CC BY
69
УДК 616.006.04:615.37:579.852.11:577.113:57.083.3
S.V. Olishevsky, V.V. Kozak, O.V. Mazur, V.A. Shlyakhovenko
APPLICATION OF BACILLUS SUBTILIS CpG DNA FOR EXPERIMENTAL IMMUNOTHERAPY OF TUMORS
R.E. Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology,
NAS of Ukraine, Kiev, Ukraine
ABSTRACT
Effect of bacterial DNA containing unmethylated cytosine and isolated from Bacillus subtilis culture medium on functional activity of murine peritoneal macrophages (PM^s) has been investigated. It has been shown that in vitro and in vivo bacterial CpG DNA (bCpG DNA) possesses marked stimulatory effect on phagocytic and metabolic activities of PM9s isolated from normal and solid Ehrlich carcinoma transplanted mice. Efficacy of immunotherapeutic application of bCpG DNA separately and combined with cancer glycopeptide vaccine was investigated using different experimental models of tumors. Administration of bCpG DNA to mice with solid sarcoma 37 or lymphoid leukemia L1210 results in life span increase of tumor-bearing mice. Combined application of bCpG DNA and cancer glycopeptide vaccine is able to potentiate the vaccine efficacy.
Key words: adjuvant, Bacillus subtilis, bacterial CpG DNA, cancer immunotherapy, cancer glycopeptide vaccine, increases in life span, peritoneal macrophages.
С.В. Олишевский, В.В. Козак, О.В. Мазур, В.А. Шляховенко
ПРИМЕНЕНИЕ CpG ДНК BACILLUS SUBTILIS В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИММУНОТЕРАПИИ ОПУХОЛЕЙ
Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины, Киев, Украина
РЕЗЮМЕ
В данной работе исследовано влияние бактериальной ДНК, обогащенной последовательностями с неме-тилированным цитозином, которая была получена из культуральной жидкости Bacillus subtilis, на функциональную активность перитонеальных макрофагов мышей (ПМФ). Показано, что в условиях in vitro, а также при введении животным бактериальная CpG ДНК (6CpG ДНК) оказывает выраженное стимулирующее влияние на фагоцитарную и метаболическую активность ПМФ, полученных как от здоровых животных, так и от мышей с солидной карциномой Эрлиха. На экспериментальных моделях опухолевого роста изучена эффективность применения 6CpG ДНК отдельно и в качестве адъюванта - с противоопухолевой гликопептид-ной вакциной. Показано, что введение 6CpG ДНК мышам с солидной саркомой 37 или лимфоидной лейкемией L1210 приводит к увеличению продолжительности жизни животных-опухоленосителей, а при совместном применении с противоопухолевой гликопептидной вакциной может повышать эффективность применения последней.
Ключевые слова: адъювант, бактериальная CpG ДНК, противоопухолевая вакцина гликопептидная, иммунотерапия рака, перитонеальные макрофаги, увеличение продолжительности жизни, Bacillus subtilis.
ВВЕДЕНИЕ
Еще в 1880 г. нью-йоркский хирург W. Coley впервые применил микроорганизмы для лечения больных раком, когда непосредственно в опухоль вводил живые бактерии (Streptococcus pyogenes отдельно либо совместно с Serratia marcescens) или неочищенные бактериальные экстракты, в дальнейшем получившие название токсинов Coley, что приводило к выраженной регрессии опухоли или длительной ре-
миссии заболевания, однако сопровождалось высоким риском развития рожистого воспаления или сильной токсичностью [11]. С тех пор много различных бактерий и их отдельных компонентов были предложены в качестве экспериментальных средств и стратегий для лечения злокачественных новообразований, однако преобладающее большинство из них не достигли уровня фармакологических препаратов и не стали применяться в клинической практике [16; 26]. Вакци-
на БЦЖ, состоящая из аттенуированных бактерий штамма Bacillus Calmette-Guerin и их отдельных компонентов, представляет собой наиболее яркий пример немногочисленных препаратов микробного происхождения, которые все же нашли применение в онкологической практике [32]. Со временем оказалось, что бактериальная ДНК, также входящая в состав БЦЖ, обладает выраженным противоопухолевым потенциалом [16], а ее иммуностимулирующие свойства определяются неметилированными CG-динуклеотидами [15]. Согласно теории «danger signal» бактериальная ДНК, взаимодействуя с Toll-like рецептором 9, экспрессирующимся в клетках иммунной системы, воспринимается организмом как патогенный агент, что приводит к стремительной и мощной активации различных неспецифических механизмов иммунологической защиты, обеспечивающих первую «линию обороны» против инфекционных возбудителей, паразитов и трансформированных клеток [4; 16; 23]. Одним из наиболее примечательных свойств CpG ДНК является способность значительно повышать уровень иммунного ответа даже на очень низкоиммуногенные антигены [15; 16; 23], что послужило толчком к созданию большого количества синтетических CpG-олигонуклеотидов и исследованию эффективности их применения в иммунотерапии целого ряда заболеваний, среди которых инфекционные болезни, аллергия и рак [4; 23; 35]. Среди существующего разнообразия подходов к применению иммуностимулирующей CрG ДНК в иммунотерапии рака можно выделить несколько основных стратегий:
а) монотерапия CрG ДНК;
б) применение CрG ДНК в составе ДНК-вакцин;
в) использование CрG ДНК в качестве адъюванта для повышения эффективности противоопухолевых вакцин или моноклональных антител;
г) применение CрG ДНК как иммуностимулятора или иммунопротектора при сопроводительной терапии;
д) использование CрG ДНК для потенцирования эффекта других методов противоопухолевой терапии (например, цитостатической или радиолучевой терапии) [4].
В предыдущих исследованиях нами было показано, что внеклеточная бактериальная ДНК, выделенная из культуральной жидкости Bacillus subtilis и обогащенная неметилированными CpG-мотивами [22], обладает выраженными иммуностимулирующими свойствами [21; 24; 30] и может быть достаточно перспективной в плане исследования ее возможного применения в иммунотерапии злокачественных новообразований [30].
Цель настоящего экспериментального исследования - изучение иммуностимулирующей активности, а также иммунотерапевтического и адъювантного потенциалов бактериальной CpG ДНК (6CpG ДНК) на моделях опухолей, различающихся по гистогенезу.
