CC BY
30
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ IN VIVO... | 41
УДК 616-006-085.832.3:001.891.574
1 2 3 2 2
И.Г. Меерович , К.А. Волков , Г.А. Меерович , Е.А. Л^кьянец , В.М. Негримовский ,
В.Б. Лощеное , Н.А. Оборотова , А.Ю. Барышников
ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ IN VIVO
НОВОГО ИНФРАКРАСНОГО ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРА
ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ ОПУХОЛЕЙ
НА ОСНОВЕ МИЦЕЛЛЯРНОЙ ДИСПЕРСИИ
4,5-ОКТАКИС(ДЕЦИЛТИО)-3,6-ОКТАХЛОРФТАЛОЦИАНИНА ЦИНКА
1Creighton University, 2500 California Plaza, Omaha, NE 68178, USA 2ГНЦ «НИОПИК», Москва 3Институт общей физики РАН, Москва
4ФГБНУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» ФАНО, Москва Контактная информация
Меерович Геннадий Александрович, старший научный сотрудник ИОФ РАН адрес: 119991 Россия, Москва, ул. Вавилова, д. 38; тел. +7(495)798-93-00 e-mail: [email protected]
Статья поступила 03.09.2014, принята к печати 08.09.2014.
Резюме
Работа посвящена исследованию нового наноструктурированного фотосенсибилизатора 4,5-октакис(децилтио)-3,6-октахлорфталоцианина цинка в мицеллярной форме с максимумом оптического поглощения в области v 728 нм. Показано, что фотосенсибилизатор селективно накапливается в опухолях и обеспечивает после фотодинамической терапии достаточно эффективное (более 83%) торможение роста модельной опухоли.
Ключевые слова: фотодинамическая терапия, фотосенсибилизатор фталоцианин, полоксамер, мицел-лярная дисперсия, поглощение.
I.G. Meerovich1, K.G. Volkov2, G.A. Meerovich3, E.A. Lukyanets2, V.M. Negrimovsky2,
V.B. Loschenov , N.A. Oborotova4, A.Yu. Baryshnikov4
IN VIVO PRELIMINARY INVESTIGATION
OF NEAR-IR PHOTOSENSITIZER
FOR PHOTODYNAMIC THERAPY
OF TUMORS BASED ON MICELLAR DISPERSION
OF ZINC 4,5-OCTAKIS(DECYLTHIO)-3,6- OCTACHLOROPHTHALOCYANINE
1Creighton University, 2500 California Plz, Omaha, NE 68178, USA
2State Research Center «NIOPlK», Moscow
3A.M. Prokhorov General Physics Institute of RAS, Moscow
4FSBSI «N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center» FASO, Moscow
Abstract
The work is devoted to study of new nanostructural photosensitizer Octasens based on micellar form of Zinc 4,5-octakis(decylthio)-3,6-octachlorphthalocyanine with absorption maximum at 728 nm. Photosensitizer shows selective accumulation in tumors and provides efficient (more than 83%) inhibition of growth of model tumor.
Key words: photodynamic therapy, photosensitizer phthalocyanine, poloxamer, micellar dispersion, absorption.
Введение
Метод ФДТ опухолей широко исследуется в экспериментальной и клинической онкологии. При выборе ФС для ФДТ важную роль играют высокая фотодинамическая эффективность, оптимальный спектральный диапазон основной полосы поглощения, фотостабильность, безвредность и, естественно, технологичность и доступность в производстве. ФС, поглощающие в спектральном диапазоне 700850 нм, обеспечивают наибольшую глубину фотодинамического воздействия, поскольку собственное поглощение несенсибилизированной ткани в этом диапазоне минимально [2; 3; 5].
Дополнительным фактором, определяющим выбор подходящего спектрального диапазона для ФДТ, является доступность необходимых источников лазерного излучения в этой области (в частности, лазерных диодов).
Работа посвящена предварительным исследованиям in vivo нового ФС из класса алкилтиоза-мещенных фталоцианинов;
- 4,5-октакис(децилтио)-3,6-октахлорфталоцианина цинка (DecS)8Cl8PcZn [1].
