ПРИМЕНЕНИЕ ЧАШКИ ПЕТРИ С МИЛЛИМЕТРОВОЙ ЛИНЕЙКОЙ Текст научной статьи по специальности «Сельскохозяйственные науки»

УДК /UDC 619:579.22:615.28(075.8)

ПРИМЕНЕНИЕ ЧАШКИ ПЕТРИ С МИЛЛИМЕТРОВОЙ ЛИНЕЙКОЙ

APPLICATION OF A PETRI DISH WITH A MILLIMETER RULER

Сахно H.B.,1* доктор ветеринарных наук, доцент Sakhno N.V., Doctor of veterinary sciences, Associate Professor Скребнев C.A.,1 кандидат ветеринарных наук, доцент Skrebnev S.A., Candidate of veterinary sciences, Associate Professor

Шадская A.B.,1 кандидат ветеринарных наук, доцент Shadskaya A.V., Candidate of veterinary sciences, Associate Professor Савкин В.И.,1 доктор экономических наук, доцент Savkin V.A., Doctor of Economics, Associate Professor Паршутина И.Г.,1 доктор экономических наук, профессор

Parshutina I.G., Doctor of Economics, Professor Скребнева E.H.,2 кандидат биологических наук, доцент Skrebneva E.N., Candidate of Biological Sciences, Associate Professor 1ФГБОУ ВО «Орловский государственный аграрный университет имени H.B. Парахина», Орел, Россия Federal state budgetary educational institution of higher professional education «Orel state agrarian University named after N.V. Parahin», Orel, Russia 2ФГБОУ ВО «Орловский государственный университет имени И.С. Тургенева», Орел, Россия Federal state budgetary educational institution of higher professional education « Oryol State University named after I.S. Turgenev», Orel, Russia *E-mail: [email protected]

Разработка коллектива авторов относится к ветеринарной микробиологии, а именно, к лабораторному оборудованию для культивирования колоний микроорганизмов. Наиболее эффективно применение чашки Петри с миллиметровой линейкой для установления степени задержки роста микроорганизмов при определении их чувствительности к антибиотикам. Промышленностью выпускают контактные чашки Петри, а также изготавливают наклейки с сеткой для чашек Петри. Однако, эти крупноячеистые счетные сетки предназначены только для подсчета количества колоний микроорганизмов внутри их ячеек, а не для получения размеров зоны задержки роста микроорганизмов при определении их чувствительности к антибиотикам, выраженной в миллиметрах. При работе с такими счетными сетками, не предназначенными для установления размеров зоны задержки роста микроорганизмов при определении их чувствительности к антибиотикам, нельзя получить достоверных результатов. Это недопустимо при анализе чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, проводимом с целью назначения животным своевременной и эффективной антибиотикотерапии. Целью модификации чашки Петри является исключение указанных недостатков для выполнения точных лабораторных исследований по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам в различные временные отрезки (часы, сутки) еще на стадии их культивирования. Применение модифицированной чашки Петри с миллиметровой линейкой позволяет: проводить раннее и поэтапное исследование задержки роста микроорганизмов при определении их антибиотикочувствительности еще на стадии их культивирования; визуализировать место начала и завершения осмотра задержки роста колоний микроорганизмов в чашке Петри с миллиметровой линейкой; исключить необходимость проведения повторных исследований; повысить точность результатов исследований.

Ключевые слова: микроорганизмы, антибиотики, антибиотикочувствительность, чашка Петри, теленок, колибактериоз, лечение.

The development of the team of authors relates to veterinary microbiology, namely, to laboratory equipment for the cultivation of colonies of microorganisms. The most effective use of a Petri dish with a millimeter ruler is to establish the degree of growth retardation of microorganisms when determining their antibiotic sensitivity. The industry produces contact Petri dishes, and also produces stickers with a

grid for Petri dishes. However, these large-cell counting grids are intended only for counting the number of colonies of microorganisms inside their cells, and not for obtaining the size of the growth retardation zone of microorganisms when determining their sensitivity to antibiotics, expressed in millimeters. When working with such counting grids that are not designed to determine the size of the growth retardation zone of microorganisms when determining their sensitivity to antibiotics, it is impossible to obtain reliable results. It is unacceptable when analyzing the sensitivity of microorganisms to antibiotics, carried out in order to prescribe timely and effective antibiotic therapy to animals. The purpose of modifying the Petri dish is to eliminate these shortcomings and perform accurate laboratory tests for determining the microorganisms antibiotic sensitivity in various time periods (hours, days) at the stage of their cultivation. The use of a modified Petri dish with a millimeter ruler allows: to conduct an early and step-by-step study of the growth retardation of microorganisms when determining their antibiotic sensitivity at the stage of their cultivation; to visualize the place of the beginning and completion of the inspection of the growth retardation of colonies of microorganisms in a Petri dish with a millimeter ruler; to eliminate the need for repeated studies; to increase the accuracy of research results.