Задачи исследования:
• исследовать влияние 6CpG ДНК in vitro и in vivo на функциональную активность перитонеальных макрофагов (ПМФ);
• изучить эффективность применения 6CpG ДНК отдельно и в качестве адъюванта совместно с противоопухолевой гликопептидной вакциной на моделях солидной саркомы 37 и лимфоидной лейкемии L1210.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали ДНК, полученную из культуральной жидкости бактерии B. subtilis (штамм GP1-807-03, выделен нами в 2003 г. из образцов почвы, охарактеризован и задепонирован как штамм IMB B-7108 в коллекции микроорганизмов Института микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, г. Киев). Бактериальную ДНК получали по стандартной схеме выделения плазмид-ной ДНК с использованием полиэтиленгликоля 6000 и последующей преципитацией в 70%-ном этаноле. Отсутствие в изолированной ДНК примесей белков было подтверждено с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Для определения содержания в исследуемой ДНК неметилированных CG-динулеотидов проводили рестрикционный анализ с использованием эндонуклеазы Hpa II с последующим импульсным электрофорезом в агарозном геле [22]. Очищенную 6CpG ДНК растворяли в 0,15 М стерильном фосфатном буферном растворе в концентрации 1,0 мг/мл и хранили, избегая повторного замораживания, при температуре -20 °С. Содержание бактериального эндотоксина в исследуемых образцах 6CpG ДНК, которое не превышало 0,1 нг/мг 6CpG ДНК, было определено с использованием Е-Toxate kit («Sigma», США) согласно [34].
Работа проведена на 3-месячных мышах линии BALB/c, гибридах BDFi (C57Bl/6*DBA) и нелинейных мышах разводки вивария ИЭПОР им. Р.Е. Кавец-кого НАН Украины, г. Киев. Все эксперименты выполнены при строгом соблюдении правил этического обращения с лабораторными животными. В исследованиях были использованы следующие штаммы экспериментальных опухолей: карцинома Эрлиха (КЭ), саркома 37 и лимфоидная лейкемия L1210, которые были получены из Национального банка клеточных линий и опухолевых штаммов ИЭПОР им. Р.Е. Кавец-кого НАН Украины, г. Киев. Солидные варианты КЭ и саркомы 37 трансплантировали BALB/с и нелинейным мышам подкожно в правый бок в количестве 1,5-2,5х105 клеток/животное. Лимфоидную лейкемию L1210 в количестве 1,5х105 клеток/животное интрапе-ритонеально инокулировали мышам BDFb
При изучении влияния 6CpG ДНК in vitro на функциональную активность ПМФ препарат вносили в инкубационную систему в концентрации 2,0 и 5,0 мкг/мл (преинкубация длилась 30 мин до проведения основного теста), в случае экспериментов in vivo -6CpG ДНК вводили однократно интраперитонеально в дозе 0,5 и 1,0 мг/кг массы тела интактным (или с солидной КЭ, на 10-е сут после трансплантации опухоли) мышам линии BALB/c.
ПМФ получали согласно [21] у неиммунизиро-ванных и иммунизированных 6CpG ДНК здоровых
(без опухоли) мышей и животных-опухоленосителей через 24 ч после введения исследуемой субстанции.
Фагоцитарную активность ПМФ по отношению к убитым и опсонизированным эмбриональной телячьей сывороткой клеткам Staphylococcus aureus 209 исследовали в микроскопическом тесте согласно [3]. Показатели фагоцитарной активности ПМФ оценивали путем подсчета фагоцитирующих клеток в мазках согласно [1]. Интенсивность фагоцитоза оценивали с определением индекса Гамбурга (ИГ) - % активно фагоцитирующих ПМФ от общего их количества; индекса Райта (ИР) - количества бактерий, захваченных одним ПМФ. Подвижность клеточной мембраны (ПКМ) ПМФ оценивали по степени их распластывания с помощью объект-микрометра; при этом распластанным считали ПМФ, размер которого превышал 15 мкм. Для каждого показателя оценивали 300-400 ПМФ в каждой пробе.
Опсонический индекс поглощения (ОИП) вычисляли по формуле:
ОИП = [ИРо/ИРк] х 100,
где ИРо и ИРк - ИР в опытной и контрольной пробах соответственно.
Индекс переваривания или так называемый индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ) вычисляли следующим образом:
ИЗФ = [(А-Б)/А] х 100,
где А - процент ПМФ, которые фагоцитировали бактерии;
Б - процент ПМФ, которые фагоцитировали и не переварили бактерии.
Метаболическую активность ПМФ оценивали в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) согласно [3]. Индекс метаболической активности ПМФ в спонтанном (без применения индукторов) НСТ-тесте (ИНСТспонт.) определяли по формуле:
Инстспонт. = [(Ео - Ек)/Ео] х 100 %,
где Ео и Ек - экстинкция опытных и контрольных образцов соответственно.
В качестве индуктора восстановления НСТ использовали эталонный стимулятор клеток лимфоидно-макрофагальных линий - форбол миристат ацетат (ФМА) в концентрации 10 нг нг/мл. ФМА вносили через 1 ч после инкубации ПМФ с 6CpG ДНК. Этот нагрузочный тест, проводимый in vitro, отображает резервные возможности ПМФ. На основании полученных данных рассчитывали резервный коэффициент (РК):
РК = ИНСТиндуц./И HCTcrom-^
где ИНСТиндуц. - индекс активности ПМФ в индуцированном НСТ-тесте;
ИНСТспонт. - индекс активности ПМФ в спонтанном НСТ-тесте.
Эффективность применения 6CpG ДНК исследовали в профилактическом и терапевтическом режимах введения. В первом случае введение исследуемой субстанции мышам осуществляли подкожно в подушечку задней правой лапки трижды с интервалом в 1 нед в дозе 0,5 мг/кг массы тела 6CpG ДНК в 0,1 мл физио-
логического раствора хлорида натрия. Через 24 ч после 3-го введения животным перевивали соответствующую опухоль. В терапевтическом режиме применения 6CpG ДНК вводили аналогично, осуществляя 1-ю инъекцию через 24 ч после инокуляции опухолевых клеток. Интервал между введениями составлял 3 сут.
Противоопухолевую гликопептидную вакцину (gp50), изготовленную согласно [29] из клеток гомологических опухолей, вводили мышам подкожно в подушечку задней левой лапки в дозе 10 000 эквивалентов клеток в изложенных выше режимах и схемах применения. Животные контрольных групп аналогично получали инъекции физиологического раствора хлорида натрия.
