CC BY
120
1 1
ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ 73
>- УДК 579.81:615.831.011:616-092.4/.9 I. G. Meerovich1, M. A. Grin2, G. A. Meerovich3, A. G. Tsyprovskiy2, O. A. Mass2, A. V. Zhurov2, S. V. Barkanova4, L. M. Borisova1, N. A. Oborotova1, V. B. Loschenov3, A. Yu. Baryshnikov1, A. F. Mironov2 NEW PHOTOSENSITIZERS OF NEAR-INFRARED RANGE BASED ON BACTERIOCHLORIN P : PRELIMINARY IN VIVO INVESTIGATION RESULTS 1N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow 2M. V. Lomonosov Moscow State Academy of Fine Chemical Technology, 3A. M. Prokhorov General Physics Institute RAS, Moscow 4State Research Center "NIOPIK", Moscow ABSTRACT The article presents the results of preliminary investigations of some derivatives of bacteriochlorin p as potential photosensitizers for photodynamic therapy. It is shown that these photosensitizers possess considerable absorption in the range of minimum intrinsic absorption of biological tissue, quickly clear from skin and show high photodynamic activity. Key words: photosensitizer, bacteriochlorin, absorption, fluorescence, photodynamic therapy. И. Г. Meepoвuч1, M. А. rpun2, Г. А. Meepoвuч3, А. Г. Цunpoвcкuй2, О. А. Macc2, А. B. Жуpoв2, С. B. Бapкaнoвa4, Л. M. Бopucoвa1, H. А. Oбopomoвa1, В. Б. Лoщeнoв2, А. Ю. Бapышнuкoв1, А. Ф. Mupoнoв2 НОВЫЕ ФOTOCEHCИБИЛИЗATOPЫ БЛИЖНЕГО ИHФPAKPACHOГO ДИАПАЗОНА НА ОСТОВЕ ^ОП^ОДНИХ БAKTEPИOXЛOPИHA P: ПPEДВAPИTEЛЬHЫE PEЗУЛЬTATЫ ИЗУЧЕНИЯ IN VIVO 1ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блoxuнa РАШ, Mocrna 2Mocкoвcкaя гocудapcmвeннaя акадшш moнкoй xuмuчecкoй mexнoлoгuu uм. M.B. Лoмoнocoвa 3^cmumym oбщeй фuзuкu uм. А.M. Пpoxopoвa РАН, Mocma 4ФГУП "Гocудapcmвeнный научный цeнmp "НИОПИК", Mocma РЕЗЮЫЕ Приведены результаты предварительных исследований некоторых производных бактериохлорина p в качестве потенциальных фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии. Показано, что эти фотосенсибилизаторы обладают интенсивным поглощением в области максимальной прозрачности биологической ткани, быстрым выведением из кожи и высокой фотодинамической активностью. Ключевые слова: фотосенсибилизатор, бактериохлорин, поглощение, флюоресценция, фотодинамическая терапия. ВВЕДЕНИЕ тосенсибилизатора в ткани, тем большей может быть Важнейшей характеристикой фотосенсибилизато- глубина фотодинамического воздействия. Наибольшую ров (ФС) наряду с высокой фотодинамической эффек- глубину могут обеспечить фотосенсибилизаторы с дли-тивностью и флюоресцентной способностью является ной волны спектрального максимума в диапазоне спектральный диапазон оптического поглощения. 720-850 нм [3], в котором собственное поглощение неПрежде всего, чем больше глубина проникновения сенсибилизированной ткани минимально. Этот же диа-в биологическую ткань света с длиной волны, соответ- пазон имеет преимущество при ФДТ пигментирован-ствующей спектральному максимуму поглощения фо- ных новообразований, в частности, меланомы. Немало- —(
№2/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
і 1
важно и то, что в этом диапазоне есть доступные и недорогие источники света, в первую очередь, полупроводниковые лазерные диоды.
Перспективным классом соединений для создания фотосенсибилизаторов ближнего инфракрасного диапазона являются производные бактериохлорофиллов [1-7].
Целью настоящей работы были предварительные исследования in vivo отечественных фотосенсибилизаторов на основе производных соединений бактерио-хлорина р, которые при исследованиях in vitro показали высокую фотодинамическую активность [4; 7].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе проводились исследования in vivo тринат-риевой соли бактериохлорина р (Bchlp), метилового эфира оксима N-метоксициклоимида бактериохлорина р (BchlpOx-OMe) и тринатриевой соли 3-деацетил-3-(а-гидроксиэтил)-бактериохлорина р (Bchlp-OH), структурные формулы которых представлены на рис. 1. Соединения были получены химической модификацией бактериохлорофилла а, выделенного экстракцией из пурпурных бактерий Rhodobacter capsulatus [1; 4].
