CC BY
92
УДК 619:616.98:578.828.11
Практический опыт использования ПЦР-диагностики для оздоровления стада от лейкоза КРС
Л.И. Якушева, В.Ф. Сацук, Н.В. Ковалюк, Е.В. Мачульская, Т.П. Горбунова
nvk1972@yandex. ru Северо - Кавказский НИИ животноводства ООО «НП СХ предприятие «АСТЕР»
ОАО «Племзавод «Дружба», х. Бойко-Понура, Краснодарский край
Из многочисленных проблем в животноводстве существенное значение имеют хронические инфекционные болезни
сельскохозяйственных животных, в частности, лейкоз крупного рогатого скота [2].
Разработка методов эффективной ранней диагностики лейкоза является в настоящее время актуальной научно - практической задачей [1]
До использования ПЦР - диагностики специалистами хозяйства ОАО «Племзавод «Дружба» были учтены следующие требования, обязательные для ликвидации лейкоза:
1. Раздельное содержание РИД-позитивных и РИД-негативных животных.
2. Раздельные отёлы РИД-позитивных и РИД-негативных коров.
3. Выпойка телят молозивом и сквашенным муравьиной кислотой молоком только от РИД-негативных коров.
4. Раздельное содержание телят в клетках до месячного возраста.
5. Использование одноразового инструмента при ветеринарнозоотехнических манипуляциях.
Перечисленные выше мероприятия способствовали снижению уровня инфицированности взрослого поголовья, однако не позволили ликвидировать заболевание в хозяйстве.
Проведенный нами анализ схем перемещения животных и путей распространения инфекции позволил предположить, что наиболее уязвимым этапом содержания является период с первого по шестой месяцы жизни. В этот период телята от РИД-позитивных и РИД-негативных коров содержатся совместно группами по 5- 10 голов, а выделить среди них инфицированных метод РИД не позволяет, так как имеет возрастные ограничения для использования (возраст до шести месяцев).
Метод ПЦР, хотя и имеет ряд недостатков [3], незаменим для использования именно в этот период жизни животных.
Всего нами было проанализировано методом ПЦР в период с октября 2011 по март 2012 года 228 проб крови телят айрширской породы, принадлежащих ОАО «Племзавод «Дружба».
Для выделения ДНК из образцов цельной крови использовали наборы реагентов Diatom™ DNA Prep 100 ООО «Лаборатория Изоген», г. Москва. При проведении амплификации - наборы того же
производителя - GenPak DNA PCR test BLV (gag).
Для амплификации участка гена gag вируса применяли следующие температурные режимы*:
95 ° С - 3 мин.
95 ° С - 1 мин.
62 ° С - 40 сек. 1 цикл
74 ° С - 30 сек.
лейкоза КРС
9б ° С - 20 сек. б8 ° С - 20 сек. 74 ° С - 40 сек.
40 циклов
74 ° С - 1 мин.
1 цикл
* Режимы амплификации подобраны эмпирическим путем для ДНК-амплификатора МС-2 (производство «ДНК-Технология»). Варьировали температурой отжига праймеров. Наилучший температурный режим определяли по максимальному количеству выхода специфического фрагмента.
Гели окрашивали в растворе этидиум бромида (1 мкг/мл), отмывали дистиллированной водой и просматривали в ультрафиолетовых лучах, при этом краситель, интеркалирующий в молекулу, испускал излучение в красно-оранжевой области видимого спектра (590 нм). После просмотра гели фотографировали в ультрафиолетовых лучах с использованием цифрового фотоаппарата SONY DSC W15.
На рисунке1 представлена электрофореграмма продуктов амплификации участка гена gag провируса лейкоза КРС величиной 347 пар нуклеотидов.
1 -2 3 456 7 8 9 10 И 12 13 14 15 16." 17 18
РІ і -і м М м Н й І9
ї. -V
к т.,
Рис.1.Выявление провирусной ДНК лейкоза крупного рогатого скота методом ПЦР.
№13 и №15 - носители провируса лейкоза КРС
17 - отрицательный контроль
18 - положительный контроль амплификации
Анализ полученных результатов показал, что с использованием ПЦР удалось выявить 12 голов (или 5%) инфицированных телят. По результатам первого исследования (группа 50 голов, возраст 2 месяца и старше) выявили 4 вирусоносителя, причём оказалось, что вирусоносителями в равной мере были телята,
полученные и от РИД-позитивных и от РИД-негативных коров. Установлено, что эти вирусоносители контактировали друг с другом. Это ещё раз подтверждает возможность перезаражения телят при совместном содержании. Нами было принято решение проводить ПЦР-исследования у телят в возрасте 1 месяц, до объединения в группы.
При использовании этого подхода инфицированные телята от РИД - отрицательных коров больше не выявлялись.
Все ПЦР - положительные телята немедленно
изолировались из стада.
РИД-исследование группы телят, отрицательно прореагировавших в ПЦР (n=216) и достигших возраста 6 месяцев, дало отрицательный результат в 100% случаев.
Таким образом, в ОАО «Племзавод «Дружба» разработана эффективная схема оздоровления молодняка от лейкоза КРС.
Литература:
1. Макаров В.В., Гринишин Д.П. Эпизоотологические перспективы лейкоза
крупного рогатого скота. Вестник Российской академии
сельскохозяйственных наук. 2005, № 2, С. 70-73
2. Эрнст Л.К., Зиновьева Н.А. Биологические проблемы животноводства в XXI веке. М.: РАСХН. 2008, б08 с.
Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф., Марков А., Пищулина В. Система селекционно - диагностических мероприятий для эффективного оздоровления стад от лейкоза крупного рогатого скота // Молочное и мясное скотоводство.-2010. -№ б. - С.12-14