Key words: microorganisms, antibiotics, antibiotic sensitivity, petri dish, calf, colibacteriosis, treatment.

Введение. Наиболее важными задачами специалистов ветеринарной медицины являются не только своевременная и правильная диагностика заболеваний животных, но и выбор необходимых для успешного лечения больных животных терапевтических средств, определение антибиотикочувствительности микроорганизмов, и в целом профилактика антибиотикорезистентности патогенной микрофлоры [5, 6, 7]. Наша разработка относится к ветеринарной микробиологии, а именно, к лабораторному оборудованию для культивирования колоний микроорганизмов. Наиболее эффективно применение чашки Петри с миллиметровой линейкой для установления степени задержки роста микроорганизмов при определении их чувствительности к антибиотикам.

В лабораторной практике применяются контактные чашки Петри, которые используются для подсчета колоний микроорганизмов. Изготовлены они из оптического полистирола. Эти чашки Петри вентилируемые и имеют счетную сетку по всей площади крышки чашки Петри. По горизонтали столбцы ячеек данной крупноячеистой сетки пронумерованы арабскими цифрами от 1 до 6. По вертикали ряды ячеек сетки обозначены заглавными буквами латинского алфавита - A, B, C, D, E, F [9]. Кроме того, выпускают наклейки для чашек Петри PetriStickers, у которых сетка содержит 50 квадратов. Квадраты этой крупноячеистой сетки нанесены по всей площади наклейки, которая соответствует площади дна чашки Петри [8]. Однако, эти крупноячеистые счетные сетки предназначены только для подсчета количества колоний микроорганизмов внутри их ячеек, а не для получения размеров зоны задержки роста микроорганизмов при определении их чувствительности к антибиотикам, выраженной в миллиметрах. При работе с такими счетными сетками, не предназначенными для установления размеров зоны задержки роста микроорганизмов при определении их чувствительности к антибиотикам, нельзя получить достоверных результатов. Это недопустимо при анализе чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, проводимом с целью назначения животным своевременной и эффективной антибиотикотерапии.

Целью исследования является модификация чашки Петри для выполнения точных лабораторных исследований по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам в различные временные отрезки (часы, сутки) еще на стадии их культивирования.

Условия, материалы и методы. Объектом для исследования послужили телята в возрасте от рождения до 10 суток, которые содержались в хозяйстве ИП Коржавых Д.Е. Орловского района Орловской области.

Наличие патогенных микроорганизмов в мазке из прямой кишки у телят выявляли согласно общепринятой методике [2]. Подтверждение видового состава выделенных культур проводили с использованием определителя бактерий Берги [1].

Определение чувствительности и устойчивости микроорганизмов к антибиотикам проводили согласно методике Костенко Т.С., Скаршевской Е.И., С.С. Гительсон (1989), где емкость стерильной стеклянной чашки Петри заполняют мясопептонным агаром (или специализированной средой для определенной группы микроорганизмов) по 20 мл. На поверхность уплотнившейся среды наливают 1 мл одномиллиардной взвеси (в 0,9 %-ном растворе NaCl) агаровой культуры микроорганизмов, в частности, полученных путем мазка из прямой кишки теленка. Легким покачиванием чашки Петри культуру равномерно распределяют по питательной среде, излишек жидкости отсасывают стерильной пастеровской пипеткой. Чашку Петри подсушивают в термостате в течение 15 минут при температуре 37 °С. Затем на поверхность засеянной среды стерильным пинцетом накладывают стандартные бумажные диски с разными антибиотиками (спектиномицин, норфлоксацин, тилозин, канамицин, олеандомицин, тиамулин, цефотаксим, хлортетрациклин) на расстоянии 2 см от ее края и друг от друга, и еще один диск в центре емкости чашки Петри. После наложения каждого диска пинцет обжигают на пламени горелки. Сначала чашку Петри выдерживают при комнатной температуре (2 часа), затем, перевернув ее вверх дном, помещают в термостат на 16 часов (37 °С). Оценку результатов проводят с учетом наличия или отсутствия зоны задержки роста, размера зоны вокруг диска с антибиотиком. Отсутствие зоны задержки роста бактерий свидетельствует о нечувствительности их к данному противомикробному препарату. Зона задержки до 15 мм является показателем малой чувствительности, зона в 15-25 мм указывает на достаточную чувствительность к антибиотикам испытуемой бактериальной культуры. Чем больше зона задержки роста бактерий, тем выше их чувствительность к данному антибактериальному препарату [2].

