CC BY
64
DOI: 10.24411/2074-5036-2019-10007 УДК 57: 579.2
Ключевые слова: бактерии, штамм, бактериофаги, контаминация, морфология, культуральные свойства Key words: bacteria, strain, bacteriophages, contamination, morphology, cultural properties
Пульчеровская Л. П., Садртдинова Г. Р., Сверкалова Д. Г.
ИЗУЧЕНИЕ ПОВРЕЖДАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ БАКТЕРИОФАГА В ОТНОШЕНИИ
БАКТЕРИЙ РОДА SERRATIA
BACTERIOPHAGE'S DAMAGING ACTION RESEARCH TO BACTERIA SERRATIA GENUS
ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный агарный университет им. П.А. Столыпина», кафедра микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Адрес: 432017, Россия, г. Ульяновск, б. Новый Венец, д. 1. Тел. +7 (8422) 55-95-47. E-mail: [email protected]
Ulyanovsk State Agrarian University named after P.A. Stolypin, Department of Microbiology, Virology, Epizootology and Veterinary-Sanitary Examination, Federal State Budget Educational Institution of Higher Education Address: 432017, Russia, Ulyanovsk, Noviy Venetz blvd, 1. Tel. +7 (8422) 55-95-47. E-mail: [email protected]
Пульчеровская Лидия Петровна, к. б. н., доцент Pulcherovskaya Lydia P., PhD of Biology Science, Associate Professor Садртдинова Гузелия Рафиковна, к. б. н., ассистент Sadrtdinova Guzelia R., PhD of Biology Science, Assistant Сверкалова Дарья Геннадьевна, к. б. н., старший преподаватель Sverkalova Darya G., PhD of Biology Science, Senior Lecturer
Аннотация. В статье представлены результаты исследований, связанных с оценкой действия бактериофага как повреждающего фактора на бактерии рода Serratia и изучением его влияния на изменение биологических свойств данного микроорганизма. В работе использовали воду, искусственно контаминированную бактериями изучаемого рода. В опытную колбу вносили бактериофаг, строго специфичный в отношении бактерий рода Serratia. Обе колбы (контрольную без бактериофага и опытную с бактериофагом) культивировали при одинаковых временных (21 день) и тепловых параметрах (30 °С). Степень влияния бактериофага на микроорганизм оценивали при изучении морфологии бактериальных клеток, культуральных свойств, биохимических свойств, устойчивости к антибиотикам. Концентрация бактерий в опытной колбе снизилась с 8,9Х10 м.к./мл до 3,0х10м.к./мл. В контрольной колбе рост изучаемого микроорганизма наблюдался спустя 7 дней. Было установлено, что под действием бактериофага биологические свойства бактерий рода Serratia изменяются. В мазках из опытной колбы фиксировали изменение величины и характера расположения бактериальных клеток - скучивание клеток, как при агрегации микроорганизмов. При изучении культуральных свойств отмечено возникновение процесса диссоциации у культуры из опытной колбы, пигментообразование не было ярко выражено и наблюдалось только в центре колоний. Биохимические свойства культуры под действием бактериофага усиливались, а резистентность к антибиотикам снижалась. Summary. Results of the research related with the evaluation of bacteriophage's damaging action to bacteria of the genus Serratia and with this microorganism's biological properties changing under the bacteriophage are presented in this article. Water was used in the work, it was artificially contaminated with bacteria of the researched genus. The bacteriophage, strictly specific for bacteria of the genus Serratia, was introduced into the test flask. Both flasks (control without the bacteriophage and tested with the bacteriophage) were cultured at the same time (21 days) and thermal parameters (30 °C). The degree of influence of the bacteriophage on the microorganism was evaluated in the researches of bacterial cell's morphology, cultural properties, biochemical properties, resistance to antibiotics. Bacteria concentration in test flask decreased from 8,9X10 microbial cells/ml to 3,0X10 microbial cells/ml. Researched microorganism's growth was observed in the control flask after 7 days. It was found that biological properties of bacteria of the genus Serratia is changed under bacteriophage's action. Change of bacterial cell's magnitude and nature of it's location - cell congestion as in the aggregation of microorganisms was recorded in smears from the test flask. Culture dissotiation in the test flask was noted when cultural properties were researched, the pigment formation was not pronounced and was observed only in the center of the colonies. Biochemical properties of culture under the influence of bacteriophage were enforced, and the resistance to antibiotics was reduced.