Эффективность применения 6CpG ДНК оценивали с помощью таких стандартных показателей, как средняя продолжительность жизни (СПЖ, сут) и увеличение СПЖ (УПЖ, %) животных-опухоленосителей [6]. УПЖ определяли по формуле:
УПЖ = [(СПЖо - СПЖк)/СПЖк] х 100 %,
где СПЖо и СПЖк - СПЖ в опытной и контрольной группах соответственно.
Статистический анализ данных, представленных как среднее арифметическое значение ± стандартное отклонение, проводили, используя критерий Стью-дента, с помощью компьютерной программы Graph-Pad InStat. Результаты в экспериментах по выживаемости анализировали с помощью теста Каплана-Мэйера.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что макрофаги (МФ) представляют собой одну из основных преград на пути вторжения патогенных бактерий, а также играют ключевую роль в неспецифической противоопухолевой резистентности организма и в инициации иммунного ответа в целом [2]. В основу комплексного исследования влияния 6CpG ДНК in vitro и in vivo на МФ было положено несколько стандартизированных функциональных тестов для исследования фагоцитарной и метаболической активности ПМФ. Следует отметить, что все показатели изучали как у здоровых животных (без опухоли), так и у животных, которым была подкожно трансплантирована солидная КЭ. Все исследования проводили на 10-е сут после трансплантации опухоли.
Исследования, результаты которых представлены в табл. 1, показали, что 6CpG ДНК имеет выраженное стимулирующее влияние на фагоцитарную активность ПМФ как интактных мышей, так и мышей-опухоленосителей. ПМФ интактных мышей реагировали на преинкубацию с 6CpG ДНК возрастанием интенсивности фагоцитоза, о чем свидетельствует повышение значений таких показателей, как ИГ, ИР и ОИП. Следует отметить, что способность обработанных 6CpG ДНК ПМФ вступать в фагоцитоз (выраженная в виде ИГ, %) достоверно повышалась до 7095 % (р<0,01) по сравнению с 53 % в контроле. Кроме того, значительно возрастала поглотительная способ-
Таблица 1
Влияние in vitro 6CpG ДНК из культуральной жидкости B. subtilis на интенсивность фагоцитоза ПМФ
Группа животных Концентрация 6CpG ДНК, мкг/мл Показатель интенсивности фагоцитоза
ИГ, % ИР ОИП ИП ПКМ
Интактные 0 (контроль, n=4) 53,0±5,0 2,5±0,2 - 50,5±4,5 39,0±4,5
2,0 ( n=5) 70,0±7,5* 4,6±0,5* 184,0±6,5 75,0±6,0* 56,0±8,0*
5,0 (n=5) 95,0±7,0* 4,5±0,3* 180,0±8,0 87,0±5,5* 59,0±6,5*
КЭ 0 (контроль, n=4) 44,5±4,5 2,2±0,4 - 39,5±6,0 36,0±3,0
2,0 ( n=5) 59,2±9,0** 2,9±0,3* 132,0±7,5 50,0±8,0** 44,0±5,5
5,0 (n=5) 81,0±9,0* 3,3±0,2* 150,0±6,5 56,5±7,5* 51,0±9,0*
*p<0,01 в сравнении с соответствующим контролем; **p<0,05 в сравнении с соответствующим контролем.
ность ПМФ: если в контроле ИР равнялся только 2,5±0,2, то после контакта фагоцитирующих клеток с бСрО ДНК в концентрации 2,0 и 5,0 мкг/мл значения данного показателя увеличились до 4,6±0,5 и 4,5±0,3 (р<0,01), при этом ОИП находился в пределах 180,0— 184,0. Наряду с повышением интенсивности поглощения бактерий ПМФ наблюдали увеличение в 1,5-2 раза способности последних к распластыванию и в 1,5 раза - к перевариванию фагоцитированных частиц.
В условиях опухолевого роста (на 10-е сут после трансплантации опухоли) отмечали снижение исследуемых показателей у нестимулированных контрольных ПМФ (табл. 1). В частности, наблюдалось заметное снижение способности ПМФ поглощать и переваривать бактерии (представленное в виде ИГ и ИЗФ), тогда как на способность ПМФ прилипать присутствие опухоли в организме не имело заметного влияния, и этот показатель почти не отличался от такового у нестимулированных ПМФ интактных мышей.
Инкубация ПМФ мышей-опухоленосителей с бСрО ДНК не только восстанавливала их фагоцитарную активность, но и значительно повышала все исследуемые показатели, хотя последние все же не дос-
тигали аналогичных значений у стимулированных 6CpG ДНК ПМФ интактных мышей (см. табл.1).
Влияние 6CpG ДНК in vivo на фагоцитарную активность ПМФ через 24 ч после одноразового введения животным без опухолей было подобным тому, которое наблюдалось при действии исследуемой субстанции in vitro на ПМФ интактных животных (см. табл. 1 и 2). При этом отмечали также повышение значений всех изучаемых показателей фагоцитарной активности ПМФ. Установлено, что ИГ ПМФ достоверно повышался в 1,6-1,7 раза, достигая при этом 88-92 % по сравнению с 55,5 % в контроле. Введение здоровым мышам 6CpG ДНК также приводило к значительному повышению ИР, особенно выраженному у ПМФ мышей, которым вводили большую дозу исследуемой субстанции. Одновременно отмечали достоверное увеличение способности ПМФ переваривать фагоцитированные объекты и распластываться (см. табл. 2).
При введении исследуемой субстанции животным-опухоленосителям ПМФ также в целом демонстрировали заметное повышение фагоцитарной активности, которая однако не достигала уровня, наблюдаемого у
Таблица 2
Влияние одноразового введения бCpG ДНК из культуральной жидкости B. subtilis на интенсивность фагоцитоза ПМФ
Группа животных Доза 6CpG ДНК, мг/кг Показатель интенсивности фагоцитоза
ИГ, % ИР ОИП ИП ПКМ
Здоровые 0 (контроль, n=6) 55,5±4,5 2,8±0,5 - 52,0±4,0 39,5±5,5
0,5 (n=10) 88,0±5,5* 4,5±0,5** 161,0±6,5 70,4±4,5* 49,0±3,0**
1,0 (n=10) 92,0±6,0* 5,2±0,4* 186,0±8,0 84,0±6,5* 52,0±7,0**
КЭ 0 (контроль, n=6) 42,5±5,0 2,0±0,3 - 37,5±4,5 33,5±5,0
0,5 (n=10) 63,5±8,5* 3,0±0,3* 150,0±9,5 47,0±6,5** 40,5±7,0
1,0 (n=10) 74,0±6,0* 4,5±0,5* 225,0±12,5 50,5±4,5* 42,0±4,5**
*p<0,01 в сравнении с соответствующим контролем; **p<0,05 в сравнении с соответствующим контролем.