Модифицированная чашка Петри с миллиметровой линейкой [4] была успешно применена при проведении лабораторно-практических занятий на кафедре эпизоотологии и терапии ФГБОУ ВО «Орловский государственный аграрный университет имени Н.В. Парахина». Определение чувствительности и устойчивости микроорганизмов к антибиотикам проводили с использованием различных лабораторных устройств (бактериологическая петля) [3].

Результаты и обсуждение. Модифицированная Чашка Петри содержит емкость с дном и крышку с миллиметровой линейкой в виде параллельных черточек-делений, расположенных друг от друга через 1,0 мм на наружной стороне крышки и по всей длине ее диаметра. Размещение миллиметровой линейки на дне емкости чашки Петри не предусматривалось, поскольку для культивирования микроорганизмов часто применяют непрозрачные питательные среды (Эндо, обогащенные питательные среды, кровяной агар, желчный агар и др.), что затруднило бы визуализацию зоны задержки роста микроорганизмов и сопоставление с ней миллиметровой линейки. Кроме того, чашка Петри оснащена двумя маркировочными матовыми вертикальными ограничительными полосами: одна из них расположена на наружной стороне боковой поверхности емкости с дном на всю ее высоту, а вторая - на наружной стороне боковой поверхности крышки также на всю ее высоту (рис. 1).

Чашка Петри с миллиметровой линейкой позволяет измерить зону задержки роста микроорганизмов в любой точке поля ее емкости в том числе и в ее центре благодаря миллиметровой линейке в виде параллельных черточек-делений, расположенных друг от друга через 1,0 мм, на крышке. Она предназначена для проведения раннего и поэтапного исследования задержки роста микроорганизмов при определении чувствительности микроорганизмов к антибиотикам еще на стадии их культивирования. Возможна наглядная документация результатов исследований путем фотографирования. При этом миллиметровая линейка в виде параллельных черточек-делений не затрудняет визуализацию зоны задержки роста микроорганизмов, поскольку она не занимает всю площадь поверхности крышки чашки Петри, что наблюдается у контактных чашек Петри и чашек Петри с наклейками PetriStickers.

Рисунок 1 - Чашка Петри с миллиметровой линейкой (в раскрытом виде): 1 - емкость с дном, 2 - крышка, 3 - миллиметровая линейка,

4 - маркировочные матовые вертикальные ограничительные полосы.

Использование чашки Петри с миллиметровой линейкой приводим на примере исследований чувствительности к антибиотикам микрофлоры, взятой посредством мазка из прямой кишки у телят. Так, у теленка, черно-пестрой породы в возрасте 10 дней, живой массой 28 кг (бычок) было отмечено угнетение, вялый аппетит, понос, каловые массы жидкие со зловонным запахом. Для постановки диагноза тремя стерильными ватными тампонами, смоченными стерильным 0,9%-й раствором NaCl, поочередно взяли мазки из прямой кишки теленка. Тампоны, каждый в отдельности, поместили в стерильную воду (20 мл) и доставили для бактериологического исследования в специализированную аудиторию микробиологии кафедры эпизоотологии и терапии, где пробы перед посевом развели до необходимой плотности микроорганизмов в 10-кратных последовательностях, так чтобы на чашку Петри со средой (например, мясопептонным агаром) пришлось 50-200 микробных тел, формирующих колонии.

Далее ставили тесты для подтверждения видового состава выделенных культур. В результате были выделены патогенные штаммы Escherichia coli. Диагноз - колибактериоз. Затем определяли чувствительность патогенного штамма E. coli к антибиотикам.