Введение ятельности человека и животных и являются
Бактерии рода Enterobacteriaceae широко представителями естественной микрофло-
распространены в окружающей среде, по- ры кишечника. Бактерии обладают высокой
падают в нее вместе с продуктами жизнеде- адаптационной устойчивостью, являясь ча-
12 Актуальные вопросы ветеринарной биологии № 1 (41), 2019
стыми контаминантами воды открытых водоемов, почвы, продуктов питания. Их обнаружение во внешней среде, как правило, используют в качестве индикатора фекального загрязнения и санитарного состояния объекта [6].
Бактерии рода Serratia обнаруживаются в воде, почве, пищевых продуктах, а также в последние полтора-два десятилетия с возрастающей частотой и в различном клиническом материале от больных и здоровых людей, рыб, птиц, рептилий, от различных домашних и диких млекопитающих [1]. Одной из причин такого повсеместного распространения является устойчивость патогена к широкому спектру антибиотиков. В 1981-1986 гг. Y. Kawakami с соавт. изучали чувствительность к антибиотикам и наличие R-плазмиды у штаммов S. marcescens. Было установлено, что 92 % всех изученных штаммов проявляют устойчивость к большому числу антибиотиков. Одним из механизмов резистентности к антибиотикам и другим антибактериальным препаратам у микроорганизмов является активный вывод этих соединений из клетки с помощью эффлюкс-систем.
Бактериофаги являются специфичными вирусами, избирательно поражающими бактериальные клетки. Преимущества фагов делает их использование в животноводстве, растениеводстве и медицине потенциально перспективным [2, 4]. Так, специфичность фагов предотвращает появление фагоустойчивых штаммов бактерий, когда как широкое и частое использование антибиотиков вызывает появление и распространение устойчивости у патогенов. В отличие от антибиотиков, фаговые препараты в ответ на изменения в популяции патогенных бактерий и их чувствительности могут быть быстро модифицированы.
К особенностям биологических свойств бактериофагов можно отнести и их высокую устойчивость к воздействию внешних факторов (физических и химических). Бактериофаги обычно устойчивы в пределах рН от 5,0 до 8,0, а при низких температурах - от 4,0 до 10,0, проявляют устойчивость в отношении хлороформа [3, 5].
Использование фагов для снижения концентрации патогенных микроорганизмов приобретает все большее внимание исследователей. Например, фаги используют для обработки пищевых продуктов при контаминации E. coli, Enterobacter, Listeria, Salmonella, Staphylococcus, и количество этих патогенов было успешно уменьшено. В США при производстве пищевых продуктов и медикаментов разрешено использовать специфический фаг Listeria - Listex Р100 - с целью консервации еды [8].
Во многих других исследованиях было установлено, что использование бактериофагов при индикации и дифференциации бактерий является эффективным [6, 7]. В последнее же время результаты многих исследований приводят данные о возможности использования бактериофагов в качестве дезинфицирующего средства биологической природы [9].
Цель проведенного исследования заключалась в оценке воздействия бактериофага как повреждающего фактора на изменение биологических свойств бактерий рода Serratia.
Материалы и методы
В работе использовали пробы водопроводной воды, искусственно контаминиро-ванные бульонной культурой бактерий вида Serratia marcescens АТСС 13800. В качестве фактора воздействия использовали бактериофаг SM-1, выделенный авторским коллективом из окружающей среды и являющийся строго специфичным в отношении бактерий изучаемого вида.
Исследования состояли из двух этапов.
1. В первой серии опытов определяли количество микробных клеток в суточной культуре бактерий, использованных нами для постановки экспериментов. Определяли литическую активность использованных бактериофагов перед внесением в исследуемый объект.
2. Во второй серии опытов определяли возможность использования специфического бактериофага для улучшения санитарного состояния воды.
Протокол исследования представлен ниже.
13
В две колбы со стерильной водопроводной водой (по 100 мл) вносили по 10 мл суточной бульонной культуры изучаемого штамма. В первую колбу (опытная колба) в объеме 2 мл вносили дополнительно фаг SM-1, активный в отношении бактерий рода Serratia. Во вторую колбу бактериофаг не вносили (контрольная колба).
Опытную и контрольную колбы помещали в термостат при температуре 30 °С на 21 день. Через 3 недели содержимое опытной и контрольной колб исследовали (методом серийных разведений) на наличие бактерий рода Serratia, производили их количественный учет и фиксировали (при наличии) изменения биологических свойств.
Результаты исследований
Исходная рабочая культура содержала бактерий S. marcescens АТСС 13800 8,9x10 м.к./мл.
Опытная колба содержала водопроводную воду в объеме 100 мл, контаминирован-ную бактериями S. marcescens АТСС 13800 (3,0х10м.к./мл) и специфический бактериофаг (4,0x10 БОЕ/мл).