ПМФ здоровых мышей после введения 6CpG ДНК, что вполне объясняется неоднократно ранее полученными данными о выраженном угнетающем влиянии опухоли на иммунную систему организма [7; 14]. Следует отметить, что наиболее заметным эффектом после введения 6CpG ДНК (в дозе 1,0 мг/кг массы тела) животным с опухолями была повышенная способность ПМФ захватывать бактерии, при этом ИР достигал 4,5±0,5 (p<0,01) против 2,0±0,3 в контроле, а ОИП равнялся 225,0. Однако ПКМ достоверно повышалась только при введении мышам 6CpG ДНК в дозе 1,0 мг/кг массы тела (42,0±4,5 против 33,5±5,0 в контроле (p<0,05)), тогда как применение исследуемой субстанции в меньшей дозе статистически недостоверно повышало данный показатель (см. табл. 2).
Известно, что процесс поглощения и переваривания патогенных возбудителей сопровождается перестройкой метаболизма фагоцитирующих клеток, при этом в результате так называемого «респираторного взрыва» образуются реактивные формы кислорода (перекись водорода, гидроксильный радикал, супер-оксидный радикал-анион, синглетный кислород и др.), которые собственно и обладают бактерицидной, а также цитотоксической активностью. Проведенные исследования показали, что в условиях in vitro 6CpG ДНК обладает выраженным стимулирующим влиянием на метаболическую активность ПМФ как интакт-ных мышей, так и мышей-опухоленосителей (табл. 3). Установлено, что инкубация ПМФ с 6CpG ДНК в концентрации 2,0 и 5,0 мкг/мл приводит к выраженной активации метаболических процессов внутри ПМФ, уровень которых можно детектировать по степени восстановления нитросинего тетразолия до гранул диформазана. При этом показатели метаболической активности обработанных 6CpG ДНК ПМФ в спонтанном НСТ-тесте составили 71,5±4,5 и 96,0±11,5 относительно 55,0±7,5 % в контроле. В случае преин-кубации ПМФ с вышеупомянутыми концентрациями 6CpG ДНК и последующей обработкой ФМА заметный подъем метаболической активности наблюдали лишь в случае внесения в инкубационную систему
2,0 мкг/мл бСрО ДНК; при этом уровень метаболической активности возрастал на 23,1 % (ИНСТиндуц. -94,6±8,6 против ИНСТспонт. - 71,5±4,5 %). Однако в данном случае значение РК достоверно не отличалось от контроля. Это свидетельствует о том, что бСрО ДНК, примененная в данной концентрации вместе с ФМА, не повышала резервных возможностей ПМФ. Также следует отметить, что при использовании бСрО ДНК в большей концентрации даже наблюдалось некоторое снижение резервных возможностей ПМФ, о чем свидетельствуют соответствующие значения ИНСТиндуц. и РК (см. табл. 3).
Даже высокоочищенные препараты бактериальной ДНК довольно часто могут быть незначительно конта-минированы различными примесями и эндотоксином в том числе, что безусловно будет отображаться на выраженности исследуемых иммуномодулирующих свойств ДНК. Несмотря на то, что в данной работе ДНК была выделена из культуральной жидкости В.
- грамположительной бактерии, клеточная стенка которой не содержит эндотоксина, нами согласно требованиям при проведении такого рода исследований [34] в качестве отрицательного контроля была использована бСрО ДНК, обработанная ДНКазой I согласно [28]. Предположение, что обработка бСрО ДНК ДНКазой I отобразится на иммуностимулирующей активности, было подтверждено экспериментально. Как следует из табл. 3, значения показателей метаболической активности ПМФ, проинкубированных с обработанной ДНКазой I бСрО ДНК, достоверно не отличались от таковых в контроле. Таким образом, можно утверждать, что влияние исследуемой субстанции на метаболическую активность ПМФ определяется именно бСрО ДНК, а не возможными примесями в составе исследуемого препарата.
Наличие у животных опухоли, как и в случае исследования фагоцитарной активности, также заметно отображалось на уровне метаболической активности ПМФ (см. табл. 3). Значение ИНСТспонт. достигало лишь 37,5±8,0 по сравнению с 55,0±7,5 % в случае ПМФ здоровых животных. Кроме того, снижалась спо-
Таблица 3
Влияние in vitro 6CpG ДНК из культуральной жидкости B. subtilis на метаболическую активность ПМФ
Группа животных Концентрация 6CpG ДНК, мкг/мл Показатель метаболической активности
ИНСТспонт., % ИНСТиндуц^ % РК
Интактные 0 (контроль, n=5) 55,0±7,5 73,5±5,5 1,35±0,2
2,0 (n=5) 71,5±4,5* 94,6±8,5** 1,32±0,1
5,0 (n=5) 96,0±11,5** 92,8±6,5** 0,97±0,2*
6CpG ДНК+ДНКазаІ (n=4) 59,5±6,0*** 80,0±7,0**** 1,35±0,3
КЭ, n=14 0 (контроль, n=5) 37,5±8,0 42,0±6,5 1,10±0,3
2,0 (n=5) 65,5±8,5** 79,5±7,0** 1,20±0,1
5,0 (n=5) 80,5±5,5** 83,5±8,0** 1,00±0,1
*р<0,05 в сравнении с соответствующим контролем; **р<0,01 в сравнении с соответствующим контролем; ***р<0,01 в сравнении с соответствующим показателем в группе «5 мкг/мл бСрО ДНК». ****р<0,05 в сравнении с соответствующим показателем в группе «5 мкг/мл бСрО ДНК».
Таблица 4
Влияние одноразового введения бCpG ДНК из культуральной жидкости B. subtilis на метаболическую активность ПМФ
Группа животных Доза 6CpG ДНК, мг/кг Показатель метаболической активности
ИНСТспонт., % ИНСТиндуц., % РК
Здоровые 0 (контроль, n=6) 57,5±6,0 74,0±5,5 1,3±0,2
0,5 (n=10) 65,5±5,0* 98,5±6,5** 1,5±0,2
1,0 (n=10) 80,5±7,5** 100,0±12,5** 1,25±0,2
КЭ 0 (контроль) 41,0±7,0 40,5±8,5 1,0±0,25
0,5 (n=10) 60,0±5,0** 80,5±8,5** 1,35±0,2*
0 (контроль, n=6) 75,0±7,0** 89,5±4,0** 1,2±0,1
*p<0,05 в сравнении с соответствующим контролем; **p<0,01 в сравнении с соответствующим контролем.