При проведении ФДТ опухоли сенсибилизированных животных облучали оптическим излучением с плотностью мощности около 300 мВт/см2. Длина волны излучения соответствовала спектральному максимуму поглощения введенного ФС. Для облучения использовались лазеры ЛФД-01-730 с длиной волны 732 нм и ЛФД-01-800 с длиной волны 795 нм, а также ламповый источник света ЛИ-ФДТ-06 с перестраиваемым узкополосным фильтром (для облучения на длине волны 760 нм).
Эффективность фотодинамического воздействия оценивалась по торможению роста опухолей (ТРО, %) после ФДТ по отношению к контрольной группе животных по формуле:
тро (%) =&»-У°)
V К
100
Рис. 1. Структурные формулы фотосенсибилизаторов:
а — бактериохлорин р, тринатриевая соль;
б — метиловый эфир оксима N-метоксициклоимида бактериохлорина р;
в — 3-деацетил-3-(а-гидроксиэтил)бактериохлорин р, тринатриевая соль
Исследования проводились на мышах F1 с опухолью Эрлиха (ELD), перевитой внутримышечно в область голени. Все ФС вводились внутривенно однократно на 5-й день после перевивки, когда объем опухоли (вычисляемый как axbxc ,
2
где a, b, с — размер опухоли по 3 ортогональным измерениям) достигал 0,7-0,8 см3.
Bchlp и Bchlp-OH вводились в водном растворе в дозах 20 и 4 мг/кг веса тела соответственно. BchlpOx-OMe из-за его ограниченной растворимости в воде вводился в виде кремофорной дисперсии в дозе 1 мг/кг веса тела.
Уровень накопления ФС в опухоли и коже, а также селективность накопления ФС в опухоли по отношению к коже оценивали in vivo в динамике по интенсивностям поглощения и флюоресценции ФС в тканях, определяемым с помощью оптоволоконного спектроанализатора ЛЭСА-01-Биоспек («Биоспек», Москва) [8].
где Ук — средний объем опухоли в контрольной группе (см3);
Уо — средний объем опухоли в опытной группе (см3). о
Опытные группы формировали из 5-6, контрольную группу — из 8 мышей.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исследуемые ФС обладали значительным поглощением в спектральной области минимального собственного поглощения биоткани (рис. 2). Спектральные максимумы поглощения Bchlp, BchlpOx-OMe и Bchlp-OH имели длины волн соответственно 759; 795 и 735 нм.
Все изучавшиеся ФС флюоресцировали в растворах, однако при исследованиях in vivo только Bchlp в биологической ткани имел достаточно интен-
о.з
I 0.2
0.1
600 700 800 900
Длина волны, нм
Рис. 2. Спектры поглощения биологической ткани, сенсибилизированной:
А — тринатриевой солью бактериохлорина р (ВсЫр);
Б — метиловым эфиром оксима К-метоксициклои-мидом бактериохлорина р (ВсЫрОх-ОМе);
В — тринатриевой солью 3-деацетил-3-(а-гидроксиэтил)-бактериохлорина р, (ВсЫр-ОН).
Г — спектр собственного поглощения несенсибили-зированной опухоли
Длина волны, нм
Время, часы
Рис. 3. Спектры флюоресценции опухоли (1) и нормальной ткани (2), сенсибилизированных тринатриевой солью бактериохлорина р (БеЫр), введенной внутривенно в дозе 20 мг/кг за 20 мин до измерения
сивную полосу флюоресценции с максимумом около 7б2 нм (рис. 3).
Динамику и селективность накопления BchlpOx-OMe и Bchlp-OH оценивали по интенсивности иx поглощения в биологической ткани. Для Bchlp этот под-xод не давал достаточной точности из-за того, что спектр поглощения этого ФC накладывается на спектр поглощения деоксигемоглобина, интенсивность которого в опyxоляx достаточно велика из-за иx гипоксии (рис. 2, спектр Г, полоса 740-780 нм) и может меняться в процессе эксперимента. Поэтому динамику и селективность накопления Bchlp оценивали по интенсивности его флюоресценции.
Исследования показали, что в коже мышей содержание вcеx фотосенсибилизаторов быстро (менее, чем за 2 сут) спадает до предела обнаружения (рис. 4). В опyxоляx мышей высокое содержание Bchlp и BchlpOx-OMe наблюдается во временном интервале 10-80 мин после введения этик Ф^ а Bchlp-OH — в интервале 5-25 мин после его введения. Максимальное значение индекса селективности накопления Bchlp в опyxоли по сравнению с кожей во временном интервале, соответствующем его высокому содержанию в опyxоли, составляет 3-5. Для Bchlp-OH и BchlpOx-OMe значения этого параметра в соответ-cтвyющиx им временные интервалаx лежат в пределаx 1,2—1,б.
