CC BY
75
ВЕТЕРИНАРНЫЕ НАУКИ
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ПЦР В ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНОЙ
ЭКСПЕРТИЗЕ ЛЕЙКОЗА
12 3
Сафронова О.С. , Лыкасова И.А. , Иманбаев Т.К. Email: [email protected]
1Сафронова Ольга Станиславовна - магистрант; 2Лыкасова Ирина Александровна - доктор ветеринарных наук, кафедра ветеринарно-санитарной экспертизы, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение Южно-Уральский аграрный университет, г. Троицк;
3Иманбаев Толеген Касымханович - директор, Костанайский филиал Республиканскоегосударственное предприятие на праве хозяйственного ведения Республиканская ветеринарная лаборатория Комитет ветеринарного контроля и надзора Министерство сельского хозяйства Республики Казахстан, с. Заречное, Костанайский район, Республика Казахстан
Аннотация: в статье рассматриваются аспекты практического применения современных лабораторных методов при ветеринарно-санитарной экспертизе лейкоза крупного рогатого скота. Обоснована необходимости экспертизы нативного молока перед переработкой. Изложены результаты проведенных исследований по выявлению уровня распространенности лейкоза в Северном регионе Казахстана. Внутри групп инфицированность скота варьировала от 60 до 75 % - при диагностике методом РИД (реакции иммунодиффузии в агаровом геле) и от 56 до 85% - при ПЦР (метод полимеразной цепной реакции, анализ по гену -gag-). Особое внимание уделено его вирусогенетической характеристике. Методом ПЦР-ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов, анализ по гену -env) выявлено два подтипа - бельгийский и австралийский. По степени распространения бельгийский тип составляет 98%. При анализе проб сырого молока методом ПЦР (анализ гена -gag-) был выявлен провирус лейкоза в 53% образцах. Ключевые слова: метод ПЦР, метод ИФА, бычий лейкоз, BLV, молоко, вирус, праймер, ген, маркер.
USE OF METHOD PCR IN VETERINARY-SANITARY ANALYSIS ON A LEUKAEMIA (BLV)
1 2 3
Safronova O.S.1, Lykasova I.A.2, Imanbaev T.K.3
1Safronova Olga Stanislavovna - Postgraduate;
2Lykasova Irina Aleksandrovna - Doctor of veterinary Sciences, DEPARTMENT OF VETERINARY AND SANITARY EXAMINATION, FEDERAL STATE BUDGETARY EDUCATIONAL INSTITUTION SOUTH URAL AGRARIAN UNIVERSITY,
TROITSK;
3Imanbayev Tolegen Kasymkhanovich - Director, KOSTANAY BRANCH REPUBLICAN STATE ENTERPRISE ON THE RIGHT OF ECONOMIC MANAGEMENT REPUBLICAN VETERINARY LABORATORY COMMITTEE OF VETERINARY CONTROL AND SUPERVISION MINISTRY OF AGRICULTURE OF THE REPUBLIC OF KAZAKHSTAN, V. ZARECHNOYE, KOSTANAY DISTRICT, REPUBLIC OF KAZAKHSTAN
Abstract: the article deals with the aspects ofpractical application of modern laboratory methods in veterinary and sanitary examination of bovine leukemia. The necessity of examination of native milk before processing is proved. The results of studies to identify the prevalence of leukemia in the Northern region of Kazakhstan are presented. Within the groups, the infection rate of cattle varied from 60 to 75 % - in the diagnosis by RID (immunodiffusion reaction in agar gel) and from 56 to 85%, in PCR (polymerase chain reaction method, gene analysis-gag-). Special attention is paid to its viral genetic characteristics. By PCR-RFLP (polymorphism of the lengths of restriction fragments, analysis by gene -env-) identified two subtypes - the Belgian and the Australian. According to the degree of distribution of the Belgian type is 98%. In the analysis of samples of raw milk by PCR analysis (gene -gag-) were identified provirus leukemia in 53% of samples. Keywords: method PCR, enzyme-linked immunosorbent assay, leukemia, BLV, milk, sanitary examination, virus, primer, gene, marker.
УДК 619:616-006.446:636.2
Улучшение снабжения населения продуктами животноводства является одной из важных проблем агропромышленного комплекса страны. При этом без серьезного контроля безопасности и качества продовольственного сырья и пищевых продуктов, появляется угроза здоровью населения.