собность ПМФ животных-опухоленосителей отвечать на стимуляцию ФМА, о чем свидетельствует значение РК, составившее около 1,1 ±0,3 относительно 1,35±0,2 у ПМФ здоровых мышей. Инкубация ПМФ, полученных от животных-опухоленосителей, с 6CpG ДНК не только восстанавливала метаболическую активность этих клеток, но и значительно повышала уровень последней. Однако на резервные возможности ПМФ мышей с развитой опухолью 6CpG ДНК в условиях in vitro не повлияла, о чем свидетельствуют результаты индуцированного НСТ-теста.
Получены не менее важные результаты относительно особенностей влияния на метаболическую активность ПМФ одноразового введения 6CpG ДНК здоровым мышам и животным-опухоленосителям. Обнаружено, что через 24 ч после введения 6CpG ДНК (0,5 и 1,0 мг/кг массы тела) метаболическая активность ПМФ здоровых животных достоверно увеличивалась, при этом значения ИНСТспонт. достигали 65,5 и 85,5 % соответственно по сравнению с
57,5 % в контрольной группе животных. Введение животным 6CpG ДНК заметно отображалась и на функциональном резерве ПМФ, особенно в случае применения исследуемой субстанции в дозе 0,5 мг/кг массы тела, когда РК составил 1,5±0,2 против 1,3±0,2 в контроле.
Наиболее выраженные сдвиги в сторону повышения метаболической активности были отмечены у ПМФ животных-опухоленосителей после одноразового введения 6CpG ДНК. Как показывают данные табл. 4, уже через 24 ч после введения 6CpG ДНК уровень метаболической активности ПМФ, выраженный в виде ИНСТспонт., возрастал в 1,5—1,8 раза по сравнению с контролем (p<0,01). Очевидно, что исходное значение показателей индуцированного НСТ-теста у ПМФ мышей-опухоленосителей свидетельствует об определенном истощении кислородзависимого потенциала ПМФ в условиях опухолевого роста. При введении таким животным 6CpG ДНК уровень этого показателя восстанавливался. Значения РК при этом составляли 1,35±0,2 (p<0,05) и 1,2±0,1 по сравнению с 1,0±0,25 в контроле.
Таким образом, влияние бСрО ДНК на ПМФ здоровых мышей и мышей с развитой опухолью характеризуется выраженной мобилизацией метаболических процессов, которые могут быть направлены на уничтожение как инфекционных агентов различного происхождения, так и опухолевых клеток, что открывает новые возможности для коррекции иммунного статуса в условиях опухолевого роста [2; 21].
Предыдущие [21; 24; 29] и настоящие исследования показали, что бСрО ДНК, выделенная из культуральной жидкости В. 8иЫ1Ш, обладает выраженными иммуностимулирующими свойствами, поэтому стратегия ее иммунотерапевтического применения базировалась на 2 основных принципах: монотерапевти-ческом применении и использовании бСрО ДНК в качестве адъюванта с целью повышения эффективности противоопухолевой гликопептидной вакцины.
На рис.1 представлены данные динамики выживаемости мышей с солидной саркомой 37, которые наглядно свидетельствуют о том, что применение бСрО ДНК заметно отображается на продолжительности жизни животных-опухоленосителей по сравнению с контрольной группой.
В табл. 5 представлены результаты эффективности применения бСрО ДНК на модели саркомы 37. Следует отметить, что монотерапевтическое применение бСрО ДНК имело выраженный тормозящий эффект на опухолевый рост, что отобразилось на показателях СПЖ мышей-опухоленосителей, которые составили 67,4±16,2 (р<0,01) и 57,2±19,9 (р<0,05) сут при терапевтическом и профилактическом режимах применения соответственно и были достоверно выше при сравнении с таковыми показателями в соответствующих контрольных группах (табл. 5). При этом показатель УПЖ был выше в случае терапевтического (около 57,5 %), нежели профилактического (около
33,6 %) режимов применения бСрО ДНК.
Применение вакцины §р50, изготовленной из клеток солидной саркомы 37, как в терапевтическом, так и профилактическом режимах введения не было успешным, о чем свидетельствуют показатели выживаемости вакцинированных животных-опухоленосителей (см.
Таблица 5
Эффективность применения бCpG ДНК отдельно и совместно с gp50 у мышей с солидной саркомой 37
Рис. 1. Динамика выживаемости мышей с подкожно трансплантированной саркомой 37 при применении бCpG ДНК отдельно и в качестве адъюванта с gp50 в терапевтическом (А) и профилактическом (Б) режимах введения
рис. 1, табл. 5). Такой ответ организма на введение многих противоопухолевых вакцин является достаточно типичным, так как преобладающее большинство противоопухолевых вакцин, и §р50 в том числе, состоят из низкоиммуногенных опухолевых антигенов, не способных индуцировать развитие полноценного иммунного ответа [8; 12; 31]. Поэтому среди множества подходов к усилению иммуногенности антигенов опухолевого происхождения и соответственно к повышению эффективности противоопухолевых вакцин достаточно перспективным является комбинированное применение с ними различных адъювантов [12; 34].
Как видно из данных, приведенных на рис. 1 и в табл. 5, комбинированное применение бСрО ДНК и gp50 значительно улучшало эффективность последней. Динамика выживаемости животных с трансплантированной саркомой 37, отображенная на рис. 1, демонстрирует, что мыши, которым трижды вводили gp50 в комбинации с бСрО ДНК, начинали гибнуть значительно позже, нежели животные, которым были осуществлены только вакцинации gp50 или вводили бСрО ДНК (профилактическая схема применения). Кроме того, гибель животных из групп с комбинированным применением исследуемых субстанций была достаточно растянута во времени, в то время как мыши, вакцинированные gp50, и животные из контрольных групп погибали в течение короткого промежутка времени. Так, в случае применения только gp50 все животные погибали уже на 45-48-е сут опухолевого роста, тогда как при использовании бСрО ДНК в качестве адъюванта для gp50 гибель всех животных в группах была весьма отстроченной (например, на 78-е
Группа(п=10) Режим применения СПЖ, сут УПЖ, %
Контроль терапевтиче- ский 42,8±9,2 -
gP50 40,2±8,3 - 6,1
бСрО ДНК 67,4±16,2 * 57,5
gp50+бCpG ДНК 65,3±22,8 */*** 52,6
Контроль профилакти- ческий 42,8±11,3 -
gP50 39,6±4,4 - 7,5
бСрО ДНК 57,2±19,9 ** 33,6
gp50+бCpG ДНК 65,6±11,4 */*** 53,3
*р<0,01 в сравнении с соответствующим контролем; **р<0,05 в сравнении с соответствующим контролем; ***р<0,01 в сравнении с применением яр50 отдельно.
