенема при определении стерильности можно выявлять только устойчивые формы, т.к. остаточные количества антибиотика, адсорбированного фильтром, делают практически невозможным выделение чувствительной к нему микрофлоры, которая может присутствовать в препарате.
Анализ полученных результатов проведенного исследования позволяет сделать следующие выводы:
■ подобраны условия проведения теста стерильности методом мембранной фильтрации для целого ряда антибиотиков различной химической структуры и микробного действия;
■ при оценке полноты отмывания мембраны от антибиотиков и при возможности нейтрализации их остаточных количеств необходимо использовать целый ряд тест-микроорганизмов для подтверждения, что применяемые методы эффективны и позволяют выявлять не только устойчивые микроорганизмы к испытуемому антибиотику, но и возможное присутствие чувствительных микроорганизмов;
■ при получении отрицательных результатов валидации для выявления чувствительных микроорганизмов необходим подбор веществ, способных нейтрализовать остаточные количества антибиотика, адсорбированного на фильтре.
1. Климова Н.Е., Григорьева В.М. «Метод мембранной фильтрации для определения стерильности и микробной обсемененности антибиотиков». Антибиотики, том XXII. 1977.С. 113-116.
2. Быстрова Л.В., Кулешова С.И. «Инактивация препаратов антибиотиков группы цефалоспоринов при испытании на стерильность». X
Российский национальный конгресс «Человек и лекарство».Москва, 2003, с.727-728.
3. ГФ РФXII, часть 1, ОФС 42-0066-07 С. 150-159.
4. Европейская Фармакопея, 7-е издание дополнение 2,монография 2.6.1. «Sterility» 04/2011:2061.
ПРИМЕНЕНИЕ ПОДВИЖНЫХ ФАЗ С ИОН-ПАРНЫМИ РЕАГЕНТАМИ ДЛЯ РАЗДЕЛЕНИЯ СМЕСЕЙ БЕНЗОЙНОЙ И СОРБИНОВОЙ КИСЛОТ
А.С. Осипов1, Е.Б. Нечаева1, О.А. Победин1, JI.A. Трухачёва2
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России, Москва 2Первый московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова, Москва Osipov @regmed. ru
Резюме: В работе приведены результаты исследования влияния ион-парных реагентов на хроматографирование сорбиновой и бензойной кислот на примере тетрабутиламмония гидрогенсульфата (ТБА) и тетраметиламмония гидрогенсульфата (ТМА). Ион-парный реагент ТБА увеличивает время удерживания и улучшает форму пика сорбиновой кислоты. Наилучшая форма пиков была достигнута с использованием подвижной фазы, содержащей 5мМ ТБА, на колонках Диасфер фенил, Диасфер нитрил и Hypersil ODS. Уменьшение содержания ТБА в подвижной фазе ухудшает хроматографические параметры пика сорбиновой кислоты. Ввод в состав подвижной фазы 10 мМ К2НРО4 (pH 6,0) сокращает коэффициенты ёмкости (времена удерживания) анализируемых кислот. При этом улучшается разрешение компонентов и меняется очерёдность элюирования кислот при хроматографировании их смесей (бензойная кислота элюируется первой).
Ключевые слова: ВЭЖХ, сорбиновая кислота, бензойная кислота.
THE USE OF MOBILE PHASES WITH ION-PAIRING REAGENTS FOR SEPARATION OF MIXTURES OF BENZOIC AND SORBIC ACIDS A.S. Osipov, E.B. Nechaeva, O.A. Pobedin, L.A. Truhacheva
Abstract: The influence of ion - pair reagents on performing chromatography of sorbic and benzoic acids has been studied as exemplified by tetrabutylammonium hydrogen sulfate (TBA) and tetramethylammonium hydrogen sulfate (TMAS). Ion-pair reagent TBA increases the retention time and improves the peak shape of sorbic acid. The best peak shape has been obtained using mobile phase containing 5 mM of TBA in columns Diaspher phenyl, Diaspher nitrile and Hypersil ODS. Decrease in the concentration of TBA in the mobile phase worsens the chromatographic peak parameters of sorbic acid. Adding 10 mM K2HPO4 (pH 6.0) to the mobile phase reduces the capacity factors (retention times) of the analyzed acids. At the same time it improves the resolution of components and changes the order of acids elution when performing chromatography in their mixtures (benzoic acid is eluted first).
Key words: HPLC, sorbic acid, benzoic acid.
Бензойная и сорбиновая кислоты а также их калийные и натриевые соли [1—3] применяются в фармацевтической и пищевой промышленности как антимикробные консерванты. Консерванты описаны в ведущих зарубежных Фармакопеях, однако методики их анализа с помощью ВЭЖХ в них не приведены. Для хроматографирования сорбиновой кислоты наиболее рационально использовать подвижные фазы с кислым значением pH или с ион-парными реагентами [4, 5]. Необходимо отметить, что применение в анализе подвижных фаз с кислым значением pH (0,085%) фосфорная кислота в воде или 25—50мМ фосфатный буферный раствор (pH 3,0) не позволяет разделять бензойную и сорбиновую кислоты на колонках с сорбентами С8 и С18 [5]. С использованием подвижных фаз, содержащих фосфатный буферный раствор (pH 3,0), разделение консервантов возможно только на колонках с фенильными или нитрильными сорбентами [6].
Цель работы: исследовать возможность применения подвижных фаз с ион-парными реагентами для разделения смесей бензойной и сорбиновой кислот. Необходимо отметить, что в продуктах питания в качестве консервантов могут одновременно применяться сорбиновая и бензойная кислоты [7]. При опреде-
лении сорбиновой и бензойной кислот в продуктах питания применяют метод тонкослойной хроматографии или нормально-фазовую ВЭЖХ на колонке, заполненной немодифицированным силикагелем. Подготовка проб основана на извлечении бензойной и сорбиновой кислот из пищевых продуктов перегонкой с паром и/или экстракцией органическими растворителями [7].
Следует отметить, что подавляющее большинство лекарственных препаратов анализируется в условиях обращено-фазовой ВЭЖХ. Кроме того, подготовка проб лекарственных препаратов для нормально-фа-зовой хроматографии в большинстве случаев более трудоёмка. По этой причине экспериментальная часть работы была посвящена разработке хроматографических условий определения сорбиновой и бензойной кислот в условиях обращено-фазовой хроматографии.
Работа проводилась с использованием хроматографа «Agilent» серия 1100 с диодно-матричным детектором (Agilent Technologies, США). При хроматографирования применяли колонки производства фирм БиоХимМак (Россия) и Agilent Technologies (США). Для хроматографирования использовали стандартные образцы бензойной и сорбиновой кис-