Важнейшим мероприятием в решении этого вопросов является научно обоснованная ветеринарно-санитарная оценка продуктов животноводства. Особого внимания заслуживает оценка продукции, полученной от животных, пораженных различными болезнями, в частности, таким распространённым заболеванием, как лейкоз крупного рогатого скота, имеющийся во многих странах мира [1].
Молоко коров, больных лейкозом, по физико-химическим показателям имеет более низкие качественные параметры по сравнению с молоком клинически здоровых животных. Отмечено снижение белка, жира, сухого вещества, молочного сахара, сухого обезжиренного молочного остатка и золы. Кисломолочные продукты и масло, изготовленные из молока лейкозных коров, имеют более низкие качественные параметры, как по органолептическим показателям, так и по химическому составу. Производство творога из молока BIV- и BIV-BLV-инфицированных коров экономически не обосновано, так как затраты времени на производство увеличиваются, а выход продукции несоразмерно снижается [2, 3].
Таким образом, продукция, полученная от скота, больного лейкозом, по технологическим параметрам фактически отличается от продукции здоровых животных в плане снижения классности, что, соответственно, ограничивает возможность его использования для получения высококачественных продуктов переработки. Кроме того, проводятся исследования, которые свидетельствуют о способности лейкоза крупного рогатого скота преодолевать межвидовые барьеры и опасности употребления нативного молока, обладающего инфекционными свойствами [4, 5, 6].
В настоящее время нет четкой системы выявления такого молока перед его переработкой. Методами ИФА можно достаточно эффективно провести индивидуальную диагностику на наличие антител в сыром молоке инфицированных животных (тест-системы BLV Milch-S (Institut Pourquier SAS), Leukosis Milk Screening (IDEXX Montpellier SAS), Ingezim BLV COMPAC 2.0 (INGENASA), Bovine leukemia virus antibody test kit (VMRD)) [7]. Но их применение на, так называемом «сборном» молоке, не всегда технически возможно, достоверно [8] и стандартизировано [9, 10].
Цель и методика исследований
Исследования выполнялись на базе Костанайского областного филиала РГП на ПХВ «Республиканская ветеринарная лаборатория» Комитета ветеринарного контроля и надзора МСХ РК и лаборатории молекулярной генетики ТОО «Казак тулпары» МСХ РК [11, 12, 13]. Объектом исследований являлись биообразцы (кровь и сыворотка - 208, молоко сырое -30)
Выявление у животных лейкоза методом РИД проводилось с использованием стандартной реакции иммунодиффузии (РИД) в агаровом геле с применением диагностикума «Набор препаратов для серологический диагностики лейкоза крупного
рогатого скота в реакции иммунодиффузии», производства НПЦ «ДиаВак-АБН» Республика Казахстан.
Для исследований методом ПЦР брались пробы крови животных в вакуумных пробирках с ЭДТА (К2Е, производитель Бельгия), образцы сыворотки РИД-серопозитивных/РИД-серонегивных животных и сырое сборное молоко. Постановку ПЦР проводили с использованием тест-систем «GenPak DNA PCR test BLV» для диагностики лейкоза крупного рогатого скота фирмы «ISOGENE» по гену gag. Экстракцию генетического материала, типирование env-гена вируса для определения подвидовой принадлежности с использованием метода гнездовой ПЦР (праймеры env5032 env5099 env5521 env5608) c последующим гидролизом 5U BgLL PvuII BamHI (производство «СибЭнзим») проводили по модифицированной методике, рекомендованной Beier et al 2001 наборами «GenPak PCR Core» [14]. Праймеры производства ООО «Синтол» (Москва)
Результаты исследований
В рамках исследований было проведено 208 анализов биобразцов на лейкоз крупного рогатого скота (ВЛКРС) методом РИД из трех регионов Северного Казахстана. Выявлено 143 головы скота, сыворотка которых проявила положительную реакцию на лейкоз. При этом в разрезе хозяйств инфицированность варьировала от 60 до 75 процентов (таблица 1). Методом ПЦР нами был обнаружен провирус лейкоза у 64% животных. Область гена, ограниченная специфичными праймерами, составила 346 п.н.
Таблица 1. Наличие провирусной ДНК (область гена gag BLV) среди исследованного по РИД скота
трех регионов области/трех хозяйств
Группы по регионам Кол-во голов РИД ПЦР
+ - + -
гол % гол % гол % гол %
1 66 49 75 17 25 56 85 10 15
2 60 46 77 14 23 30 50 30 50
3 80 48 60 32 40 54 67 26 33
206 143 69 65 31 140 68 62 32
Внутри массива, в зависимости от группы, количество выявленных положительных по ПЦР коров варьировало от 56 до 85%. В первой и третьей группе методом ПЦР было выявлено дополнительно 7 и 4 головы (на 10% и 7% соответственно) по сравнение с РИД. Однако, во второй группе метод РИД оказался результативным - на 16 голов большее инфицированных, чем ПЦР. Внутри массива, в зависимости от группы, количество выявленных положительных по ПЦР коров варьировало от 56 до 85%.