сут при профилактическом применении вакцины с адъювантом). Более того, следует отметить, что в случае терапевтического введения gp50 и бСрО ДНК 30% мышей с опухолями вообще оставались живыми на день завершения эксперимента (90-е сут после трансплантации опухоли). В табл. 5 показано, что значения СПЖ в группах животных с сочетанным применением исследуемых субстанций составили 65,3±22,8 и 65,6±11,4 сут при терапевтическом и профилактическом режимах введения соответственно, тогда как в случае применения только gp50 эти показатели достигали всего лишь 40,2±8,3 и 39,6±4,4 сут соответственно; при этом было достигнуто увеличение продолжительности жизни животных-опухоленосителей на 52,6 и 53,3 % соответственно.
Таким образом, результаты исследований, полученные на данной модели опухолевого роста, представляющей новообразование соединительнотканного происхождения, четко демонстрируют противоопухолевую активность и определенный адъювантный потенциал бСрО ДНК из культуральной жидкости В. 8иЪШ18 при комбинированном применении с антигеном опухолевого происхождения.
Важным моментом при исследовании эффективности применения субстанций природного и синтетического происхождения является изучение их противоопухолевой активности на моделях асцитных опухолей, которые отличаются быстрым темпом роста и относительно высокой агрессивностью, что соответственно отображается на показателях выживаемости животных-опухоленосителей. В данных исследованиях в качестве такой модели была избрана лимфоидная лейкемия Ь1210. Как показано в табл. 6, терапевтическое введение СрО ДНК бактериального происхождения почти не влияло на показатели продолжительно-
26 БИОТЕРАПИЯ
Рис. 2. Динамика выживаемости мышей с ин-траперитонеально трансплантированной лимфоидной лейкемией Ы210 при применении бCpG ДНК отдельно и в качестве адъюванта с gp50 в терапевтическом (А) и профилактическом (Б) режимах введения
сти жизни животных-опухоленосителей: СПЖ при этом фактически не отличалась от контрольного значения (22,7±1,3 и 21,6±0,7 сут соответственно), а показатель УПЖ составил всего лишь 5,1 %. Если же бСрО ДНК вводили в профилактической схеме применения, то есть перед инокуляцией опухолевых клеток, - наблюдали статистически достоверное УПЖ у животных-опухоленосителей, которое составило около 42,6 %. Динамика выживаемости мышей, которым вводили бСрО ДНК в профилактическом режиме (рис. 2, Б), также существенно отличалась от таковой у животных контрольной группы и мышей, которым вводили исследуемую субстанцию в терапевтическом режиме (рис. 2, А). Гибель мышей, которым провели профилактические введения бСрО ДНК, была значи-
тельно отстрочена во времени, тогда как животные 2 других групп погибли фактически одновременно и достаточно быстро после трансплантации опухоли.
В исследованиях на данной модели опухолевого роста проявление адъювантных свойств бСрО ДНК наблюдали только в случае терапевтической схемы применения исследуемой субстанции в сочетании с gp50 (см. табл. 6, рис. 2, А), при этом значения СПЖ составили 25,9±4,9 (р<0,05) и 21,6±0,7 сут в опытной и контрольных группах животных-опухоленосителей соответственно.
Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что монотерапевтическое применение бСрО ДНК из культуральной жидкости В. 5иЪШй может быть достаточно эффективным для иммунотерапии злокачественных опухолей различного гистогене-
за. Полученные данные дают возможность утверждать о наличии адъювантного потенциала у бСрО ДНК, степень проявления которого зависит, очевидно, не только от режима ее комбинированного применения с противоопухолевой вакциной gp50, но также и от модели опухолевого роста и, вероятно, от иммуногенности опухолевых антигенов, входящих в состав соответствующей вакцины. Исходя из результатов настоящих и проведенных ранее исследований [30], можно предположить, что монотерапевтическое применение СрО ДНК из культуральной жидкости В. 8иЪШ\8 будет более эффективным в случае опухолей соединительнотканного и эпителиального происхождения, тогда как лимфопролиферативные новообразования, возможно, будут отличаться относительно низким терапевтическим ответом на примененную стратегию лечения.
Несмотря на то, что многие бактериальные иммуномодуляторы в свое время продемонстрировали достаточно высокую эффективность в экспериментальной иммунотерапии опухолей, преобладающее большинство из них (за исключением некоторых, например, ОК-432) все же не смогли найти применения в клинической практике по причине слишком высокой токсичности [2; 5]. Так, при сравнении иммуномодулирующих эффектов, опосредованных бСрО ДНК и другими субстанциями бактериального происхождения, например, бактериальными липополисаха-ридами, казалось бы, можно найти много общего, в частности, способность вызывать поликлональную
Таблица 6
Эффективность применения бCpG ДНК отдельно и совместно с gp50 у мышей с перевитой лимфоидной лейкемией Ы210
Группа Количество животных Режим применения СПЖ, сут УПЖ, %
Контроль 10 - 21,6±0,7 -
gP50 8 терапевтический 24,8±2,8 14,8
бСрО ДНК 7 22,7±1,3 5,1
gp50+бCpG ДНК 7 25,9±4,9* 19,9
gP50 8 профилактический 22,9±3,0 5,7
бСрО ДНК 8 30,8±12,0* 42,6
gp50+бCpG ДНК 7 26,0±6,4 20,4
*р<0,05 в сравнении с контролем.
активацию В-клеток, активировать Т-хелперы, естественные киллерные и дендритные клетки, а также макрофаги. Однако, как было неоднократно показано, применение бактериальных липополисахаридов сопровождается выраженной токсичностью вследствие высвобождения клетками иммунной системы больших количеств фактора некроза опухолей и интерлейкина-1, тогда как бСрО ДНК или ее синтетические олигонуклеотидные аналоги обладают незначительной или весьма приемлемой токсичностью при применении в терапевтических дозах [15; 23]. Относительно невысокая токсичность и разнообразие иммуностимулирующих эффектов, опосредованных СрО ДНК, возводят последнюю в ранг весьма перспективных кандидатов для создания новых эффективных иммунотерапевтических препаратов широкого спектра иммуномодулирующего действия. Более того, на сегодня СрО ДНК признана наиболее мощным адъювантом по сравнению даже с «золотым стандартом», которым до сих пор являлся полный адъювант Фрейнда [4; 15; 16; 23].