Контрольная колба содержала водопроводную воду в объеме 100 мл, контамини-рованную бактериями S. marcescens АТСС 13800 (3,0х10м.к./мл) без бактериофага.
Через 3 недели:
- опытная колба содержала бактерии S. marcescens АТСС 13800 1х10м.к./мл, бактериофага - 7х10Б0Е/мл.
- контрольная колба содержала бактерии S. marcescens АТСС 13800 2,1x10. В результате отсутствия необходимых питательных веществ рост бактерий изучаемого вида наблюдался только спустя 7 дней.
После 3-х недель совместного культивирования бактерий и специфического бактериофага из опытной колбы были отвиты бактерии рода Serratia для дальнейшего анализа их биологических свойств и оценки степени их изменения. В качестве контроля микроорганизм был отвит из контрольной колбы (без бактериофага).
Были изучены: морфология микробных клеток, культуральные свойства, биохимические свойства, чувствительность к антибиотикам.
1. Морфологию микробных клеток изучали при окраске мазков методом Грама. Установлено, что морфология микробных клеток после совместного культивирования бактерий и специфических бактериофагов изменилась (рис. 1).
2. Культуральные свойства изучали при росте микроорганизмов на мясопептон-ном бульоне (МПБ) и мясопептонном агаре (МПА).
На МПБ фиксировали равномерное помутнение по всему объему пробирки, изменений в опытной и контрольной пробе отмечено не было. На МПА было отмечено (рис. 2): в опытной пробе фиксировали колонии с неровными звездчатыми краями, плоской формы, блестящие, диаметром до 4 мм, по всей чашке присутствовал феномен роения, а пигментообразование наблюдалось только в центральной части колонии; контроле - колонии округлые, с ровными краями, гладкие, блестящие и равномерно окрашенные в ярко красный цвет.
3. Биохимическая активность бактерий рода Serratia обусловлена их ферментативной активностью. Биохимические свойства изучали на средах Гиса: с глюкозой, лактозой, маннозой, маннитом, мальтозой, сорбитом, ксилозой, рамнозой (рис. 3).
У культуры из опытной пробы отмечено интенсивное пигментообразование на сорбите и замедленное образование кислых продуктов - положительный результат. У культуры из контрольной пробы - результат отрицательный. Аналогичный результат наблюдался и на средах Гиса с маннитом и маннозой.
4. Изучение чувствительности микроорганизма к антибиотикам основывалось на использовании диско-диффузионного метода. Для приготовления исследуемой суспензии использовали суточные культуры штамма S. marcescens АТСС 13800, выделенные из контрольной колбы (без контакта со специфическим бактериофагом) и опытной колбы. Плотность инокулюма была эквивалентна стандарту мутности 0,5 по McFarland, что примерно составляет 1,5x10 КОЕ/мл.
Не позднее, чем через 15 мин после инокуляции на поверхность питательной среды
14
наносили диски с АБП. Аппликацию дисков проводили с помощью стерильного пинцета. Расстояние от диска до края чашки и между дисками было (15-20) мм. Таким образом, на одну чашку диаметром 100 мм помещали не более 6-ти дисков. Диски равномерно контактировали с поверхностью агара, для чего их аккуратно прижимали пинцетом.
Непосредственно после аппликации дисков чашки Петри помещали в термостат кверху дном и инкубировали при температуре 35 °С в течение (18-24) ч. Диффузия антибиотика в агар приводит к формированию зоны подавления роста микроорганизмов вокруг дисков.
При измерении зон задержки роста ориентировались на зону полного подавления видимого роста. Не обращали внимания на очень мелкие колонии, выявляемые в пределах зоны задержки роста только при особых условиях освещения или увеличении, и едва заметный налет у края зоны. Результат учитывали по величине диаметра зоны подавления роста вокруг диска, измеренной в миллиметрах (рис. 4, табл. 1).
Из таблицы 1 видно, что чувствительность к антибиотикам у изучаемого штамма в присутствии специфического фага повышается. Так, задержка роста в сегменте «цефтриак-сон» увеличилась с 18-ти мм до 26-ти мм; в сегменте «канамицин» - с 15-ти мм до 24-х мм; в сегментах «ампицилин», «оксацил-лин», «цефазолин», «рифампицин» наблюдалось снижение резистентности - так, штамм из контрольной пробы отличался устойчивостью к данным антибиотикам, а штамм из опытной колбы характеризовался форми-
R
А
Рис. 1. Морфология бактериальных клеток Б. тагсвБсвт АТСС 13800: А) контрольная проба; Б) опытная проба. Было отмечено увеличение размера клеток и характер их расположения - скучивание, как при образовании бактериями биопленки. В мазках из контрольной пробы клетки располагались одиночно в хаотичном положении.