При выделении вируса из 30 проб молока (в том числе из 5 сборных проб), нами был выявлен провирус лейкоза в 16 случаях (53%).
Цг Х2~ Г.З 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 1.10
Рис. 1. Электрофореграмма продуктов ПЦР (провирусная ДНК, выделенная из молока), в 2,0% агарозном геле: К- отрицательный контроль, К+ положительный контроль, 1.1.-.1.6 «ПЦР-» пробы,
1.7-1.12 «ПЦР+» пробы
В целях определения подвидовой принадлежности изолятов ВЛКРС мы дополнительно исследовали env-ген длиной 444 п.н., полученный в результате модифицированной "nested" ПЦР с праймерами env 5032, env5099, env5521 и env5608. Последующий гидролиз проводился 5 ед. ферментов рестрикции Bgll, PvuII, BamHI производства «Сибэнзим», в соответствии с рекомендациями производителя. В результате можно определить бельгийский, японский и австралийский изоляты провирусной ДНК ВЛКРС. Для бельгийского подвида образуются следующие продукты рестрикции: BamHI рестрикции нет, Bgll 330 и 115 п.н., PvuII280 и 164 п.н. Для австралийского: BamHI 316 и 128 п.н. рестрикции нет, Bgll 330 и 115 п.н., PvuII нет. Для японского подвида: BamHI316 и 128 п.н, Bgll 330 и 115 п.н., PvuII нет.
В нашем регионе циркулируют два подтипа вируса лейкоза КРС - бельгийский и австралийский (рисунки 2,3). По степени распространения бельгийский тип составляет 98%. Оба вида могут приводить к гематологической стадии заболевания[15, 16, 17].
t ! 1k1 t I 1 № 1 I t 1 ^
1.1 1.2 1.3 1.4 М 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 1.10 К- 1.11 1.12
Рис. 2. Электрофореграмма продуктов env ПЦР-ПДРФ профилей изолятов в 2,0% агарозном геле после гидролиза с BgU: М - маркер ДНК, К- отрицательный контроль, 1.1.-1.12 изоляты(330/115 bp)
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 М 1.7 1.8 1.9 1.10 К- 1.11 1.12
Рис. 3. Электрофореграмма продуктов env ПЦР-ПДРФ профилей изолятов в 2,0% агарозном геле после гидролиза с ВатН1: М - маркер ДНК, - отрицательный контроль, 1.11 изолят (316/128 bp), у остальных рестрикции нет - участок 444 bp
Выводы и рекомендации
В северном регионе Казахстана значительный уровень присутствия вируса лейкоза крупного рогатого скота. Порядка 70% исследованного поголовья КРС молочного направления продуктивности инфицированы вирусом лейкоза. Внутри массива, в зависимости от группы и использованного метода, количество выявленных положительных коров варьировало от 56 до 85%. В двух группах методом ПЦР было выявлено больше на 10% и 7% в сравнении с РИД. В одной группе метод РИД оказался более эффективным. Вероятными причинами могут быть являться, как мутационные изменения в персистирующем вирусе, так влияние на вирус вакцинаций, противопаразитарных мероприятий, антибиотиков и других веществ [16]. В нашем случае, мы склоняемся к первой версии, так как данное хозяйство использует скот селекции «дальнего зарубежья». Исследования по env-гену (участок 444 п.н.) позволили визуализировать два подтипа вируса лейкоза КРС - бельгийский (98%) и австралийский (2%). Данные согласуются с результатами исследований Российских ученых по характеристике типов вируса лейкоза КРС, перстистирующих в популяция скота черно-пестрой породы региона Урала, которая инфицирована на 92,3% по международной классификации «бельгийской» подгруппой и, соответственно на 7,7% «австралийской» [16]. При анализе 30 проб сырого молока (в том числе из 5 сборных проб), нами был выявлен провирус лейкоза в 53%. Данный показатель выявляемости ниже, чем при анализе биообразцов крови, однако, учитывая, что пастеризация не влияет на выявление провирусной ДНК ВЛКРС-этого метод может использоваться в лабораториях при молочных перерабатывающих комплексах.