Одной из основных целей иммунотерапии опухолей является превращение слабо или вовсе не имму-ногенных опухолевых антигенов в иммуногенные, способные запускать весь классический цикл иммунологических событий, среди которых процессинг и презентация антигенов, активация Т-хелперов и генерация цитотоксических Т-лимфоцитов. При этом одной из основных причин неэффективности иммунитета в условиях опухолевого роста зачастую служит продукция опухолевыми клетками иммуносупрессор-ных и супрессорогенных факторов, влияние которых существенно отображается на функциональной активности различных клеток иммунной системы, в том числе и МФ [13; 18]. Кроме того, уже сложившееся в условиях опухолевого роста в организме угнетенное состояние иммунной системы безусловно еще более усугубляется вследствие лечения онкологических больных, которое может включать такие «жесткие» лечебные процедуры, как оперативное вмешательство, химио- и радиолучевую терапию, трансплантацию костного мозга и др. [20; 27] Все это, как было показано, приводит к выраженному угнетению иммунного статуса больных раком, развитию различных осложнений, среди которых оппортунистические инфекции различной этиологии, которые не только значительно ухудшают качество жизни онкологических пациентов, но и достаточно часто являются основной причиной их смерти [25]. Повышенное восприятие больных раком к развитию различных инфекционных процессов, а также их дальнейшее прогрессирование связывают, в первую очередь, с серьезными нарушениями в системе противомикробной иммунологической защиты, опосредуемой нейтрофилами и МФ, что было неоднократно подтверждено целым рядом исследований [2; 20; 27]. Поэтому в данной ситуации главная задача применения веществ с иммуномодулирующей активностью состоит, может быть, не столько в активации, сколько в реактивации различных звеньев иммунной
системы, в том числе МФ с нейтрофилами, ведущая роль которых в противомикробной защите организма неоспорима [5; 17-19; 33; 36]. Принципиальная возможность решения этой задачи при использовании CpG ДНК из культуральной жидкости B. subtilis продемонстрирована выше.
Более того, активация МФ может быть достаточно перспективной стратегией при разработке иммуноте-рапевтических подходов для борьбы с раком. Анализ ряда данных позволяет прийти к выводам, что соответственно активированные МФ способны распознавать и уничтожать in vivo даже единичные опухолевые клетки независимо от наличия специфических трансплантационных антигенов, инвазивности, метастатического потенциала, пролиферативной активности, а также чувствительности этих клеток к действию лимфоцитов или цитостатических препаратов. Также следует отметить, что МФ принимают активное участие в регуляции гуморального и клеточного звеньев иммунного ответа при метастазировании, бесспорна также их роль в модификации некоторых неиммунологических механизмов и факторов антиметастатиче-ской резистентности [2]. Кроме того, учитывая, что МФ наряду с Т-лимфоцитами являются одним из важнейших компонентов механизма противоопухолевого действия различных противораковых вакцин, экспериментально полученная нами активация ПМФ, индуцированная 6CpG ДНК из культуральной жидкости B. subtilis, безусловно, является важным наблюдением, позволяющим в дальнейшем приблизиться к разработке эффективных схем противоопухолевой иммунотерапии с применением исследуемой субстанции. Более того, данные, полученные другими авторами, подтверждают, что МФ играют чуть ли не решающую роль в проявлении эффектов, опосредованных CpG ДНК [9], и, в отличие от Т- и В-лимфоцитов, отвечают за индуцированное применением CpG ДНК отторжение опухолей, а истощение в организме популяции МФ приводит к полной утрате эффективности иммунотерапии у мышей с трансплантированной ней-робластомой [10].
Результаты, полученные в данном исследовании, полностью согласуются с многочисленными данными литературы, которые характеризуют ДНК, обогащенную неметилированными CpG-последовательностями, как высокоиммуногенную субстанцию, способную активировать неспецифические механизмы противоопухолевой защиты организма, и свидетельствуют об успешном применении таковой ДНК естественного и синтетического происхождения в иммунотерапии злокачественных новообразований [15; 28; 29; 35].
ВЫВОДЫ
1. 6CpG ДНК из культуральной жидкости B. sub-tilis обладает выраженным иммуностимулирующим действием, которое проявляется в виде повышения функциональной активности ПМФ как in vitro, так и in vivo, а также осуществляется в условиях роста опухоли в организме.
2. Монотерапевтическое применение 6CpG ДНК является достаточно эффективной стратегией воздействия на опухолевый рост, о чем свидетельствует значительное увеличение продолжительности жизни иммунизированных животных-опухоленосителей.
3. При сочетанном применении с противоопухолевой гликопептидной вакциной 6CpG ДНК демонстрирует адъювантную активность, степень проявления которой зависит не только от режима их совместного применения, но и от модели опухолевого роста.
Работа выполнена в рамках программы «Особенности функционирования онкогенома» (2002-2006 гг., N 0102U003228), которая проводилась в рамках целевой научной программы НАН Украины «Физиологобиохимические и молекулярно-генетические основы функционирования живых систем и разработка принципов управления ими», а также частично поддержана National Scholarship Programme of World Federation of Scientists (2006-2007, Lausanne, Switzerland).
ЛИТЕРАТУРА
1. Априкян В.С., Михайлова А.А., Петров Р.В. Интенсивность фагоцитоза бактерий Salmonella ty-phimurium мышиными перитонеальными макрофагами // Иммунология. - 2001. - № 2. - С. 20-2.
2. Бережная Н.М., Чехун В.Ф. Иммунология злокачественного роста. - Киев: Наукова думка, 2005.
- 791 с.
3. Иммунология: Практикум / Е.У. Пастер, В.В. Овод, В.К. Позур, Н.Е. Вихоть. - Киев: Издательство при Киев. Гос. Университете, изд. «Выща школа», 1989. - 304 с.
4. Олишевский С.В., Козак В.В., Яниш Ю.В. и др. Иммуностимулирующая CpG ДНК: перспективы клинического применения в онкологии // Онкология. -2006. - Т. 8, № 2. - С. 209-17.
5. Рахмилевич А.Л. Бактериальные иммуномодуляторы в экспериментальной онкологии // Успехи соврем. биол. - 1990. - Т. 109, Вып. 3. - С. 379-92.
6. Трещалина Е.М. Противоопухолевая активность веществ природного происхождения. - Москва: Практическая медицина, 2005. - 272 с.