3

Для этого емкость стерильной стеклянной чашки Петри с миллиметровой линейкой заполнили дифференциально-диагностической питательной средой Эндо (используемой для выделения энтеробактерий) по 20 мл. На поверхность уплотнившейся среды Эндо налили 1 мл одномиллиардной взвеси (в 0,9 %-ном растворе NaCl) агаровой культуры E. coli, выделенной из каловых масс теленка. Легким покачиванием чашки Петри культуру равномерно распределили по питательной среде Эндо, затем подсушили в термостате в течение 15 минут (37°C). Далее на поверхность засеянной среды Эндо стерильным пинцетом выложили стандартные бумажные диски с различными антибиотиками на расстоянии 2 см от края и друг от друга, и еще один диск в центре емкости чашки Петри. После наложения каждого диска пинцет обжигали на пламени горелки. Затем чашку Петри накрыли крышкой, оснащенной миллиметровой линейкой таким образом, чтобы маркировочные матовые вертикальные ограничительные полосы на емкости с дном и крышке совпали (наложились друг на друга). То есть соблюдалась обычная позиция составных частей чашки Петри с миллиметровой линейкой в сборе. При этом маркировочной матовой вертикальной ограничительной полосой на наружной стороне боковой поверхности емкости для питательных сред и на наружной стороне боковой поверхности крышки обозначено место начала и завершения осмотра задержки роста колоний микроорганизмов.

Сначала чашку Петри выдержали при комнатной температуре (2 часа), затем, перевернув ее вверх дном, поместили в термостат на 16 часов (37 °C). Оценку результатов провели с учетом наличия зоны задержки роста и размера зоны вокруг диска с антибиотиком. Когда проявилась зона задержки роста, ее измерили по диаметру (включая диаметр диска) с помощью миллиметровой линейки, которую вращением крышки (в каком-либо из направлений по часовой стрелке или против нее) приблизили к диску с антибиотиком, давшим наибольшую задержку роста E. coli на поверхности питательной среды Эндо в чашке Петри. Визуализация места начала и завершения осмотра задержки роста колоний микроорганизмов дает возможность выполнять работу в необходимом режиме. Пройдя по кругу емкости чашки Петри на уровне совмещения маркировочных матовых вертикальных ограничительных полос завершили работу. Это исключает повторные исследования. Выполнение миллиметровой линейки на крышке чашки Петри не усложнило работу с ней и не повысило затраты времени на общепринятые манипуляции.

Зона задержки роста E. coli равная 27 мм указала на наибольшую его чувствительность к антибиотику тилозину. Результаты исследований задокументировали фотографированием зоны задержки роста Е. coli (рис. 2).

Рисунок 2 - Определение антибиотикочувствительности E. coli.

Теленку в качестве специфической терапии был назначен антибактериальный препарат группы макролидов тилозин внутримышечно в дозе 5 мг/кг массы животного 1 раз в сутки. Через 5 суток после применения тилозина в сочетании с симптоматической терапией теленок выздоровел.

Выводы. Применение модифицированной чашки Петри с миллиметровой линейкой позволяет: проводить раннее и поэтапное исследование задержки роста микроорганизмов при определении их антибиотикочувствительности еще на стадии их культивирования; визуализировать место начала и завершения осмотра задержки роста колоний микроорганизмов в чашке Петри с миллиметровой линейкой; исключить необходимость проведения повторных исследований; повысить точность результатов исследований; назначить своевременную и эффективную антибиотикотерапию больным животным. Таким образом, использование модифицированной чашки Петри с миллиметровой линейкой является более эффективным по сравнению с известными и позволяет избежать повторных исследований вследствие исключения получения недостоверных результатов исследований. При этом можно производить исследования в различные временные отрезки (часы, сутки) еще на стадии культивирования, что важно для начала как можно более раннего лечения.

БИБЛИОГРАФИЯ

1. Определитель бактерий Берги : в 2 т / под ред. Дж. Хоут, Н. Крига [и др.] : перев. с англ. - М. : Мир, 1997. - Т. I. - 432 е.; Т. II. - 368 с.

2. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии / T.C. Костенко, Е.И. Скаршевская, С.С. Гительсон. -М.: Агроиромиздат, 1989. -С. 88.

3. Пат. 2520327 Российская Федерация, МПК С12М 1/26, C12Q 1/24. Бактериологическая петля : изобретение / Сахно Н.В., Михеева Е.А., Ватников Ю.А. [и др.] ; заявитель и патентообладатель ФГБОУ ВПО Орел ГАУ. — № 2013111063/10; заявл. 12.03.2013; опубл. 20.06.2014. Бюл. № 17. — 8 с.