Список литературы /References
1. Альбикова Г.М. Лейкоз крупного рогатого скота в Пензенской области (распространение, морфологическое проявление, особенности ветеринарно-санитарной экспертизы продуктов убоя): Автореф. дисс... канд. вет. наук. М., 2001. 24 с.
2. Смирнова В.Н. Биологическая и санитарная характеристика молока при лейкозе крупного рогатого скота: Автореф. дисс... канд. биол. наук. Тверь., 1999. 26 с.
3. Красникова Е.С., Агольцов В.А., Красников А.В., Утанова Г.Х. Влияние ретровирусной инфекции коров на технологию и сроки хранения творога // Вестник Крас ГАУ. 2 0 17. № 12. С. 51-57.
4. Гулюкин М.И., Козырева Н.Г., Иванова Л.А., Степанова Т.В., Клименко А.И., Коваленко А.В., Дробин Ю.Д., Василенко В.Н. Межвидовая передача вируса лейкоза крупного рогатого скота в эксперименте // Вопросы вирусологии, 2015. № 5. [Электронный ресурс]. Режим доступа: https://cyberleninka.ru/article/n/mezhvidovaya-peredacha-virusa-leykoza-krupnogo-rogatogo-skota-v-eksperimente/ (дата обращения: 30.03.2019).
5. Гулюкин М.И., Козырева Н.Г., Иванова Л.А. Алиментарное заражение кроликов вирусом лейкоза крупного рогатого скота // Материалы международного агробиотехнологического симпозиума, посвященного 80-летию члена-корреспондента РАН, заслуженного деятеля науки РФ Сочнева В.В Н.Новгород, 2016. С. 19-25.
6. Степанова Т.В., Иванова Л.А., Гулюкин М.И., Козырева Н.Г., Стаффорд В.В. Модель для изучения инфекционного процесса, вызываемого вирусом лейкоза крупного рогатого скота // Аграрная наука. № 11-12. 2018. С. 21-23
7. Якупов П.Р. Возможности ИФА молока в диагностике лейкоза крупного рогатого скота/ Хазипов Н.З., Алимов А.М., Камалов Б.В.// Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана, 2010. Т. 201 С. 133-136.
8. Петренко А.С. Молоко как объект иммунологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота / Алексеева Г.Б., Прискока В.А., Головаха В.И., Корниенко Л.Н. // Ученые записки УО ВГАВМ,-2016. Т. 52, В. 3. С. 69-74.
9. Enzootic bovine leukosis / Manual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals. Terrestrial Manual 7th edition, 2012. P. 729-738.
10. Council Directive 88/406/EEC amending Directive 64/432/EEC on animal health problems affecting intracommunity trade in bovine and swine as regards enzootic bovine leukosis.
11.Давыдова А.Д., Петрова О.Г.Современные методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота // Молодежь и наука. № 3,2017. С. 14-17.
12. Глазунов Ю.В., Кабицкая Я.А., Плотников И.В. Сравнительна оценка прижизненной диагностики и эпизоотической обстановки по лейкозу крупного рогатого скота в Тюменской области //Вестник АПК Ставрополья. № 2 (26), 2017. С. 63-68.
13.Ланец О.В., Горковенко Н.Е. Сравнительная оценка эффективности методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота // Сборник статей по материалам 73 Научно-практической конференции студентов по итогам НИР за 2017 год. «Научное обеспечение агропромышленного комплекса». 25 апреля, 2018.. С.184-186.
14. Beier Dagmar, Blankenstein Petra, Marquardt O., Kuzmak J., 2001: Identification of different BLV provirus isolates by PCR, RFLPA and DNA sequencing. Berl. MUnch. TierSrzll. Wsclir. 114. 252-256, 2001.
15.Акимова А.С., Бетенева Н.В. Влияние структуры провируса BLV на гематологические показатели инфицированного крупного рогатого скота // Сборник конференции научного общества студентов и аспирантов БТФ. Новосибирский государственный аграрный университет.- ИЦ «Золотой колос», 2016. С.139-141.
16. Виноградова И.В., Гладырь Е.А., Ковалюк Н.В., Петропавловский М.В., Донник И.М., Эрнст Л.К., Зиновьева Н.А. Геногеографические исследования вируса лейкоза крупного рогатого скота //Достижения науки и техники АПК,2011. № 10. С. 34-37.
17. Пионтковский В.И., Руденко Е.О. Стратегия и тактика профилактики и мер борьбы с лейкозом//Мир инноваций. № 1,2017. С. 34-40.