7. Шляховенко В.А. Современные подходы к созданию противоопухолевых вакцин // Эксперим. онкол. - 2000. - 22, № 3. - С. 99-109.
8. Шляховенко В.А., Мосиенко В.А. Использование вакцин для лечения опухолевой болезни // Клин. иммунол. аллергол. инфектол. - 2006. - № 2. - С. 80-4.
9. Auf G., Carpentier A.F., Chen L. et al. Implication of macrophages in tumor rejection induced by CpG-oligodeoxynucleotides without antigen // Clin. Cancer Res.
- 2001. - No 7. - P. 3540-3.
10. Brignole C., Pastorino F., Marimpietri et al. Immune cell-mediated antitumor activities of GD2-targeted liposomal c-myb antisense oligonucleotides containing CpG motifs // J. Nat. Cancer Inst. - 2004. -96(15).
- Р. 1171-80.
11. Cann S.A., van Netten J.P., van Netten C. Dr William Coley and tumor regression: a place in history or in the future // Postgrad. Med. J. - 2003. - 79. - P. 672-80.
12. Finn O.J. Cancer vaccines: between the idea and the reality // Nature Rev. Immunol. - 2003. - 3. - P. 630-41.
13. Gardner T.E., Naama H., Daly J.M. Peritoneal and splenic macrophage functions in the tumor-bearing host // J. Surg. Res. - 1995. - 59(2). - P. 305-10.
14. Hsieh C.-L., Chen D.-S., Hwang L.-H. Tumor-induced immunosuppression: a barrier to immunotherapy of large tumors by cytokine-secreting tumor vaccine // Human Gene Ther. - 2000. - 11(5). - P. 681-92
15. Krieg A.M. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects // Annu. Rev. Immunol. - 2002. -No 20. - P. 709-60.
16. Krieg A.M. CpG motifs: the active ingredient in bacterial extracts? // Nature Medicine. - 2003. - 9(7). - P. 831-5.
17. Liu C., Leung M.Y., Koon J.C. et al. Macrophage activation by polysaccharide biological response modifier isolated from Aloe vera L. var. chinensis (Haw.) Berg // Int. Immunopharmacol. - 2006. - 6(11). - P. 1634-41.
18. Mastroeni P., Bizzini B., Bonina L. et al. The res-
toration of impaired macrophage functions using as im-munomodulator the Corynebacterium granulosum-
derived P40 raction // Immunopharmacology. - 1985. -10(1). - P. 27-34.
19. Matsuo K., Nomoto K., Shimotori S., Takeya K. Depression of protective mechanisms against microorganisms in tumor-bearing mice and its restoration by adjuvants //. Gann. - 1977. - 68(4). - P.465-71.
20. Nikiforova Z.N., Shevchenko V.E., Volkova Z.V. et al. Production of active oxygen by neutrophils in patients with cancer of the esophagus and stomach before and after surgical interventions // Antibiot. Khimioter. -2005. - 50(4). - P. 7-13. (In Russian).
21. Olishevsky S., Burlaka A., Sidorik E. et al. Modulation of ROS/NO production by murine peritoneal macrophages in response to bacterial CpG DNA stimulation // Exp. Oncol. - 2006. - 28(2). - P. 114-20.
22. Olishevsky S., Kozak V., Yanish Yu. et al. Characteristics of extracellular DNA containing un-methylated CpG motifs isolated from Bacillus subtilis culture medium filtrate // Exp. Oncol. - 2004. - 26(4).
- P. 265-70.
23. Olishevsky S.V., Shlyakhovenko V.A., Kozak V.V., Yanish Y.V. Immunostimulatory CpG DNA in cancer vaccinotherapy // Exp. Oncol. - 2003. - 25(2). - P. 83-92.
24. Olishevsky S., Shlyakhovenko V., Kozak V., Yan-ish Yu. Response of different organs of immune system of mice upon administration bacterial CpG DNA // Exp. Oncol. - 2005. - 27(4). - P. 290-7.
25. Rolston K.V.I. Challenges in the treatment of infections caused by gram-positive and gram-negative bacteria in patients with cancer and neutropenia // Clin. Infect. Dis. - 2005. - 1(40). - Suppl. 4. - P. 246-52.
26. Ryan R.M., Green J., Lewis C.E. Use of bacteria in anti-cancer therapies // Bioesseys. - 2005. - 28(1). - P. 84-94.
27. Saito T., Shigemitsu Y., Kinoshita T. et al. Impaired neutrophil bactericidal activity correlates with the infection occurring after surgery for esophageal cancer // J. Surg. Oncol. - 1992. - 51(3). - P. 159-63.
28. Shlyakhovenko V., Kosak V., Olishevsky S. Application of DNA from mushroom Pleurotus ostreatus for cancer biotherapy: a pilot study // Exp. Oncol. - 2006. -28(2). - P. 132-5.
29. Shlyakhovenko V.A., Mosienko V.S., Kozak V.V. et al. Anti-cancer vaccine on the basis of glycoproteides isolated from tumor cells // Oncology, - 2004. - 6(3). - P. 180-4. (In Ukrainian).
30. Shlyakhovenko V.A., Olishevsky S.V., Kozak V.V., et al. Anticancer and immunostimulatory effects of nu-cleoprotein fraction of Bacillus subtilis 7025 culture medium filtrate // Exp. Oncol. - 2003. - 25(2). - P. 119-23.
31. Srivastava P.K. Therapeutic cancer vaccines // Curr. Opin. Immunol. - 2006. - 18(2). - P. 201-5.
32. Tishler M., Shoenfeld Y. BCG immunotherapy -from pathophysiology to clinical practice // Expert Opin. Drug Saf. - 2006. - 5(2). - P. 225-9.
33. Tseng C.C., Shang H.F., Wang L.F. et al. Antitumor and immunostimulating effects of Anoectochilus formo-sanus Hayata // Phytomedicine - 2006. - 13(5). - P. 366-70.
34. Vaccine adjuvants. Preparation methods and research protocols / Ed. by D.T. O'Hagan. Humana Press, 2002. - 326 p.
35. Weeratna R.D., Davis H.L., Medynski L., Krieg A.M. Potential use of CpG ODN for cancer immunotherapy // Update Cancer Therapeutics. - 2006. -1(1). - P. 49-58.
36. Yamaguchi N., Yoshida J., Ren L.J. et al. Augmentation of various immune reactivities of tumor-bearing hosts with an extract of Cordyceps sinensis // Biotherapy. - 1990. -2(3). - P. 199-205.
Поступила 15.01.2007.