Материалы и методы
Материалы
Работа проводилась с использованием фото-динамически активной субстанции (DecS)8Cl8PcZn, синтезированной в ГНЦ «НИОПИК» реакцией 4,5-бис(децилтио)-3,6-дихлорфталодинитрила с ацетатом цинка [1]. Структурная формула этой субстанции показана на рис. 1. Субстанция нерастворима в воде, но хорошо растворяется в хлороформе, образуя истинный раствор с характеристической полосой поглощения Qy около 728 нм. Для приготовления прототипа лекарственной формы использовались растворители и компоненты буфера аналити-
№ 3/том 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ IN VIVO...
ческой степени чистоты, дистиллированная и деио-низованная вода; неионогенный полоксамерный ПАВ Эмуксол-268 (НИОПИК, Москва), поликарбонатные мембранные пластины Pall (Pall Eurasia LLC, Москва, Россия) с размером пор 0,22 мкм.
C1oH
1oH21
SC1oH21
C1oH21S
C1oH21S
SC1oH21
SC1oH21
C1oH21S
SC1oH21
Рис. 1. Структурная формула [(DecS)8Cl8PcZn].
Оборудование
Система для стерилизующей фильтрации Millipore SWINNEX-25 (Millipore, США), прибор Submicron Particle Sizer NICOMP-CW380 для определения размера частиц с помощью динамического рассеяния света (Particle Sizing Systems, Santa Barbara, США), волоконный спектроанализатор ЛЭСА-01-Биоспек (Биоспек, Москва), полупроводниковый лазер ЛФД-730-Биоспек.
Получение и характеризация
мицеллярных дисперсий
Гидрофобная субстанция (DecS)8Cl8PcZn со-любилизировалась в форме дисперсии полимерных мицелл на основе Эмуксола-268. Для получения мицеллярной дисперсии хлороформный раствор (DecS)8Cl8PcZn добавлялся небольшими порциями в 4%-ный водный раствор Эмуксола-268, нагретый до 65-70 °C при постоянном активном перемешивании магнитной мешалкой и барботации азотом. Каждый раз хлороформу предыдущей порции давали полностью испариться до добавления следующей порции. После добавления последней порции дисперсию перемешивали дополнительно 5 минут для испарения остаточного хлороформа, охлаждали до комнатной температуры и подвергали стерильной фильтрации через систему Millipore SWINNEX-25, снабженную мембранами Pall с размером пор 0,22 мкм.
Для определения содержания (DecS)8Cl8PcZn в инъекционной лекарственной форме ФС 100 мкл аликвоты мицеллярной дисперсии экстрагировали 5 мл хлороформа; раствор высушивали дегидратированным кальция хлоридом, а фактическое включение фталоцианина определяли из оптического поглощения хлороформного раствора на длине волны 728 нм, исходя из значения молярного коэффициента экстинкции 1,9х105 mM-1 см .
Распределение мицелл по размерам оценивались при 10-кратном разбавлении водой методом динамического рассеяния света на приборе Submicron Particle Sizer NIC0MP-CW380. Необходимо отметить, что этот метод дает значения гидродинамического размера мицелл существенно больше,
чем реальный размер «плотного ядра», содержащего молекулы ФС [4; 6].
Было показано, что мицеллы характеризуются гидродинамическим размером 210-220 нм.
Исследования in vivo
Все исследования in vivo проводились на самках мышей-гибридов F1 (C57Bl/6*CBA) с ино-кулированной внутримышечно в бедро правой задней ноги опухолью Эрлиха (ELD) за 5 дней до введения ФС. Мицеллярная дисперсия ФС вводилась однократно струйно в хвостовую вену.