Облучение проводили в течение временныx интервалов, когда накопление ФC в опyxоли было близко к максимальному. Oпyxоли животныx, сенсибилизиро-ванныx Bchlp-OH, облучали во временном интервале 10-25 мин после введения этого Ф^ доза облучения составляла примерно 2б0 Дж/см2. При использовании Bchlp и BchlpOx-OMe облучение начинали через 10-30 мин после введения каждого из этиx ФC и проводили в течение 20 мин, доза облучения при этом составляла 3б0 Дж/см2.
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0.01 0.1 1 10 Время, часы
100
Время, часы
Рис. 4. Динамика накопления ФC в опyxоли (1) и коже (2) мыши при внутривенном введении изyчаемыx производныx бактериоxлорина p:
а — Bchlp в водном растворе в дозе 20 мг/кг; б — BchlpOx-OMe в кремофорной дисперсии в дозе 10 мг/кг;
в — Bchlp-OH в водном растворе в дозе 4 мг/кг
Облучение приводило к деоксигенации облучаемой зоны опyxоли и частичному фотобличингу фотосенсибилизаторов.
Tорможение роста опyxоли при ФДT с BchlpOx-OMe и Bchlp превышало 70 % и 80 % соответственно, при ФДT с Bchlp-OH достигало б0 % (рис. 5).
а
в
Время после ФДТ, дни
Е
и
(А
Ю
О
Время после ФДТ, дни
я
§
&
Е
и
<«
е
О
Время после ФДТ, дни
Рис. 5. Рост опухоли Эрлиха после ФДТ с различными фотосенсибилизаторами (1) по сравнению с контрольной группой (2):
а — БеЫр введен в виде водного раствора в дозе 20 мг/кг; облучение ламповым источником с максимумом на длине волны 760 нм и плотностью мощности 300 мВт/см2 в течение 20 мин;
б — БсЫрОх-ОМе введен в кремофорной дисперсии в дозе 1 мг/мл; облучение лазером с длиной волны 795 нм и плотностью мощности 300 мВт/см2 в течение 20 мин;
в — БсЫр-ОН введен в виде водного раствора в дозе 4 мг/мл; облучение лазером с длиной волны 732 нм и плотностью мощности 280-300 мВт/см2 в течение 15 мин
ВЫВОДЫ
Предварительные исследования показывают достаточно высокую фотодинамическую эффективность изучаемых соединений и потенциальную возможность их использования в качестве фотосенсибилизаторов для ФДТ.
Работа поддержана грантом президента Российской Федирации для молодых ученых — кандидатов наук МК-6258.2006.4
ЛИТЕРАТУРА
1. Миронов А. Ф., Грин М. А., Ципровский А. Г. и др. Разработка новых фотосенсибилизаторов бакте-риохлоринового ряда для фотодинамической терапии рака // Биоорганическая химия. — 2003. — T. 29, № 2.
— C. 214-221.
2. Henderson B. W., SumlinA. B., OwczarczakB. L., Dougherty T. J. Bacteriochlorophyll-a as photosensitizer for photodynamic treatment of transplantable murine tumors // J. Photochem. Photobiol., B.: Biol. — 1991. — Vol. 10, N. 6. — P. 303-312.
3. Meerovich I. G., Kubasova I. Yu., Oborotova N. A. et al. Fluorescent and photodynamic properties of infrared photosensitizer bacteriochlorophyllide-serine // Current Research on Laser Use in Oncology: 2000-2004. Proc. SPIE. — 2005. — Vol. 5973. — P. 59730G1-G11.
4. Mironov A. F., Grin M. A., Tsiprovskiy A. G. et al. New bacteriochlorin derivatives with a fused N-aminoimide ring // Journal of Porphyrins and Phthalocyanines. — 2003. — Vol. 7. — P. 725-730.
5. Pandey K., Shiau F.-Y., Daugherty T. J., Smith K. M. Synthesis of new Bacteriochlorins and their Antitumor Activity // Bioorg. Med. Chem. Lett. — 1994.
— Vol. 4, N. 10. — P. 1253-1257.
6. Rosenbach-Belkin V, Chen L., Feodor L. et al. Serine conjugates of chlorophyll and bacteriochlorophyll: photocytotoxicity in vitro and tissue distributuon in mice bearing melanoma tumors // Photochem. Photobiol. — 1996. — Vol. 64, N. 1. — P. 174-181.
7. Sharonov G. V, Karmakova T. A., Kassies R. et al. Cycloimide bacteriochlorin р derivatives: Photodynamic properties and cellular and tissue distribution // Free Radical Biology & Medicine. — 2006. — Vol. 40. — P. 407-419.
8. Stratonnikov A. A., Ermishova N. V., Meerovich G. A. et al. Simultaneous measurement of photosensitizer absorption and fluorescence in patients undergoing photodynamic therapy // Proc. SPIE. — 2002. — Vol. 4613. — P. 162-173.
Поступила 11.04.2006.
а
в