Рис. 2. Морфология бактериальных колоний Б. шагсвзсвт АТСС 13800: А) контрольная проба; Б) опытная проба.
Рис. 3. Ферментация сорбита культурой Б. тагсвБсвт АТСС 13800: 1) культура из контрольной пробы; 2) «незасеянная» среда; 3) культура из опытной пробы.
Рис. 4. Изучение резистентности бактерий рода Serratia к антибиотикам: А) из контрольной колбы; Б) из опытной колбы.
15
Таблица 1
Изучение антибиотикочувствительности бактерий рода Serratia
№ Антибиотик Характеристика зон задержки роста
п/п культура из контрольной колбы культура из опытной колбы
1 Оксациллин отсутствие зон с задержкой роста слабый контур, диаметр 16 мм
2 Цефазолин отсутствие зон с задержкой роста слабый контур, диаметр 15 мм
3 Амоксициллин четкий контур, диаметр 7 мм слабый контур, диаметр 17 мм
4 Цефтриаксон четкий контур, диаметр 18 мм четкий контур, диаметр 26 мм
5 Канамицин четкий контур, диаметр 15 мм четкий контур, диаметр 24 мм
6 Ампициллин отсутствие зон с задержкой роста четкий контур, диаметр 6 мм
7 Ципрофлоксацин четкий контур, диаметр 15 мм; общий контур - 30 мм, неполный лизис слабый контур, диаметр 34 мм; четкий контур 25 мм
8 Офлаксацин четкий контур, диаметр 21 мм четкий контур, диаметр 28 мм
9 Неомицин четкий контур, диаметр 17 мм четкий контур, диаметр 24 мм
10 Рифампицин отсутствие зон с задержкой роста слабый контур, диаметр 6 мм
рованием зон задержки роста - 16 мм, 15 мм, 6 мм, 6 мм соответственно.
Заключение
В результате проведенных исследований установлено, что в условиях экспериментальной контаминации специфическим бактериофагом количество бактерий рода Serratia в воде снижается. Количество фага увеличилось по сравнению с изначальной концентрацией. Полученные данные позволяют заключить о губительном воздействии специфического бактериофага в отношении бактерии-хозяина, что проявляется изменением биологических свойств микроорганизма. Также в присутствии бактериофага снизилась резистентность патогена к антибиотикам, что говорит о снижении у него защитной функции и повышении чувствительности к химическим факторам. В данном случае бактериофаг выступает как повреждающий фактор. Изученный в данном исследовании феномен может быть использован в качестве механизма для комплексного метода эффективной борьбы с бактериальными инфекциями или дезинфекции поверхностей и уменьшением риска бактериальной резистентности.
Список литературы
1. Гайрабеков Р.Х., Турлова Ф.С. Некоторые факторы патогенности бактерий рода Serratia // Естественные и технические науки. 2011. № 4 (54). С. 163-169.
16
2. Золотухин С.Н. Малоизученные энтеробак-терии и их роль в патологии животных. Ульяновск. 2004. С. 64-75.
3. Катмакова Н.П., Золотухин С.Н., Васильев Д.А. Разработка оптимальных технологических параметров постановки РНФ с биопрепаратом YP - 09 УГСХА // Естественные и технические науки. 2009. № 6 (44). С. 202-204.
4. Ляшенко Е.А., Васильев Д.А., Золотухин С.Н. Индикация бактерий рода Klebsiella с помощью специфических бактериофагов в объектах ветеринарного надзора // В сб. «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности». Матер. Междунар. науч.-практ. конф. 2013. С. 36-40.
5. Пульчеровская Л.П. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Citrobacter и их применение в диагностике : авто-реф. дис. ... канд. биол. наук: 03.00.07, 03.00.23. Саратов, 2004. С. 88-89.
6. Садртдинова Г.Р. Sanitary assessment of environmental objects by isolation of virulent phages / Г.Р. Садртдинова, Л.П. Пульчеровская, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин// Russian journal of agricultural and socio-economic sciences. 2016. Т. 58. № 10. С. 165-170.
7. Садртдинова Г.Р. Биоиндикация бактерий вида Klebsiella oxytoca в объектах ветеринарно-санитар-ного надзора // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. 2017. Т. 36. № 4. С. 8-12.
8. Chen L.-K. Potential of bacteriophage ФАВ2 as an environmental biocontrol agent for the control of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii / L.-K. Chen, Y.-L. Liu, A. Hu [et al.] // BMC Microbiol. 2013. № 13. P. 154.
9. Shivaswamy V.C. Utility of Bacteriophage as a Bio-Disinfectant // Pure and Applied Microbiology. 2010. № 4 (2). P. 667-673.