Динамика и селективность накопления ФС в опухоли по сравнению с нормальной тканью оценивались по спектрам поглощения методом спектроскопии диффузного рассеяния, используя волоконный спектроанализатор ЛЭСА-01-Биоспек [3]. Каждое исследование проводилось на группе из 3 мышей. Спектры поглощения в выбранные моменты времени для каждого животного регистрировались в нескольких (5-10) точках поверхности опухоли и контралате-ральной зоны левой лапы, затем усреднялись и обрабатывались с использованием программного обеспечения UnoMomento (Биоспек, Москва). Концентрации ФС в опухоли и нормальной ткани оценивали в динамике по «интегральному поглощению» (интегральной площади под спектральной кривой рабочей полосы поглощения ФС в выбранном спектральном диапазоне) в относительных единицах. Отношение интегрального поглощения ФС в опухоли и нормальной ткани использовалось в качестве индекса селективности накопления.
При фотодинамическом воздействии ФС вводился внутривенно однократно в дозе 2 мг/кг массы тела животного. Опухоль облучали через 4 часа после введения ФС излучением диодного лазера ЛФД-730-Биоспек (Биоспек, Москва) с длиной волны изучения 732 нм и плотностью мощности на опухоли 150 мВт/см2 в течение 20 мин. Эффективность ФДТ оценивали ТРО в леченых группах по отношению к контрольной. Показатель вычислялся по формуле:
ТРО
О) =
( Ve -Vr ),
Ve
100
где
VC - средний объем опухолей в контрольной группе (см3), вычисленный как произведение трех ортогональных размеров опухоли;
VT - средний объем опухолей в группе ФДТ (см3).
Группы для ФДТ состояли из 6 животных каждая, контрольные группы - из 10. Данные статистически обрабатывались и анализировались по критерию Фишера-Стьюдента; разница считалась существенной приp < 0,05.
Результаты и обсуждение
Изучение in vivo динамики и слелективности накопления фотосенсибилизатора
(DecS)8Cl8PcZn в биологической ткани не флуоресцирует, но обладает in vivo значительным поглощением (рис. 2) со спектральным максимумом около 725 - 730 нм (в спектральном диапазоне минимального собственного поглощения биологической ткани). Поэтому динамику и селективность его накопления в опухоли и нормальной ткани оценивали in vivo по интегральной интенсивности поглощения (рис. 3) в этой области [3].
№ 3/том 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
42
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ IN VIVO... 1 43
Длина волны, нм
Рис. 2. Спектры поглощения сенсибилизированной опухоли Эрлиха через различные интервалы времени после внутривенного введения мицеллярной дисперсии (Бес§)8С18Рс2п в дозе 3 мг/кг: 1 - 1 час; 2 - 4 часа; 3 - 24 часа; 4 - 48 часов; 5 - спектр поглощения несенсибилизированной опухоли.
ч
<и =
н
о «
=
Я о
3
о
4 -
о
н
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
Время после введения, 'часы
10
20
30
40
50
0
Рис. 3. Динамика интегральной интенсивности основной полосы поглощения (Бес8)8С18Рс2п в опухоли Эрлиха (1; 2; 3) и нормальной ткани (4; 5; 6) после внутривенного введения в дозе: 1, 4-1,5 мг/кг; 2, 5-3 мг/кг; 3,6-6 мг/кг.
7 -
6 -
5 -
=
3 4
С
>о ©
1 -
Рис. 4. Торможение роста ELD после ФДТ с мицеллярной дисперсией (DecS)8Cl8PcZn, введенным в/в в дозе 2 мг/кг (1) по сравнению с контрольной группой (2). Облучение осуществлялось через 4 ч после введения ФС в течение 20 мин лазерным излучением с v732 нм и плотностью мощности 150 мВт/см2.
Время после фотодинамического воздействия, дни
№ 3/том 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
3
2
0
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ IN VIVO...
На рис. 2 показаны изменения в спектрах поглощения сенсибилизированной опухоли после внутривенного введения мицеллярной дисперсии (Бес8)8С18Рс2п в дозе 3 мг/кг. Через короткое время после введения ФС в спектре поглощения сенсибилизированной опухоли появляется полоса в диапазоне длин волн 710-745 нм, соответствующая основной полосе поглощения (Бес8)8С18Рс2п. Примерно до 4 часов после введения для всех вводимых доз форма спектра поглощения в этой полосе меняется мало, а ее интенсивность растет. В дальнейшем при небольших дозах введения (1,5-2 мг/кг) интенсивность полосы начинает медленно спадать, форма спектра при этом заметных изменений не претерпевает.