4. Пат. 219092 Российская Федерация, МПК С12М1 /22. Чашка Петри с миллиметровой линейкой / Сахно Н. В., Скребнев С. А., Шадская А. В. [и др.]; заявитель и патентообладатель ФГБОУ ВО "Орловский государственный аграрный университет им. Н.В. Парахина". - № 2022117480; заявл. 27.06.2022; опубл. 28.06.2023, Бюл. № 19. -5 е.: ил.

5. Рабинович М.И. Несовместимость и побочное действие лекарств, применяемых в ветеринарии. — М.: КолосС, 2006. — 248 с.

6. Резистентность микроорганизмов к антимикробным препаратам и меры по ее сдерживанию: учебное пособие / Н. В. Сахно, С. А. Скребнев, А. В. Шадская, В. И. Савкин, И. Г. Паршутина, А. В. Амелина, Н. Л. Грибанова, А. И. Солодовник. Орловский ГАУ. -Орел, 2022. -125 с.

7. Руководство по микробиологии и иммунологии / Н.М. Колычев, В.Н. Кисленко, Р.Г. Госманов [и др.]; гл. ред. В.Н. Кисленко. - Новосибирск; Арта, 2010. - 256с.

8. Наклейки для чашек Петри PetriStickers, сетка, 50 квадратов, 36 шт - купить в разделе подсчет колоний интернет-магазина Стайлаб (stylab-shop.com) [Электронный ресурс] https://clck.ru/3CukM6 (дата обращения 29.04.2024).

9. Чашки Петри стерильные, диам. 55 мм, контактная, с сетчетой сеткой, 10 шт/уп - купить в Орле | Интернет-магазин (5drops.ru) [Электронный ресурс] https://clck.ru/3CukQj_(qaTa обращения 29.04.2024).

REFERENCES

1. Opredelitel bakteriy Bergi : v 2 t / pod red. Dzh. Khout, N. Kriga [i dr.] : perev. s angl. - M. : Mir, 1997.

- T. I. - 432 s.; T. II. - 368 s.

2. Praktikum po veterinarnoy mikrobiologii i immunologii / T.S. Kostenko, Ye.I. Skarshevskaya, S.S. Gitelson. -M.: Agroiromizdat, 1989. -S. 88.

3. Pat. 2520327 Rossiyskaya Federatsiya, MPK S12M 1/26, C12Q 1/24. Bakteriologicheskaya petlya : izobretenie / Sakhno N.V., Mikheeva Ye.A., Vatnikov Yu.A. [i dr.] ; zayavitel i patentoobladatel FGBOU VPO Orel GAU. — № 2013111063/10; zayavl. 12.03.2013; opubl. 20.06.2014. Byul. № 17.

— 8 s.

4. Pat. 219092 Rossiyskaya Federatsiya, MPK S12M1 /22. Chashka Petri s millimetrovoy lineykoy / Sakhno N. V., Skrebnev S. A., Shadskaya A. V. [i dr.]; zayavitel i patentoobladatel FGBOU VO

"Orlovskiy gosudarstvennyy agrarnyy universitet im. N.V. Parakhina". - № 2022117480; zayavl. 27.06.2022; opubl. 28.06.2023, Byul. № 19. -5 s.: il.

5. Rabinovich M.I. Nesovmestimost i pobochnoe deystvie lekarstv, primenyaemykh v veterinarii. — M.: KolosS, 2006. — 248 s.

6. Rezistentnost mikroorganizmov k antimikrobnym preparatam i mery po ee sderzhivaniyu: uchebnoe posobie / N. V. Sakhno, S. A. Skrebnev, A. V. Shadskaya, V. I. Savkin, I. G. Parshutina, A. V. Amelina, N. L. Gribanova, A. I. Solodovnik. Orlovskiy GAU. -Orel, 2022. -125 s.

7. Rukovodstvo po mikrobiologii i immunologii / N.M. Kolychev, V.N. Kislenko, R.G. Gosmanov [i dr.]; gl. red. V.N. Kislenko. - Novosibirsk; Arta, 2010. - 256s.

8. Nakleyki dlya chashek Petri PetriStickers, setka, 50 kvadratov, 36 sht - kupit v razdele podschet koloniy internet-magazina Staylab (stylab-shop.com) [Elektronnyy resurs] https://clck.ru/3CukM6 (data obrashcheniya 29.04.2024).

9. Chashki Petri sterilnye, diam. 55 mm, kontaktnaya, s setchetoy setkoy, 10 sht/up - kupit v Orle | Internet-magazin (5drops.ru) [Elektronnyy resurs] https://clck.ru/3CukQj (data obrashcheniya 29.04.2024).