В то же время при больших дозах введения, превышающих 3 мг/кг, интенсивность растет до 24 ч после введения дисперсии, хотя скорость роста заметно уменьшается, а в спектре поглощения появляется дополнительная широкая полоса в диапазоне 630-690 нм, предположительно связанная с агрегатами молекул (Бес8)8С18Рс2п.
Важно иметь в виду, что молекулы ФС в агрегированном состоянии фотодинамически неактивны, а минимизация вводимой дозы способствует снижению вероятности побочных эффектов.
Поэтому для изучения фотодинамической эффективности было принято решение вводить ФС в дозе 2 мг/кг, а облучение начинать через 4 ч после введения (в соответствии с приведенными на рис. 3 данными).
В нормальной ткани поглощение ФС существенно ниже, чем в опухоли, и монотонно снижается во времени.
Через 4 ч после введения поглощение (Эес8)8С18Рс2п в нормальной ткани примерно в 1,5 раза ниже, чем в первой точке наблюдения (1 час),
Литература
через 24 часа - в 2 раза ниже, а за 5 дней поглощение падает до уровня несенсибилизированной ткани. В интервале максимального накопления индекс селективности достигает значений 6-8.
Изучение эффективности ФДТ
мицеллярного ФС на модельной опухоли
Для проведения ФДТ мицеллярную дисперсию ФС вводили однократно струйно в дозе 2 мг/кг за 4 часа до начала облучения, чтобы, согласно полученным ранее данным, облучение осуществлялось при высоком содержании ФС в опухоли. Опухоль облучали излучением полупроводникового лазера ЛФД-730-Биоспек с плотностью мощности 150 мВт/см2 в течение 20 минут, достигая плотности энергии 180 Дж/см2. ФДТ привела к торможению роста карциномы Эрлиха (рис. 4), индекс ТРО достигал 83%. Высокое значение показателя ТРО наблюдалось более 3 недель.
Заключение
Предварительные результаты нашего исследования показывают, что (Бес8)8С18Рс2п в виде мицеллярной дисперсии селективно накапливается в опухоли, достаточно быстро выводится из нормальной ткани и позволяет достигать высокой эффективности ФДТ на модельных опухолях больших размеров.
Работа выполнена при финансовой поддержке ФАНО по проекту «Разработка и исследование механизмов действия наноструктурирован-ного фотосенсибилизатора ближнего инфракрасного диапазона для фотодинамической терапии опухолей» в рамках Программы Президиума РАН «Фундаментальные исследования для разработки биомедицинских технологий».
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Лукъянец Е.А., Меерович Г.А., Негримовский В.М. и др. Алкилтиозамещенные фталоцианины, их лекарственные формы и способ проведения фотодинамической терапии. Патент РФ № 2340615, опубл. 10.12.2008.
Huang N. Cheng G., Wang Y. et al. Influence of laser wavelength on the damage of comb's vasculature by photodynamic therapy-simulation and validation of mathematical models // Lasers Med Sci. - 2011. - 26(5). - P. 665-72.
Meerovich, I.G., Stratonnikov A., Ryabova A. et al. In vivo evaluation of accumulation of sensitizers for oncological diagnostics and therapy using the method of diffuse reflectance spectroscopy // Proc. SPIE. -2005. - 5973. - P. H1-H10.
Mel'nikov A.B. Fixation of micelle structure by monomer polymerization: Hydrodynamic properties of polymerized micelles // Colloid Journal. - 2010. - 72(4). - P. 512-6.
Straight, R.C. Application of charge-coupled device technology for measurement of laser light and fluorescence distribution in tumors for photodynamic therapy // Photochem Photobiol. - 1991. - 53(6). - P. 78796.
Zhao P., ZhengM., Yue C. et al. Improving drug accumulation and photothermal efficacy in tumor depending on size of ICG loaded lipid-polymer nanoparticles // Biomaterials. - 2014. - 32(23). - P. 6037-46.
№ 3/tom 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
44
